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    miR-142-3p 在感染后腸易激綜合征中的表達(dá)及意義

    2022-12-27 12:19:18林湫泠張定國(guó)熊鋒姚君
    新醫(yī)學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:抗炎細(xì)胞因子調(diào)控

    林湫泠 張定國(guó) 熊鋒 姚君

    感染后腸易激綜合征(PI-IBS), 是腸易激綜合征(IBS)的重要類型和研究熱點(diǎn)[1]。PI-IBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,報(bào)道表明腸道感染引起的黏膜炎癥反應(yīng)和免疫功能激活可能是PI-IBS發(fā)病的重要因素[2-4]。微RNA(miR)-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miRNA,對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。我們對(duì)miR 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異顯著的miR-142-3p 可能可以作為PI-IBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。前期臨床實(shí)驗(yàn)表明,與正常人群的樣品相比,PI-IBS患者樣品中miR-142-3p 水平明顯下調(diào),提示miR-142-3p 與PI-IBS 發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本研究擬進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面探討miR-142-3p 在PI-IBS中的表達(dá)及意義,闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

    miR-142-3p、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和Toll 樣受體4(TLR4)引物(北京擎科生物科技有限公司),HMGB1 小干擾RNA(siRNA)及陰性對(duì)照(廣州艾基生物技術(shù)有限公司),脂多糖(LPS)、胃蛋白酶(美國(guó) Sigma 公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司), 原代腸上皮細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),TRIzol 試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司],反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),轉(zhuǎn)染試劑(深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司)。

    二、 PI-IBS 大鼠模型建立

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    10 只SD 雄性大鼠由深圳市人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供,鼠齡6~7 周,體質(zhì)量23~26 g,所有大鼠飼養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔級(jí)動(dòng)物房,光線調(diào)整為12 h日/夜循環(huán)。采用旋毛蟲感染建立PI-IBS 大鼠模型,采用旋毛蟲造模過(guò)程如下:將旋毛蟲保種大鼠乙醚麻醉后,頸椎脫臼處死,剔取四肢及膈肌肌肉。將肌肉盡量剪碎后置于500 mL 含有2.5%胃蛋白酶和0.5%鹽酸的消化液中,置于37 ℃水浴消化 12~20 h。反復(fù)將消化后混合液經(jīng) 200 目濾布過(guò)濾收集旋毛蟲幼蟲。將濾液收集 500 r/min,10 min 離心,棄上清,重 懸 于pH 為7.2~7.4 的PBS,計(jì)數(shù)調(diào)整濃度至1500 只/mL。給予每只大鼠0.2 mL 含350~400 條幼蟲的瓊脂懸液灌胃,感染后飼養(yǎng)8 周,建立PI-IBS 模型。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)深圳市人民醫(yī)院審批通過(guò)(醫(yī)院倫理編號(hào):LLKY-2021248)。

    2. siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

    原代腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)于12 孔板中。細(xì)胞達(dá)到60%~80%匯合度時(shí),用jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑開展siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。首先取10 μL 的HMGB1 siRNA(10 nmol)及陰性對(duì)照 siRNA(10 nmol)添加到100 μL jetPRIME?buffer 中,渦旋10 s,離心10 s,隨后向混合液中加入3 μL jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑,渦旋振蕩后,室溫靜置10 min。隨后將混懸液滴加到細(xì)胞中,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用LPS (500 ng/mL)及miR-142-3p 處理細(xì)胞24 h,最后收集腸上皮細(xì)胞總RNA。

    3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

    檢 測(cè) 細(xì) 胞 中miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 的表達(dá)水平:提取腸上皮細(xì)胞細(xì)胞總RNA:使用TRIzol 試劑盒進(jìn)行提取。cDNA 合成:根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。miR-142-3p 引物序列:正 向 引 物 為5′-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3′,反向 引 物 為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3′。HMGB1引物序列:正向引物為5′-AGGATCCCAATGCACC CAAGAG-3′,反向引物為5′-TTCGCAACATCACCA ATGGACAG-3′。

    TLR4 引物序列:正向引物為5′-GGTCAGAC GGTGATAGCGAG-3′,反向引物為5′-GGTCCAGGT TCTTGGTTGAG-3′。qRT-PCR 反應(yīng):a 反應(yīng)條件:SYBR Green(2×)5 μL/孔,cDNA 2 μL/ 孔,正反向引物各 0.5 μL/ 孔, ddH2O 2 μL/ 孔;b 反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35次循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù),采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 表示,組間比較采用t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U 檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P <0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、miR-142-3p 在腸上皮細(xì)胞中具有抗炎作用

    基于miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性,筆者將在大鼠腸上皮細(xì)胞上考察miR-142-3p 對(duì)HMGB1-TLR4 靶基因的作用。炎癥基因NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 均為HMGB1-TLR4 的靶基因。使用LPS 刺激后,施加miR-142-3p 大大抑制了NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 的表達(dá),這表明miR-142-3p 具有抗炎作用(圖1)。

    圖1 miR-142-3p 在LPS 處理的腸上皮細(xì)胞中對(duì)炎癥基因的影響

    二、HMGB1 是miR-142-3p 的靶基因

    TargetScan 預(yù)測(cè)軟件分析表明miR-142-3p 在HMGB1 的3′UTR 上有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(CACUAC),表明miR-142-3p 很有可能調(diào)控HMGB1 的表達(dá)(圖2A)。此外,此結(jié)合位點(diǎn)在不同種屬之間有良好的 保 守 性。miR-142-3p 可 抑 制HMGB1 3′UTR 活性,miR-142-3p 濃度越高,HMGB1 3′UTR 活性越低(F = 10.86,P <0.05,其中miR-142-3p 濃度為50 nmol vs. 25 nmol,P = 0.0102 ;miR-142-3p 濃度100 nmol vs. 25 nmol,P = 0.0001)(圖2B)。然而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)锳CGCGA,miR-142-3p 不再調(diào)控HMGB1 3′UTR 的 活 性,這 表 明miR-142-3p 調(diào)控HMGB1 依賴結(jié)合位點(diǎn)CACUAC(圖2C)。

    圖2 miR-142-3p 在HMGB1 的潛在結(jié)合位點(diǎn)

    三、miR-142-3p 的抗炎作用依賴于HMGB1

    為驗(yàn)證HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的介導(dǎo)作用,筆者團(tuán)隊(duì)用siRNA 對(duì)腸上皮細(xì)胞中的HMGB1 進(jìn)行靶向敲低。siRNA 可以使細(xì)胞中的HMGB1 表達(dá)降低超過(guò)80%,這證明敲低效率高,結(jié)果可靠(圖3A,P <0.05)。敲低細(xì)胞中HMGB1后,miR-142-3p 失去抗炎作用(圖3B)。這表明miR-142-3p 通過(guò)抑制HMGB1 來(lái)達(dá)到抗炎效果。

    圖3 HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的作用

    討 論

    IBS 是一種以復(fù)發(fā)性腹部不適或疼痛為特征的臨床綜合征[5-6]。在全球范圍內(nèi),IBS 在男性中的發(fā)病率為4%,在女性中為14%,且發(fā)病年齡多集中于青壯年,并具有慢性、易復(fù)發(fā)性等特點(diǎn),已成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要疾患之一[5-6]。臨床研究顯示,急性胃腸道感染與IBS 發(fā)病關(guān)系密切,3%~36%的急性腸道感染患者最終會(huì)發(fā)展為IBS[7]。這種在感染性胃腸炎發(fā)生后形成的IBS 又稱PI-IBS, 是IBS 的重要類型和研究熱點(diǎn)[4]。PIIBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,有研究認(rèn)為細(xì)胞因子失衡、腸道菌群失調(diào),特別是腸道免疫應(yīng)答的異常激活是導(dǎo)致PI-IBS 發(fā)生的關(guān)鍵因素[2-4]。筆者團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS 患者體內(nèi)抗炎和促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平存在失衡,其導(dǎo)致低度炎癥和免疫激活最終導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。通過(guò)恢復(fù)PIIBS 患者體內(nèi)細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài),可以有效預(yù)防和緩解PI-IBS 的癥狀。由于免疫細(xì)胞因子和應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,因此發(fā)掘更多調(diào)節(jié)PI-IBS 腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子,對(duì)于闡明PI-IBS 發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型治療方法至關(guān)重要。

    miR 是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理過(guò)程,其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。得益于核酸藥物和靶向遞送理論和轉(zhuǎn)化研究的迅猛發(fā)展,目前已有靶向miR 的藥物進(jìn)入到臨床研究。miR-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miR,對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。Zhai 等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-142-3p 通過(guò)靶向自噬基因ATG16L1 緩解炎癥反應(yīng)。筆者對(duì)miRNA 靶基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異明顯的miR-142-3 可能可以作為PIIBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。HMGB1 是一種重要的晚期致炎因子,參與多種組織和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。HMGB1 可通過(guò)與TLR 家族受體結(jié)合,激活下游信號(hào)通路(如核因子κB)和炎癥小體(如NLRP3),促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放,調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng),并參與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生[9-10]。HMGB1 是一種炎癥性蛋白,其廣泛分布于各種組織中,并可通過(guò)與多種受體結(jié)合促進(jìn)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。TLR是HMGB1 的重要受體,參與多種感染和機(jī)體損傷機(jī)制。HMGB1 可以和TLR4、TLR2 受體結(jié)合,引起核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào),促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放,進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[11-12]。有 研 究 顯示,HMGB1 在NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中起到重要作用。使用NSAID 誘導(dǎo)PI-IBS 后,大鼠腸道和血清中的HMGB1 表達(dá)提高,施加人重組HMGB1 蛋白會(huì)加重NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷,激活核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)腸道TNF-α 等促炎因子的表達(dá),并同時(shí)降低抗炎因子IL-10 的水平,而HMGB1 抗體則能部分阻斷NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷[13]。另外,敲除HMGB1 的TLR4 后,明顯緩解HMGB1 的加重腸道損傷,證明HMGB1-TLR4 信號(hào)通路在調(diào)控NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中發(fā)揮重要作用[13]。

    筆者團(tuán)隊(duì)前期收集PI-IBS 患者及健康人群的樣品各10 例進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-142-3p、HMGB1 和 TLR4 的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與正常人群相比,PI-IBS 患者中miR-142-3p 水平明顯下調(diào),而HMGB1 和TLR4 的mRNA 水平明顯上調(diào)。這說(shuō)明miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性。之后在大鼠腸上皮細(xì)胞中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-142-3p 可 降 低HMGB1-TLR4- 核 因 子κB 的 靶 炎癥 基 因 如NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α的表達(dá),并且此抗炎作用依賴于HMGB1。這提示miR-142-3p 對(duì)HMGB1 的調(diào)節(jié)可能與PI-IBS 的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步的軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明miR-142-3p 可以與HMGB1 的3′-UTR 直接結(jié)合?;谝陨献C據(jù),筆者團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè) miR-142-3p 可能通過(guò)抑制晚期促炎因子HMGB1 的表達(dá),下調(diào)TLR4-NFκB/NLRP3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,最終防止PI-IBS 的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)筆者將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)解析miR-142-3p 在PI-IBS 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用,并對(duì)其下游炎癥反應(yīng)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行探索和驗(yàn)證,以揭示并闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。

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