• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-142-3p 在感染后腸易激綜合征中的表達(dá)及意義

    2022-12-27 12:19:18林湫泠張定國(guó)熊鋒姚君
    新醫(yī)學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:抗炎細(xì)胞因子調(diào)控

    林湫泠 張定國(guó) 熊鋒 姚君

    感染后腸易激綜合征(PI-IBS), 是腸易激綜合征(IBS)的重要類型和研究熱點(diǎn)[1]。PI-IBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,報(bào)道表明腸道感染引起的黏膜炎癥反應(yīng)和免疫功能激活可能是PI-IBS發(fā)病的重要因素[2-4]。微RNA(miR)-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miRNA,對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。我們對(duì)miR 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異顯著的miR-142-3p 可能可以作為PI-IBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。前期臨床實(shí)驗(yàn)表明,與正常人群的樣品相比,PI-IBS患者樣品中miR-142-3p 水平明顯下調(diào),提示miR-142-3p 與PI-IBS 發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本研究擬進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面探討miR-142-3p 在PI-IBS中的表達(dá)及意義,闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

    miR-142-3p、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和Toll 樣受體4(TLR4)引物(北京擎科生物科技有限公司),HMGB1 小干擾RNA(siRNA)及陰性對(duì)照(廣州艾基生物技術(shù)有限公司),脂多糖(LPS)、胃蛋白酶(美國(guó) Sigma 公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司), 原代腸上皮細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),TRIzol 試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司],反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),轉(zhuǎn)染試劑(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)。

    二、 PI-IBS 大鼠模型建立

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    10 只SD 雄性大鼠由深圳市人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供,鼠齡6~7 周,體質(zhì)量23~26 g,所有大鼠飼養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔級(jí)動(dòng)物房,光線調(diào)整為12 h日/夜循環(huán)。采用旋毛蟲感染建立PI-IBS 大鼠模型,采用旋毛蟲造模過(guò)程如下:將旋毛蟲保種大鼠乙醚麻醉后,頸椎脫臼處死,剔取四肢及膈肌肌肉。將肌肉盡量剪碎后置于500 mL 含有2.5%胃蛋白酶和0.5%鹽酸的消化液中,置于37 ℃水浴消化 12~20 h。反復(fù)將消化后混合液經(jīng) 200 目濾布過(guò)濾收集旋毛蟲幼蟲。將濾液收集 500 r/min,10 min 離心,棄上清,重 懸 于pH 為7.2~7.4 的PBS,計(jì)數(shù)調(diào)整濃度至1500 只/mL。給予每只大鼠0.2 mL 含350~400 條幼蟲的瓊脂懸液灌胃,感染后飼養(yǎng)8 周,建立PI-IBS 模型。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)深圳市人民醫(yī)院審批通過(guò)(醫(yī)院倫理編號(hào):LLKY-2021248)。

    2. siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

    原代腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)于12 孔板中。細(xì)胞達(dá)到60%~80%匯合度時(shí),用jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑開展siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。首先取10 μL 的HMGB1 siRNA(10 nmol)及陰性對(duì)照 siRNA(10 nmol)添加到100 μL jetPRIME?buffer 中,渦旋10 s,離心10 s,隨后向混合液中加入3 μL jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑,渦旋振蕩后,室溫靜置10 min。隨后將混懸液滴加到細(xì)胞中,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用LPS (500 ng/mL)及miR-142-3p 處理細(xì)胞24 h,最后收集腸上皮細(xì)胞總RNA。

    3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

    檢 測(cè) 細(xì) 胞 中miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 的表達(dá)水平:提取腸上皮細(xì)胞細(xì)胞總RNA:使用TRIzol 試劑盒進(jìn)行提取。cDNA 合成:根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。miR-142-3p 引物序列:正 向 引 物 為5′-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3′,反向 引 物 為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3′。HMGB1引物序列:正向引物為5′-AGGATCCCAATGCACC CAAGAG-3′,反向引物為5′-TTCGCAACATCACCA ATGGACAG-3′。

    TLR4 引物序列:正向引物為5′-GGTCAGAC GGTGATAGCGAG-3′,反向引物為5′-GGTCCAGGT TCTTGGTTGAG-3′。qRT-PCR 反應(yīng):a 反應(yīng)條件:SYBR Green(2×)5 μL/孔,cDNA 2 μL/ 孔,正反向引物各 0.5 μL/ 孔, ddH2O 2 μL/ 孔;b 反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35次循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù),采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 表示,組間比較采用t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U 檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P <0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、miR-142-3p 在腸上皮細(xì)胞中具有抗炎作用

    基于miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性,筆者將在大鼠腸上皮細(xì)胞上考察miR-142-3p 對(duì)HMGB1-TLR4 靶基因的作用。炎癥基因NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 均為HMGB1-TLR4 的靶基因。使用LPS 刺激后,施加miR-142-3p 大大抑制了NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 的表達(dá),這表明miR-142-3p 具有抗炎作用(圖1)。

    圖1 miR-142-3p 在LPS 處理的腸上皮細(xì)胞中對(duì)炎癥基因的影響

    二、HMGB1 是miR-142-3p 的靶基因

    TargetScan 預(yù)測(cè)軟件分析表明miR-142-3p 在HMGB1 的3′UTR 上有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(CACUAC),表明miR-142-3p 很有可能調(diào)控HMGB1 的表達(dá)(圖2A)。此外,此結(jié)合位點(diǎn)在不同種屬之間有良好的 保 守 性。miR-142-3p 可 抑 制HMGB1 3′UTR 活性,miR-142-3p 濃度越高,HMGB1 3′UTR 活性越低(F = 10.86,P <0.05,其中miR-142-3p 濃度為50 nmol vs. 25 nmol,P = 0.0102 ;miR-142-3p 濃度100 nmol vs. 25 nmol,P = 0.0001)(圖2B)。然而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)锳CGCGA,miR-142-3p 不再調(diào)控HMGB1 3′UTR 的 活 性,這 表 明miR-142-3p 調(diào)控HMGB1 依賴結(jié)合位點(diǎn)CACUAC(圖2C)。

    圖2 miR-142-3p 在HMGB1 的潛在結(jié)合位點(diǎn)

    三、miR-142-3p 的抗炎作用依賴于HMGB1

    為驗(yàn)證HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的介導(dǎo)作用,筆者團(tuán)隊(duì)用siRNA 對(duì)腸上皮細(xì)胞中的HMGB1 進(jìn)行靶向敲低。siRNA 可以使細(xì)胞中的HMGB1 表達(dá)降低超過(guò)80%,這證明敲低效率高,結(jié)果可靠(圖3A,P <0.05)。敲低細(xì)胞中HMGB1后,miR-142-3p 失去抗炎作用(圖3B)。這表明miR-142-3p 通過(guò)抑制HMGB1 來(lái)達(dá)到抗炎效果。

    圖3 HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的作用

    討 論

    IBS 是一種以復(fù)發(fā)性腹部不適或疼痛為特征的臨床綜合征[5-6]。在全球范圍內(nèi),IBS 在男性中的發(fā)病率為4%,在女性中為14%,且發(fā)病年齡多集中于青壯年,并具有慢性、易復(fù)發(fā)性等特點(diǎn),已成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要疾患之一[5-6]。臨床研究顯示,急性胃腸道感染與IBS 發(fā)病關(guān)系密切,3%~36%的急性腸道感染患者最終會(huì)發(fā)展為IBS[7]。這種在感染性胃腸炎發(fā)生后形成的IBS 又稱PI-IBS, 是IBS 的重要類型和研究熱點(diǎn)[4]。PIIBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,有研究認(rèn)為細(xì)胞因子失衡、腸道菌群失調(diào),特別是腸道免疫應(yīng)答的異常激活是導(dǎo)致PI-IBS 發(fā)生的關(guān)鍵因素[2-4]。筆者團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS 患者體內(nèi)抗炎和促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平存在失衡,其導(dǎo)致低度炎癥和免疫激活最終導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。通過(guò)恢復(fù)PIIBS 患者體內(nèi)細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài),可以有效預(yù)防和緩解PI-IBS 的癥狀。由于免疫細(xì)胞因子和應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,因此發(fā)掘更多調(diào)節(jié)PI-IBS 腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子,對(duì)于闡明PI-IBS 發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型治療方法至關(guān)重要。

    miR 是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理過(guò)程,其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。得益于核酸藥物和靶向遞送理論和轉(zhuǎn)化研究的迅猛發(fā)展,目前已有靶向miR 的藥物進(jìn)入到臨床研究。miR-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miR,對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。Zhai 等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-142-3p 通過(guò)靶向自噬基因ATG16L1 緩解炎癥反應(yīng)。筆者對(duì)miRNA 靶基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異明顯的miR-142-3 可能可以作為PIIBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。HMGB1 是一種重要的晚期致炎因子,參與多種組織和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。HMGB1 可通過(guò)與TLR 家族受體結(jié)合,激活下游信號(hào)通路(如核因子κB)和炎癥小體(如NLRP3),促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放,調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng),并參與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生[9-10]。HMGB1 是一種炎癥性蛋白,其廣泛分布于各種組織中,并可通過(guò)與多種受體結(jié)合促進(jìn)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。TLR是HMGB1 的重要受體,參與多種感染和機(jī)體損傷機(jī)制。HMGB1 可以和TLR4、TLR2 受體結(jié)合,引起核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào),促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放,進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[11-12]。有 研 究 顯示,HMGB1 在NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中起到重要作用。使用NSAID 誘導(dǎo)PI-IBS 后,大鼠腸道和血清中的HMGB1 表達(dá)提高,施加人重組HMGB1 蛋白會(huì)加重NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷,激活核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)腸道TNF-α 等促炎因子的表達(dá),并同時(shí)降低抗炎因子IL-10 的水平,而HMGB1 抗體則能部分阻斷NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷[13]。另外,敲除HMGB1 的TLR4 后,明顯緩解HMGB1 的加重腸道損傷,證明HMGB1-TLR4 信號(hào)通路在調(diào)控NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中發(fā)揮重要作用[13]。

    筆者團(tuán)隊(duì)前期收集PI-IBS 患者及健康人群的樣品各10 例進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-142-3p、HMGB1 和 TLR4 的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與正常人群相比,PI-IBS 患者中miR-142-3p 水平明顯下調(diào),而HMGB1 和TLR4 的mRNA 水平明顯上調(diào)。這說(shuō)明miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性。之后在大鼠腸上皮細(xì)胞中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-142-3p 可 降 低HMGB1-TLR4- 核 因 子κB 的 靶 炎癥 基 因 如NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α的表達(dá),并且此抗炎作用依賴于HMGB1。這提示miR-142-3p 對(duì)HMGB1 的調(diào)節(jié)可能與PI-IBS 的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步的軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明miR-142-3p 可以與HMGB1 的3′-UTR 直接結(jié)合?;谝陨献C據(jù),筆者團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè) miR-142-3p 可能通過(guò)抑制晚期促炎因子HMGB1 的表達(dá),下調(diào)TLR4-NFκB/NLRP3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,最終防止PI-IBS 的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)筆者將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)解析miR-142-3p 在PI-IBS 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,并對(duì)其下游炎癥反應(yīng)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行探索和驗(yàn)證,以揭示并闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。

    猜你喜歡
    抗炎細(xì)胞因子調(diào)控
    抗GD2抗體聯(lián)合細(xì)胞因子在高危NB治療中的研究進(jìn)展
    秦艽不同配伍的抗炎鎮(zhèn)痛作用分析
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    牛耳楓提取物的抗炎作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:20
    短柱八角化學(xué)成分及其抗炎活性的研究
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:09
    順勢(shì)而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    急性心肌梗死病人細(xì)胞因子表達(dá)及臨床意義
    熏硫與未熏硫白芷抗炎鎮(zhèn)痛作用的對(duì)比研究
    中藥與臨床(2015年5期)2015-12-17 02:39:30
    SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
    国产精品人妻久久久影院| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 色吧在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品无大码| 中文天堂在线官网| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 插逼视频在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 麻豆成人av视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产色婷婷99| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品久久久久久久久免| 国产69精品久久久久777片| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av免费高清在线观看| 免费观看的影片在线观看| 综合色丁香网| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 一级二级三级毛片免费看| 国产亚洲最大av| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品免费大片| 一级毛片电影观看| 搡老乐熟女国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 激情 狠狠 欧美| 久久99热这里只频精品6学生| av在线播放精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 如何舔出高潮| 高清毛片免费看| 国产乱人偷精品视频| 99热这里只有是精品50| 成人美女网站在线观看视频| 成人一区二区视频在线观看| 精品一区二区三卡| 日韩电影二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品一二三| 免费看光身美女| 女人久久www免费人成看片| 网址你懂的国产日韩在线| 国产高潮美女av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品久久久久久久久亚洲| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品国产乱码久久久久久小说| 十分钟在线观看高清视频www | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久国产乱子免费精品| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品,欧美精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品专区欧美| 国产亚洲91精品色在线| 丰满乱子伦码专区| 视频中文字幕在线观看| 嫩草影院新地址| 欧美zozozo另类| 六月丁香七月| 国产老妇伦熟女老妇高清| 丝瓜视频免费看黄片| 蜜桃在线观看..| 熟女电影av网| 国产一区二区三区av在线| 99久久人妻综合| 亚洲性久久影院| 在线看a的网站| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人91sexporn| 久久久久久久久大av| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 婷婷色综合大香蕉| 日本与韩国留学比较| 国产精品偷伦视频观看了| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | www.色视频.com| 国产精品秋霞免费鲁丝片| www.色视频.com| 精品久久久久久久久av| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产综合精华液| 一区二区三区四区激情视频| 免费观看无遮挡的男女| 免费观看无遮挡的男女| 高清不卡的av网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产精品成人久久小说| av黄色大香蕉| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲性久久影院| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av二区三区四区| av福利片在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 九色成人免费人妻av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久精品夜色国产| 老熟女久久久| 人人妻人人看人人澡| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 成人美女网站在线观看视频| 国产精品不卡视频一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 两个人的视频大全免费| 少妇人妻久久综合中文| 毛片一级片免费看久久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产伦理片在线播放av一区| 精品酒店卫生间| 亚洲真实伦在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品精品国产色婷婷| 久久精品夜色国产| 晚上一个人看的免费电影| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩av免费高清视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产69精品久久久久777片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产av精品麻豆| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av男天堂| 国产精品三级大全| 夫妻午夜视频| 一区二区三区四区激情视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产av一区二区精品久久 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久国产乱子免费精品| 久久久久视频综合| videossex国产| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 三级经典国产精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久视频综合| 亚洲成人手机| 免费看av在线观看网站| 久久这里有精品视频免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 97热精品久久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国内精品宾馆在线| 日日啪夜夜爽| www.av在线官网国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 日日撸夜夜添| 国产精品久久久久久av不卡| 婷婷色av中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲欧美日韩东京热| 日日啪夜夜撸| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品人妻视频免费看| 夫妻午夜视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人a区在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本午夜av视频| 天堂8中文在线网| 久久精品夜色国产| h视频一区二区三区| 国产av精品麻豆| 亚洲国产av新网站| 免费黄色在线免费观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| freevideosex欧美| 天天躁日日操中文字幕| 日韩成人伦理影院| 少妇的逼好多水| 美女视频免费永久观看网站| 久久人妻熟女aⅴ| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜精品国产一区二区电影| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美变态另类bdsm刘玥| 七月丁香在线播放| 性色av一级| 免费观看av网站的网址| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久欧美国产精品| 亚洲欧洲国产日韩| 国产乱来视频区| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人一区二区在线| 97在线视频观看| 国产久久久一区二区三区| 91久久精品电影网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 丝袜脚勾引网站| 看十八女毛片水多多多| 一级二级三级毛片免费看| 久久久久久人妻| 国产av精品麻豆| 日本wwww免费看| 中国国产av一级| 国产精品伦人一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 毛片一级片免费看久久久久| 97在线人人人人妻| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产极品天堂在线| 一级二级三级毛片免费看| 丝袜脚勾引网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日日啪夜夜撸| 久久精品久久精品一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 伦理电影大哥的女人| 亚洲伊人久久精品综合| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩一区二区三区影片| 国产av码专区亚洲av| 国产综合精华液| 亚洲三级黄色毛片| 99久久精品热视频| 晚上一个人看的免费电影| 在线观看av片永久免费下载| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美+日韩+精品| 日韩av免费高清视频| 直男gayav资源| 黄片无遮挡物在线观看| 在线免费十八禁| 成人亚洲精品一区在线观看 | 欧美高清性xxxxhd video| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品酒店卫生间| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品成人在线| 下体分泌物呈黄色| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品精品国产色婷婷| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品福利在线免费观看| 国产人妻一区二区三区在| 久久女婷五月综合色啪小说| 激情五月婷婷亚洲| 夜夜爽夜夜爽视频| 中国三级夫妇交换| 精品亚洲成a人片在线观看 | 成人午夜精彩视频在线观看| 九色成人免费人妻av| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久成人免费电影| 性色av一级| 久久热精品热| 水蜜桃什么品种好| 交换朋友夫妻互换小说| 精品久久久精品久久久| .国产精品久久| 免费观看性生交大片5| 少妇的逼水好多| 五月玫瑰六月丁香| 一级爰片在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本wwww免费看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲欧美精品专区久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 最近手机中文字幕大全| 五月伊人婷婷丁香| 性色av一级| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品99久久99久久久不卡 | h日本视频在线播放| 国产综合精华液| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产视频首页在线观看| 蜜桃在线观看..| 男女边吃奶边做爰视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久婷婷青草| 色哟哟·www| 国产成人a区在线观看| 亚洲综合色惰| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 又大又黄又爽视频免费| 欧美高清性xxxxhd video| 日本午夜av视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 18禁在线播放成人免费| 亚洲人与动物交配视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 草草在线视频免费看| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲色图av天堂| 啦啦啦在线观看免费高清www| 性色av一级| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丰满乱子伦码专区| 麻豆乱淫一区二区| 久久国产精品大桥未久av | 亚洲真实伦在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 人体艺术视频欧美日本| 一级片'在线观看视频| 成年免费大片在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产在线免费精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品第二区| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久99热6这里只有精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 韩国高清视频一区二区三区| 日本与韩国留学比较| a级毛色黄片| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 成年免费大片在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 一级av片app| 亚洲欧美日韩无卡精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 国产乱人偷精品视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品久久久精品久久久| 永久网站在线| 水蜜桃什么品种好| 久久99精品国语久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 免费观看a级毛片全部| 男人狂女人下面高潮的视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av男天堂| 夜夜爽夜夜爽视频| 丰满乱子伦码专区| 欧美+日韩+精品| 久久99热这里只频精品6学生| 十八禁网站网址无遮挡 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一区二区av电影网| av黄色大香蕉| 欧美精品国产亚洲| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲,欧美,日韩| 91在线精品国自产拍蜜月| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看| av.在线天堂| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 赤兔流量卡办理| 搡老乐熟女国产| 亚洲性久久影院| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产欧美亚洲国产| 午夜老司机福利剧场| 熟女电影av网| 人妻少妇偷人精品九色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费看日本二区| 欧美日韩视频精品一区| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 综合色丁香网| 日韩成人伦理影院| 高清不卡的av网站| 国产av码专区亚洲av| 日本欧美国产在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 热re99久久精品国产66热6| 日本色播在线视频| av在线app专区| 777米奇影视久久| h视频一区二区三区| 国产亚洲最大av| 欧美+日韩+精品| 久久 成人 亚洲| 黑丝袜美女国产一区| 日本一二三区视频观看| 日韩一本色道免费dvd| 天堂俺去俺来也www色官网| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品国产亚洲av天美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲三级黄色毛片| 深爱激情五月婷婷| 精品酒店卫生间| 精品久久久精品久久久| 22中文网久久字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 99热国产这里只有精品6| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 另类亚洲欧美激情| 高清不卡的av网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品人妻熟女av久视频| 久久国产乱子免费精品| 中文在线观看免费www的网站| 午夜激情久久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 久久99热这里只频精品6学生| .国产精品久久| 老司机影院成人| 国产极品天堂在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 精品久久久久久久末码| .国产精品久久| 久久久色成人| 国产精品国产三级专区第一集| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇丰满av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久网色| 中文欧美无线码| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲自偷自拍三级| 国产毛片在线视频| 日本色播在线视频| 97在线人人人人妻| 丰满乱子伦码专区| 亚洲中文av在线| 国内精品宾馆在线| 日本与韩国留学比较| 国产久久久一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 18+在线观看网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜激情福利司机影院| 视频区图区小说| 免费少妇av软件| 亚洲国产精品一区三区| 黑丝袜美女国产一区| a 毛片基地| 国产精品无大码| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一级毛片电影观看| 看十八女毛片水多多多| 在线免费十八禁| 亚洲精品日韩av片在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| freevideosex欧美| 亚洲av在线观看美女高潮| 2018国产大陆天天弄谢| 内射极品少妇av片p| 亚洲综合精品二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产在线免费精品| 下体分泌物呈黄色| 久久精品国产自在天天线| 99热这里只有是精品50| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品一区www在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产综合精华液| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 青春草国产在线视频| www.色视频.com| 久热这里只有精品99| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美三级亚洲精品| 欧美丝袜亚洲另类| 成人国产av品久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲最大成人中文| 亚洲av免费高清在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 精品亚洲成a人片在线观看 | 夫妻性生交免费视频一级片| 五月天丁香电影| 免费观看a级毛片全部| 日本欧美视频一区| av国产精品久久久久影院| 制服丝袜香蕉在线| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 精品一区二区三区视频在线| 欧美bdsm另类| 日韩一区二区视频免费看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线观看av片永久免费下载| 久久精品国产亚洲av天美| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产视频内射| 日韩中文字幕视频在线看片 | 99久久精品国产国产毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 熟女电影av网| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 五月开心婷婷网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本一二三区视频观看| 免费观看a级毛片全部| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 2022亚洲国产成人精品| videos熟女内射| 国产精品女同一区二区软件| 大话2 男鬼变身卡| 国产91av在线免费观看| 伦理电影免费视频| 最近中文字幕2019免费版| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产亚洲91精品色在线| 伦理电影大哥的女人| 在线免费观看不下载黄p国产| 日日撸夜夜添| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产精品国产av在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲三级黄色毛片| 欧美成人a在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲国产精品国产精品| 国产综合精华液| 91久久精品电影网| 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 永久免费av网站大全| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美一区二区亚洲| 欧美精品一区二区大全| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黄色怎么调成土黄色| 久久热精品热| 丝袜喷水一区| 亚洲国产精品一区三区| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品熟女久久久久浪| 男女边摸边吃奶| 亚洲不卡免费看| 我的女老师完整版在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 多毛熟女@视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 女性被躁到高潮视频| av国产免费在线观看| 联通29元200g的流量卡| 天堂8中文在线网| 三级经典国产精品| 久久久久精品性色| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费少妇av软件|