基于NELL2 Lumicrine信號(hào)通路探索引陽索膠囊對(duì)腎陽虛型精子損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

徐盼瑜，李佳珊，杜寒倩，李澤輝，李 源，林 娜，徐 穎*

基于NELL2 Lumicrine信號(hào)通路探索引陽索膠囊對(duì)腎陽虛型精子損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

徐盼瑜1, 2，李佳珊2，杜寒倩2，李澤輝2，李 源2，林 娜2，徐 穎1, 2*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所，上海 201203 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

研究引陽索膠囊對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠精子損傷的保護(hù)作用，并從睪丸神經(jīng)表皮樣生長因子2（neural EGFL like 2，NELL2）Lumicrine信號(hào)通路探索其作用機(jī)制。雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、引陽索（432 mg/kg）組和左卡尼?。?00 mg/kg）組，每組10只。連續(xù)ig腺嘌呤（200 mg/kg）14 d建立大鼠腎陽虛模型，并通過觀察大鼠腎陽虛證候表現(xiàn)、眼眶取血檢測血清中睪酮水平判斷造模是否成功；造模同時(shí)給予藥物干預(yù)49 d后取材，計(jì)算睪丸、附睪臟腦系數(shù)；計(jì)算機(jī)輔助精子分析（computer assisted sperm analysis，CASA）檢測附睪精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)；光鏡下進(jìn)行精子計(jì)數(shù)、精子畸形率檢測；精子熒光檢測精子活率；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察睪丸、附睪組織病理變化；ELISA法檢測血清中睪酮水平；免疫熒光法觀察睪丸NELL2分泌及附睪c-ros癌基因1（ROS proto-oncogene 1，ROS1）表達(dá)；Western blotting檢測附睪蛋白酶卵磷脂酶2（ovochymase 2，OVCH2）和精子去整合素金屬蛋白酶3（a disintegrin and metalloproteinase 3，ADAM3）表達(dá)。與模型組比較，引陽索膠囊可改善腎陽虛大鼠毛發(fā)粗糙脫落、精神不振、蜷縮拱背、尿量增多、體質(zhì)量降低等腎陽虛證候表現(xiàn)，升高睪丸、附睪臟腦系數(shù)（＜0.01）；顯著提高精子數(shù)量、精子活率、各精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)（＜0.05、0.01、0.001），降低精子畸形率，降低曲細(xì)精管病變率（＜0.001），升高14、49 d血清中睪酮水平（＜0.01、0.001）；顯著升高睪丸NELL2及附睪ROS1、OVCH2、ADAM3蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001）。引陽索膠囊對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠精子損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)NELL2 Lumicrine信號(hào)通路參與精子發(fā)生成熟過程有關(guān)。

引陽索膠囊；神經(jīng)表皮樣生長因子2；Lumicrine；腎陽虛；精子損傷

我國2021年人口出生率降至0.752%[1]，出生人口少于死亡人口，進(jìn)入人口負(fù)增長時(shí)代，男性不育癥的發(fā)病率正逐年上升，已成為影響我國國計(jì)民生、社會(huì)和諧的重大問題。其中少弱精癥是男性不育的核心病癥，目前尚無特效治療方案，臨床上多以性激素類藥物作為內(nèi)分泌治療或口服左卡尼汀為主，但有出現(xiàn)性欲減退、肝功能損害等不良反應(yīng)的報(bào)道[2-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精，主生殖”，少弱精癥在中醫(yī)學(xué)上屬“精少”“精寒”“精薄”“精冷”的范疇[4]，目前對(duì)少弱精癥病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)復(fù)雜，主要包括腎精虛衰[5]、肝郁氣滯[6]、電磁輻射、微生物的感染等“毒、蟲”因素、慢性前列腺炎、精索靜脈曲張等“濕熱瘀”范圍的疾病因素等[7]。病位在腎精，臨床治療大多在“補(bǔ)腎”基礎(chǔ)上進(jìn)行辨證論治，包括腎陽虛衰、腎陰不足、腎精虧損等[8]。引陽索膠囊由淫羊藿浸膏、五味子浸膏組成，臨床上用于治療陽痿早泄、腰膝酸軟、津虧自汗、頭暈?zāi)垦9]。目前針對(duì)引陽索膠囊的研究僅集中在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[10]及臨床早泄聯(lián)合治療[11]上，并未有其對(duì)少弱精癥的藥效及機(jī)制研究。

2020年日本學(xué)者Kiyozumi等[12]在發(fā)表的研究論文證明睪丸生殖細(xì)胞會(huì)分泌一種精子成熟因子（Lumicrine）——睪丸神經(jīng)表皮樣生長因子2（neural EGFL like 2，NELL2）與附睪上的c-ros癌基因1（ROS proto-oncogene 1，ROS1）特異性結(jié)合，幫助附睪分化成熟；隨后附睪分泌蛋白酶卵磷脂酶2（ovochymase 2，OVCH2），作用于精子去整合素金屬蛋白酶3（a disintegrin and metalloproteinase 3，ADAM3），使其加工成熟，精子才具有正常受精的能力。這項(xiàng)研究確定了睪丸-附睪-精子成熟（NELL2-ROS1-OVCH2-ADAM3）Lumicrine信號(hào)傳遞是男性生育所必需的精子發(fā)育系統(tǒng)，澳大利亞學(xué)者也在撰文評(píng)點(diǎn)Lumicrine精子成熟系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)有望解決男性不育問題[13]。因此本研究以腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠精子損傷模型為載體，通過對(duì)Lumicrine信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)的驗(yàn)證，探討具有精子保護(hù)潛力的中成藥引陽索膠囊對(duì)精子數(shù)量及質(zhì)量的影響，并明確其作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)引陽索膠囊新適應(yīng)證，提高其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，9周齡，體質(zhì)量330～340 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫恒濕，自然晝夜節(jié)律光照，自由活動(dòng)、飲水、進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查（批準(zhǔn)號(hào)2021B166）。

1.2 藥品與試劑

腺嘌呤（批號(hào)S18009）購自上海源葉生物科技有限公司；引陽索膠囊（批號(hào)9694）購自四川通園制藥集團(tuán)有限公司；左卡尼汀口服液（批號(hào)210372）購自沈陽第一制藥有限公司；精子活/死細(xì)胞染色試劑盒（批號(hào)HR0444）購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠睪酮ELISA試劑盒（批號(hào)E-EL-0155c、ml059506）分別購自Elabscience、上海酶聯(lián)科技生物有限公司；NELL2抗體、OVCH2抗體、ROS1抗體（批號(hào)分別為YT7088、YN3162、YN0013）購自美國ImmunoWay公司；ADAM3抗體（批號(hào)sc365288）購自美國Santa Cruz公司；GAPDH抗體（批號(hào)PA1-987）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Dylight 594標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號(hào)E032410）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗（批號(hào)分別為E030120、E030110）購自美國Earthox公司；含DAPI抗熒光淬滅封片劑（批號(hào)P0131）購自碧云天生物技術(shù)。

1.3 儀器

BSA224S型天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BX60型正置顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-S4A型水浴鍋（科偉）；EOS計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀（北京穗加軟件公司）；FV1000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；Power Pac Basic型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；TS-1型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；渦旋混合器（北京金北德工貿(mào)有限公司）；Fusion FX5型凝膠成像儀（法國Vilber公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

將40只9周齡雄性SD大鼠，依據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、模型組、引陽索（432 mg/kg，相當(dāng)于臨床2倍劑量）組和左卡尼?。?00 mg/kg）組，每組10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除對(duì)照組外，其余各組連續(xù)ig腺嘌呤（200 mg/kg）14 d造模，造模同時(shí)各給藥組ig引陽索膠囊及左卡尼汀口服液，1次/d，連續(xù)49 d，對(duì)照組和模型組ig等體積0.3%羧甲基纖維素鈉。

2.2 造模效果評(píng)價(jià)

給予腺嘌呤14 d后觀察大鼠在造模后的腎陽虛證候表現(xiàn)，每3天測定大鼠體質(zhì)量1次，并記錄精神狀態(tài)、排尿情況、毛發(fā)色澤等；于第15天給藥前每組隨機(jī)取6只大鼠眼眶取血，按ELISA試劑盒說明書測定血清中雄激素睪酮水平。

2.3 臟腦系數(shù)測定

第49天給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h，ip戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取睪丸、附睪、全腦稱定質(zhì)量，計(jì)算臟腦系數(shù)。

臟腦系數(shù)＝臟器質(zhì)量/全腦質(zhì)量

2.4 附睪精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)、精子活率、精子計(jì)數(shù)及精子畸形率檢測

取各組大鼠左側(cè)附睪尾，置于2 mL無酚紅DMEM培養(yǎng)基（37 ℃預(yù)熱）中剪碎，充分搖勻，置于37 ℃水浴鍋中孵育10 min，使精子全部游出附睪。取1滴精子混合液滴在玻片上，利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析（computer assisted sperm analysis，CASA）技術(shù)觀察曲線速度、平均路徑速度、直線性、前向性、擺動(dòng)性及鞭打頻率。

吸取20 μL新鮮精子懸液至提前配好的PI（稀釋3000倍）、CAM（稀釋200倍）染色液中，染色30 min后于共聚焦顯微鏡200倍油鏡下鏡檢。若精子頭、體、尾部均呈現(xiàn)綠色熒光，則表示精子處于存活狀態(tài)，且在鏡下能明顯看到精子活動(dòng)，成片有虛影；若精子頭尖端呈現(xiàn)綠色熒光而后端呈現(xiàn)紅色熒光，且體部綠色熒光明顯，表示此時(shí)精子正處于存活與死亡的過渡期，而死亡精子頭部將完全呈現(xiàn)紅色熒光[14]。計(jì)算存活精子及過渡期精子數(shù)目總和與總精子數(shù)的比值。

將剩余精子懸液置于60 ℃水浴鍋中滅活10 min，將滅活后的精子懸液稀釋后置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。吸取5 μL滴至載玻片上，均勻推片，靜置晾干。隨后用甲醇固定10 min，靜置晾干后伊紅染色1.5 h，流水沖干后靜置晾干。在顯微鏡下計(jì)數(shù)不同視野每200條精子中畸形精子數(shù)目。

2.5 睪丸、附睪組織病理學(xué)及血清中睪酮水平檢測

將各組大鼠右側(cè)睪丸、附睪放在4%中性甲醛固定液中進(jìn)行固定，隨后石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察睪丸和附睪組織病理改變，觀察睪丸生精小管結(jié)構(gòu)及病變程度、管腔中精子數(shù)量及分布，附睪中附睪管的結(jié)構(gòu)和大小、生精細(xì)胞塊脫落程度、管腔中精子的數(shù)量及分布等。

按ELISA試劑盒說明書測定血清中雄激素睪酮水平。

2.6 免疫熒光法測定大鼠睪丸組織NELL2、附睪組織ROS1蛋白表達(dá)

取各組大鼠睪丸、附睪石蠟切片，脫水，抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白封閉，滴加NELL2（1∶200）、ROS1（1∶100）抗體，4 ℃孵育過夜，滴加結(jié)合熒光山羊抗兔二抗（1∶400），滴加含DAPI的防熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度。

2.7 Western blotting測定大鼠附睪組織OVCH2、ADAM3蛋白表達(dá)

取各組大鼠附睪組織，于冰上勻漿、裂解后，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉后，分別加入OVCH2（1∶500）、ADAM3（1∶500）、GAPDH（1∶5000）抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗（1∶5000），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，采用凝膠成像儀成像，Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 腺嘌呤造模效果評(píng)價(jià)

如圖1-A所示，腺嘌呤造模期間，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，毛發(fā)光滑，精神良好，進(jìn)食飲水、排便排尿均正常；模型組大鼠隨著給予腺嘌呤時(shí)間延長，體質(zhì)量逐漸降低，并于給藥14 d降至最低（＜0.001），毛發(fā)脫落且粗糙，精神不振，反應(yīng)遲鈍，蜷縮拱背，尿量增加，表現(xiàn)明顯腎陽虛癥狀；引陽索組和左卡尼汀組大鼠體質(zhì)量隨著給予腺嘌呤時(shí)間延長亦逐漸降低，但下降程度較模型組減輕，尤以14 d時(shí)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05、0.01），同時(shí)腎陽虛狀態(tài)亦較模型組有不同程度的減輕，表明引陽索膠囊及左卡尼汀對(duì)腺嘌呤致腎陽虛大鼠體質(zhì)量及體征均有一定程度的保護(hù)作用。如圖1-B所示，造模14 d后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中睪酮水平明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，引陽索組和左卡尼汀組血清中睪酮水平均明顯升高（＜0.01）。表明腺嘌呤致大鼠腎陽虛模型制備成功，且引陽索膠囊及左卡尼汀口服液對(duì)腺嘌呤致大鼠腎陽虛癥有一定的預(yù)防作用。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠臟腦系數(shù)影響

如表1所示，對(duì)照組大鼠睪丸飽滿、充盈、鞘膜韌性強(qiáng)，附睪呈半月形，緊貼于睪丸上端及后緣；與對(duì)照組比較，模型組大鼠睪丸、附睪均有明顯萎縮，睪丸、附睪臟腦系數(shù)均明顯降低（＜0.01、0.001）；與模型組比較，引陽索組及左卡尼汀組大鼠睪丸、附睪大小均較為正常，形狀舒展，同時(shí)臟腦系數(shù)均有顯著上升，其中引陽索組對(duì)腎陽虛大鼠臟腦系數(shù)的改善作用優(yōu)于左卡尼汀組，呈現(xiàn)較好藥效（＜0.01）。

表1 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸、附睪臟腦系數(shù)的影響(, n = 10)

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

#< 0.05##< 0.01###< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group, same as below tables

3.3 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠附睪精子數(shù)量、精子活率、精子畸形率及精子各動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

如圖2～4和表2所示，對(duì)照組大鼠精子密度高，頭部呈鐮刀型，體部修長，尾部自然彎曲，整體形態(tài)流暢；與對(duì)照組比較，模型組大鼠精子數(shù)量減少（＜0.001），精子活率低（＜0.001），鏡下很難觀察到活動(dòng)精子，精子畸形率顯著升高（＜0.001），過渡期精子數(shù)目亦減少，精子曲線速率、平均路徑速度、前向性、擺動(dòng)性等精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01），精子直線性、鞭打頻率也有所降低。與模型組比較，引陽索顯著增加精子數(shù)量（＜0.01），同時(shí)一定程度上降低了精子畸形率，在相同染色條件下，精子存活時(shí)間更長，精子活力增加，處于過渡期精子數(shù)量增多，精子活率顯著升高（＜0.001）；顯著增加精子曲線速率、平均路徑速度、直線性、前向性、擺動(dòng)性、鞭打頻率等精子各動(dòng)力學(xué)參數(shù)（＜0.05、0.01）；與左卡尼汀組比較，引陽索組在對(duì)精子數(shù)量、精子畸形率方面的改善作用相對(duì)較弱，但在精子活率、精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面的改善作用較突出，可見引陽索膠囊可通過提高精子數(shù)量、精子形態(tài)以及精子活力改善精子質(zhì)量，并且對(duì)精子活力、動(dòng)力方面的保護(hù)作用優(yōu)于左卡尼汀，呈現(xiàn)良好藥效。

a-正常精子 b-無頭 c-波狀體 d-折疊體 e-折疊尾 f-卷體 g-頸彎曲 h-無鉤

圖3 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠精子數(shù)量和精子畸形率的影響(, n = 10)

a-存活精子 b-過渡期精子 c-死亡精子

表2 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響(, n = 10)

3.4 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸、附睪組織病理學(xué)及血清中睪酮水平的影響

如圖5、6所示，對(duì)照組大鼠睪丸生精小管呈圓形，各級(jí)生精細(xì)胞規(guī)則排列，層次清晰，脫落細(xì)胞較少；附睪管直徑較大，形狀舒展，腔內(nèi)可見大量精子。模型組大鼠睪丸和附睪出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)改變，睪丸生精小管病變率顯著增加（＜0.001），生精小管結(jié)構(gòu)不規(guī)則，腔內(nèi)脫落細(xì)胞塊增多，線性精子數(shù)量變少，生精細(xì)胞排列紊亂；附睪管形態(tài)崎嶇，脫落細(xì)胞塊增多，精子排列紊亂、數(shù)量減少。與模型組比較，引陽索組大鼠睪丸生精小管病變率顯著下降（＜0.001），能改善腎陽虛大鼠睪丸、附睪病理狀態(tài)，使睪丸生精小管截面積增加，生精細(xì)胞排列規(guī)則，管腔內(nèi)可見脫落的生精細(xì)胞數(shù)減少，線性精子數(shù)量增多；附睪管形狀舒展，排列緊密，管內(nèi)脫落細(xì)胞塊減少，精子數(shù)量增多且分布均勻。與左卡尼汀組比較，引陽索組降低大鼠睪丸曲細(xì)精管病變率效果更顯著，且生精小管內(nèi)精子數(shù)量較多，生精細(xì)胞排列更整齊，附睪管腔內(nèi)線性精子數(shù)分布更均勻。與對(duì)照組比較，模型組血清中睪酮水平明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，引陽索組和左卡尼汀組均能明顯升高血清中睪酮水平（＜0.001），且引陽索組升高睪酮效果優(yōu)于左卡尼汀組，睪酮水平甚至恢復(fù)正常。

圖5 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸、附睪組織病理學(xué)的影響

圖6 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠曲細(xì)精管病變率 (n = 6) 及血清中睪酮水平(n = 10) 的影響()

3.5 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸NELL2、附睪ROS1蛋白表達(dá)的影響

如圖7和表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠睪丸NELL2、附睪ROS1的表達(dá)顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，引陽索組及左卡尼汀組均顯著升高NELL2、ROS1表達(dá)（＜0.05、0.001），且引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠附睪ROS1的上調(diào)作用優(yōu)于左卡尼汀，表明引陽索膠囊可能通過增加Lumicrine信號(hào)通路源頭NELL2表達(dá)，同時(shí)保護(hù)附睪，幫助附睪頭部發(fā)育，發(fā)揮對(duì)腎陽虛大鼠精子損傷的保護(hù)作用。

圖7 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸NELL2和附睪頭部ROS1蛋白表達(dá)的影響

表3 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠睪丸NELL2、附睪ROS1蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

3.6 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠附睪OVCH2、精子ADAM3蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠附睪OVCH2、2種形式ADAM3蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.001）；與模型組比較，引陽索組及左卡尼汀組均可顯著升高OVCH2、2種形式ADAM3蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01、0.001），且引陽索膠囊對(duì)附睪OVCH2的促分泌作用及對(duì)ADAM3的加工作用優(yōu)于左卡尼汀，表明引陽索膠囊可能通過調(diào)節(jié)Lumicrine信號(hào)通路中附睪OVCH2分泌、幫助精子頭部ADAM3加工，發(fā)揮對(duì)腎陽虛大鼠精子損傷的保護(hù)作用。

圖8 引陽索膠囊對(duì)腎陽虛大鼠附睪OVCH2、精子ADAM3蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

近年來少弱精癥發(fā)病率逐年升高，中醫(yī)藥以多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已在少弱精癥的臨床治療上占據(jù)一席之地。如今補(bǔ)腎中藥行業(yè)市場規(guī)模已增長至2020年的548.5億元，其中補(bǔ)腎中成藥一直保持27%左右的份額[15]。然而目前大部分補(bǔ)腎中成藥上市前臨床研究主要關(guān)注患者的癥狀、體征，缺乏明確藥效機(jī)制驗(yàn)證，加之早期中成藥由于不強(qiáng)制要求上市后再評(píng)價(jià)，使得大部分補(bǔ)腎壯陽品種未開展再評(píng)價(jià)工作[16]，導(dǎo)致許多藥效優(yōu)良、價(jià)格低廉的補(bǔ)腎中成藥未能得到足夠的重視利用及開發(fā)。因此，在這種市場環(huán)境和臨床需求牽引下，對(duì)補(bǔ)腎壯陽優(yōu)勢(shì)中藥品種藥效及機(jī)制再評(píng)價(jià)尤為重要。

本研究對(duì)上市藥引陽索膠囊進(jìn)行了精子保護(hù)藥效方面的再評(píng)價(jià)工作，揭示了精子發(fā)生到成熟過程中從睪丸到附睪這一接連不斷的生物進(jìn)程實(shí)質(zhì)，結(jié)果表明，引陽索膠囊可顯著降低腎陽虛大鼠睪丸曲細(xì)精管病變比例，促進(jìn)睪丸生精小管正常發(fā)育，同時(shí)顯著升高血清睪酮水平，從激素內(nèi)分泌及生殖源頭靶器官水平保證精子發(fā)生的穩(wěn)定環(huán)境，進(jìn)而顯著提高精子數(shù)量；改善附睪組織病理學(xué)異變，調(diào)節(jié)附睪管管壁厚度、排列順序，為精子創(chuàng)造適宜發(fā)育環(huán)境，促進(jìn)精子發(fā)育成熟，獲得受精和漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)的功能，進(jìn)而改善精子活率、精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)，提升精子質(zhì)量。本研究聯(lián)合激素內(nèi)分泌及靶器官相關(guān)檢測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)引陽索膠囊可通過保護(hù)睪丸、附睪的正常發(fā)育，創(chuàng)造適宜精子發(fā)生及成熟的管腔環(huán)境，進(jìn)而提升精子質(zhì)量，起到精子保護(hù)的作用。

哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程是在睪丸中進(jìn)行的，成熟完整、功能完備的睪丸為精子提供適宜發(fā)育的微環(huán)境，形態(tài)正常的精子進(jìn)入附睪，在下一個(gè)靶器官內(nèi)獲得漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)和使卵子受精的能力。而附睪通常分為附睪近端IS區(qū)、附睪體和附睪尾3個(gè)主要區(qū)域。研究表明，在精子發(fā)生的同時(shí)，不同階段的睪丸生精細(xì)胞將分泌Lumicrine精子成熟因子——NELL2，通過睪丸輸出小管流入附睪，與附睪表面ROS1特異性結(jié)合，介導(dǎo)附睪頭部IS端的發(fā)育，進(jìn)而幫助附睪起始IS端分化成熟。隨后發(fā)育成熟的附睪近端IS區(qū)的上皮細(xì)胞進(jìn)而特異性分泌能夠使得精子發(fā)育成熟的相關(guān)蛋白OVCH2，并靶向作用于位于精子頭部的跨膜蛋白ADAM3，使其加工成熟，隨后精子才會(huì)成熟并獲得使卵母細(xì)胞受精的能力，通過子宮輸卵管連接處進(jìn)入輸卵管并與卵母細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)透明帶結(jié)合[17-21]。Lumicrine信號(hào)通路參與附睪器官的成熟、精子成熟蛋白的裝配，在精子成熟過程中起著關(guān)鍵性作用。

本研究通過免疫熒光及Western blotting方法，以腎陽虛型精子損傷大鼠為載體，對(duì)上市藥引陽索膠囊的精子保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了再評(píng)價(jià)工作。結(jié)果表明，腺嘌呤致毒損害睪丸、附睪等相應(yīng)生殖靶器官，造成睪丸生精細(xì)胞發(fā)育受阻，精子發(fā)生減少，睪丸NELL2分泌減少，同時(shí)造成附睪發(fā)育不良，無法表達(dá)足夠數(shù)量的ROS1受體，阻礙兩者的結(jié)合，進(jìn)一步導(dǎo)致附睪的不正常分化，降低OVCH2的分泌，減少精子頭部ADAM3的加工，最終阻斷Lumicrine信號(hào)通路。而引陽索膠囊能夠在一定程度上保護(hù)睪丸生精細(xì)胞及支持細(xì)胞，提升睪丸NELL2的分泌量，促進(jìn)NELL2與附睪ROS1結(jié)合，通過對(duì)附睪上皮細(xì)胞及附睪管的保護(hù)提升ROS1的表達(dá)量促進(jìn)腎陽虛大鼠附睪的分化，幫助附睪IS端發(fā)育成熟，進(jìn)而提高附睪管腔OVCH2的分泌、幫助睪丸中產(chǎn)生的精子進(jìn)行頭部ADAM3的加工，使其獲得受精能力，保證精子質(zhì)量，提示引陽索膠囊可能通過Lumicrine信號(hào)通路改善腎陽虛大鼠精子損傷。

引陽索膠囊由淫羊藿、五味子2味藥組成，具補(bǔ)腎、壯陽、生津之功效，方中的淫羊藿自古以來便是補(bǔ)命門、益精氣、補(bǔ)腎壯陽之要藥，主要起生精、增加精液分泌量的作用[22]，研究表明，淫羊藿可提高少弱精癥患者精子密度，改善精子前向運(yùn)動(dòng)力[23]、提升精子活率[24]、改善精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能[25]。而方中的另一味藥五味子，具有收斂固澀、補(bǔ)腎寧心之功效，研究表明，五味子可有效增強(qiáng)抗氧化酶活性，保證精子膜完整性，保護(hù)精子不被氧化損傷[26]，同時(shí)可促進(jìn)性激素正常分泌，改善睪丸生精功能，提高精子數(shù)量和質(zhì)量[27]。2種中藥既溫補(bǔ)腎陽，又能滋腎陰、補(bǔ)腎氣、調(diào)和陰陽、扶正固本，具有改善少弱精癥患者的精子損傷狀態(tài)、發(fā)揮精子保護(hù)作用的極大潛力。

綜上，引陽索膠囊對(duì)腺嘌呤所致腎陽虛型大鼠精子損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與Lumicrine信號(hào)通路有關(guān)，通過上調(diào)靶蛋白NELL2、ROS1的表達(dá)促進(jìn)附睪成熟及OVCH2分泌，幫助精子頭部ADAM3蛋白加工完全，獲得受精能力，對(duì)男性生殖關(guān)鍵靶器官睪丸、附睪的發(fā)育及體內(nèi)激素的分泌均具有良好的調(diào)節(jié)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism of Yinyangsuo Capsules on sperm damage of kidney-deficiency model based on NELL2 Lumicrine signaling pathway

XU Pan-yu1, 2, LI Jia-shan2, DU Han-qian2, LI Ze-hui2, LI Yuan2, LIN Na2, XU Ying1, 2

1. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To study the protective effect of Yinyangsuo Capsules (引陽索膠囊) on sperm damage induced by adenine in rats with kidney-deficiency, and explore its mechanism from neural EGFL like 2 (NELL2) Lumirine signal pathway.Male SD rats were randomly divided into control group, model group, Yinyangsuo Capsules (432 mg/kg) group and levocarnitine (100 mg/kg) group with 10 rats in each group. The rat model of kidney-deficiency was established by ig adenine (200 mg/kg) for 14 d. The success of model was judged by observing the syndrome of kidney-deficiency and testosterone level in serum. At the same time of modeling, drugs were given for 49 d, testicle and epididymis visceral brain coefficients were calculated. Computer assisted sperm analysis (CASA) was used to detect epididymal sperm kinetic parameters. Sperm count and sperm deformity rate were detected under light microscope. Sperm viability was detected by fluorescence; Histopathological changes of testis and epididymis were observed by HE staining. Testosterone level in serum was detected by ELISA. Immunofluorescence was used to observe the secretion of NELL2 in testis and expression of c-ros oncogene 1 (ROS1) in epididymis. The expression of epididymal protease lecithin 2 (OVCH2) and sperm a disintegrin and metalloproteinase 3 (ADAM3) were detected by Western blotting.Compared with model group, Yinyangsuo Capsules can improve the symptoms of kidney-deficiency in rats with kidney-deficiency, such as rough hair loss, listlessness, curled back, increased urine output and decreased body weight, increase the visceral brain coefficient of testis and epididymis (< 0.01); Significantly increased sperm number, sperm viability and sperm dynamics parameters (< 0.05, 0.01, 0.001), decreased sperm deformity rate, decreased seminiferous tubule lesions rate (< 0.001), and increased testosterone level in serum on 14th and 49th d (< 0.01, 0.001); The expression levels of NELL2 in testis and ROS1, OVCH2 and ADAM3 in epididymis were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001).Yinyangsuo Capsules has a protective effect on sperm injury induced by adenine in rats with kidney-deficiency, and its mechanism may be related to its regulation of NELL2 Lumicrine signaling pathway to participate in spermatogenesis and maturation.

Yinyangsuo Capsules; NELL2; Lumicrine; kidney-deficiency; sperm damage

R285.5

A

0253 - 2670(2022)24 - 7774 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.015

2022-10-16

中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CI2021A03802）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82004248）

徐盼瑜，碩士研究生，從事中藥藥理研究。Tel: 18058786679 E-mail: 1340117961@qq.com

徐 穎，博士，研究員，主要從事中藥藥性和中藥生殖藥理研究。Tel: 15910527526 E-mail: yxu@icmm.ac.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]