去氫駱駝蓬堿包合物脂質(zhì)體的制備及體外性質(zhì)評價(jià)

周偉成，劉宇靈，陳穎翀*，管詠梅，黃麗珍，范 暉，劉麗麗，岳鵬飛*

去氫駱駝蓬堿包合物脂質(zhì)體的制備及體外性質(zhì)評價(jià)

周偉成1，劉宇靈2，陳穎翀1*，管詠梅1，黃麗珍1，范 暉1，劉麗麗1，岳鵬飛1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700

制備去氫駱駝蓬堿包合物脂質(zhì)體（harmine drug-in-cyclodextrin-in-liposome，Har-DCL），并評價(jià)該制劑的理化性質(zhì)和體外特性。以包合物溶解度、包合率、體外釋放考察為指標(biāo)考察去氫駱駝蓬堿包合物（harmineinclusion complex，Har-CD）的最佳工藝。采用傅里葉紅外光譜儀、掃描電子顯微鏡、X射線衍射分析等確定Har-CD的包合程度，以證實(shí)制備方法的可行性。采用pH梯度主動(dòng)載藥法考察磷脂與膽固醇質(zhì)量比，Har與脂質(zhì)體質(zhì)量比對Har-DCL粒徑分布、載藥量及包封率的影響，以得到粒徑分布均勻，載藥量高且穩(wěn)定的Har-DCL。飽和水溶液法制備的包合物溶解度為42.81 μg/mL，包合率為95.50%，為最佳制備方法。羥丙基-β-環(huán)糊精與Har的質(zhì)量比為8∶1時(shí)，制成的包合物溶解度最好，載藥量為 （107.0±0.4）mg/g，包合率為（96.33±0.39）%。使用pH梯度法以磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3∶1，藥脂比為1∶10制備的脂質(zhì)體平均粒徑為（85.24±0.60）nm，ζ電位為（?3.57±0.28）mV，載藥量和包封率分別達(dá)到（1.740±0.001）mg/mL和 （95.650±0.003）%。加入20.0 mg/mL乳糖得到的脂質(zhì)體凍干粉外觀飽滿，復(fù)溶性能良好。使用飽和水溶液法讓Har進(jìn)入環(huán)糊精的空腔結(jié)構(gòu)，可以有效增強(qiáng)Har水溶性。Har以Har-CD的形式從脂質(zhì)體雙分子層之間，轉(zhuǎn)移至內(nèi)水相而得到的Har-DCL均勻穩(wěn)定，對Har新劑型的開發(fā)提供參考。

去氫駱駝蓬堿；環(huán)糊精包合物；脂質(zhì)體；冷凍干燥；包合物；pH梯度主動(dòng)載藥法；飽和水溶液法；溶解度；復(fù)溶性；包封率；載藥量

去氫駱駝蓬堿（harmine，Har）為蒺藜科駱駝蓬屬植物駱駝蓬L.的種子中提取分離得到的一種三環(huán)β-咔啉類生物堿，為駱駝蓬的主要活性成分[1]。Har具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，還具有顯著抑制單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性的作用[2-3]。因此，Har具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。然而Har水溶性差，導(dǎo)致其生物利用度低，且神經(jīng)毒性較強(qiáng)，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用[4]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道中Har有醇質(zhì)體、磁納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒等遞藥載體以改善Har的水溶性及神經(jīng)毒性[5-7]。

脂質(zhì)體是由一種具有類生物膜排列有序的脂質(zhì)雙分子層組成的球形囊狀物，不僅可包載水溶性藥物，還可包載脂溶性藥物。同時(shí)脂質(zhì)體在實(shí)現(xiàn)靶向給藥、緩釋給藥、提高難溶性藥物與多肽藥物的生物利用度、減輕藥物不良反應(yīng)等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。然而采用脂質(zhì)體包載難溶性藥物也存在穩(wěn)定性差、易泄漏等不足。此外，藥物包載在脂質(zhì)雙分子層中比包載在脂質(zhì)體內(nèi)水核中更易釋放，因此限制了脂質(zhì)體技術(shù)在難溶性藥物中的應(yīng)用[8]。1994年，McCormack和Gregoriadis發(fā)現(xiàn)可以使用環(huán)糊精包合物將藥物載入脂質(zhì)體內(nèi)水核，且避免使用有機(jī)溶劑，形成新型的脂質(zhì)體即環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體（drug-in-cyclodextrin-in-liposome，DCL）[9]，能夠改善難溶性藥物在脂質(zhì)體中存在的問題。

本實(shí)驗(yàn)采用兩步法制備去氫駱駝蓬堿包合物脂質(zhì)體（harmine drug-in-cyclodextrin-in-liposome，Har-DCL）[10]。第1步先采用水溶性較好的羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxy-β-cyclodextrin，HP-β-CD）[11-13]為包合材料制備去氫駱駝蓬堿包合物（harmine inclusion complex，Har-CD），并對其進(jìn)行表征評價(jià)，確保Har-CD制備成功。第2步采用pH梯度法制備空白脂質(zhì)體，利用內(nèi)外pH相差的梯度將包合物推入脂質(zhì)體的內(nèi)水相[14]，形成Har-DCL，以粒徑分布、載藥量和包封率等為指標(biāo)篩選脂質(zhì)體處方，并采用冷凍干燥法對其進(jìn)行固化，以便Har-DCL的長期儲(chǔ)存[15]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Zetasizer Nano-S型納米粒度儀及分析軟件，英國Malvern公司；Quanta250型掃描電子顯微鏡（SEM）、Tecnai G2 Spirit型透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；B11-3型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；Diamond差示掃描量熱儀（DSC），美國Perkin-Elmer公司；THZ型恒溫?fù)u床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；D8 Advance X型射線衍射儀（XRD），德國布魯克公司；TGL-20MC型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘鑫儀器儀表有限公司；透析袋7000，上海瑞永生物科技有限公司；Sprucm Two型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer公司；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZBS-8G智能溶出儀，天大天發(fā)科技有限公司；Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)化學(xué)工作站，美國Agilent公司；色譜柱：Titank C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

Har對照品，批號(hào)RFS-Q0410190325，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；氫化大豆卵磷脂（HSPC），批號(hào)B60455，艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；膽固醇，批號(hào)624J034，北京索萊寶科技有限公司；HP-β-CD，批號(hào)RH171208，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；蔗糖，批號(hào)1403011，西隴化工股份有限公司；-甘露醇，批號(hào)170716，F(xiàn)reund集團(tuán)；乳糖，批號(hào)683833，DFE Pharma公司；乙酸銨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)77.08%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，美國Tedia公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Har的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Titank C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm，菲羅門）；UV檢測器、Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；流動(dòng)相為乙腈-0.077%乙酸銨緩沖鹽（65∶35）[16]；檢測波長320 nm；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取10 mg Har對照品置于50 mL量瓶中，使用65%乙腈溶液溶解定容，得200 μg/mL Har對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密量取Har-DCL溶液0.5 mL置于50 mL量瓶中，使用65%乙腈溶液破乳定容，即得Har-DCL破乳溶液。同法制備空白DCL破乳溶液。

2.1.4 專屬性考察 分別取空白DCL破乳溶液、Har對照品溶液、Har-DCL破乳溶液，過0.22 μm微孔濾膜，各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖（圖1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明此色譜條件下，Har峰形良好，載體輔料對Har測定無干擾。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取Har對照品溶液適量，用65%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度為2、10、20、40、80、100、160、200 μg/mL的系列對照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積，以Har質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，所得線性方程為＝31.447－1.552，2＝0.999 9，結(jié)果表明Har在2～200 μg/mL與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度考察 精密量取適量的Har對照品溶液，加適量65%乙腈配制低、中、高（2、80、200 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，于1、3、5 d各進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果測得低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度對照品溶液的日內(nèi)精密度分別為0.01%、0.09%、1.52%，日間精密度分別為0.03%、1.28%、0.63%。

圖1 空白DCL破乳溶液 (A)、Har對照品溶液(B)、Har-DCL破乳溶液(C) 的HPLC圖

2.1.7 加樣回收率考察 精密量取Har-DCL溶液0.25 mL，加入Har對照品溶液（200 μg/mL）0.25 mL，渦旋混勻，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液進(jìn)行測定，計(jì)算得Har的平均加樣回收率為100.18%，RSD值為0.14%。

2.2 Har-CD的制備

2.2.1 包合物制備方法的選擇 分別采用飽和水溶液法、研磨法及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備Har-CD，以溶解度及包合率為指標(biāo)考察Har-CD的制備方法，制備方法以及溶解度、包合率測定方法如下。

（1）飽和水溶液法：將溶有Har的無水乙醇慢慢滴入HP-β-CD水溶液中，持續(xù)攪拌48 h至乙醇揮盡，4 ℃下放置過夜后于烘箱50 ℃烘干，即得Har-CD。

（2）研磨法：稱取HP-β-CD適量于研缽中，加入一定量雙蒸水，研磨至糊狀，加入一定量Har充分研磨，真空冷凍干燥，即可得Har-CD。

（3）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法：分別稱取適量Har與HP-β-CD置于燒杯中，加入適宜溶劑分別溶解后，混合并振搖均勻，封口。置于超聲波條件下進(jìn)行包合反應(yīng)。包合結(jié)束后，減壓蒸發(fā)多余溶劑，即得Har-CD[17]。

（4）溶解度的測定：取過量Har-CD加至3 mL雙蒸水中，搖床振搖（37 ℃、160 r/min、48 h）。振搖結(jié)束，于4 ℃放置過夜后取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算溶解度。

（5）包合率的測定：取Har-CD 20 mg置于50 mL量瓶中，用65%乙腈溶解并定容，得樣品，取1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算包合物中總藥量（1），包合物中投入Har的總質(zhì)量為2，按下列公式計(jì)算藥物包合率。

包合率＝1/2

結(jié)果如表1所示，3種方法制備的Har-CD均有較好的溶解度及包合率，其中飽和水溶液法制備的Har-CD溶解度及包合率最佳，分別為（42.81±0.09）μg/mL、（95.50±0.92）%，與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法相比有顯著性差異（＜0.01）。飽和水溶液法雖制備時(shí)間較長，但操作簡便，所制備的Har-CD的溶解度及包合率均較高，因此適合Har-CD的制備。

表1 不同制備方法對Har溶解度和包合率的影響(, n = 3)

與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法比較：**＜0.01

**< 0.01rotary evaporation method

2.2.2 Har與HP-β-CD的比例篩選 通過平衡溶解度試驗(yàn)篩選Har與HP-β-CD的比例。采用飽和水溶液法分別制備HP-β-CD與Har質(zhì)量比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1的Har-CD。

搖床法溶解度測定：取過量不同比例的Har-CD，分別加至3 mL雙蒸水和0.5%聚山梨酯-80水溶液中，搖床振搖（37 ℃、160 r/min、48 h）。振搖結(jié)束后，于4 ℃放置過夜后取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄對應(yīng)峰面積，計(jì)算各平衡溶解度。

由表2可知，Har-CD的溶解度與HP-β-CD的用量呈現(xiàn)不完全相關(guān)性，當(dāng)HP-β-CD與Har的質(zhì)量比為8∶1時(shí)，Har-CD在水和0.5%聚山梨酯-80中的溶解度均最高，分別為（32.21±2.38）、（123.40±10.04）μg/mL，與其他比例組比較均有顯著性差異（＜0.01）。

表2 不同HP-β-CD與Har質(zhì)量比時(shí)Har-CD的溶解度(, n = 3)

與6∶1組比較：**＜0.01

**< 0.016∶1 group

2.3 Har-CD的表征與評價(jià)

2.3.1 差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）分析 精密稱取Har-CD樣品2～5 mg于鋁盤中，設(shè)置升溫速率10 ℃/min，檢測溫度范圍為室溫至310 ℃。分別對Har、HP-β-CD、Har與HP-β-CD物理混合物（質(zhì)量比為1∶8）及Har-CD（Har與HP-β-CD的質(zhì)量比1∶8）進(jìn)行DSC分析[18]。結(jié)果見圖2，可見Har在265 ℃左右出現(xiàn)1個(gè)強(qiáng)吸熱峰。物理混合物在258 ℃左右出現(xiàn)1個(gè)較弱吸熱峰，說明Har仍以原狀態(tài)存在。而HP-β-CD及Har-CD均未出現(xiàn)明顯吸熱峰，Har的熱性質(zhì)發(fā)生改變，表明Har-CD并不是簡單的物理混合狀態(tài)，HP-β-CD與Har發(fā)生了包合作用。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 采用KBr壓片法分別對Har、HP-β-CD、Har和HP-β-CD的物理混合物以及Har-CD在紅外光譜上測定紅外光譜吸收曲線，樣品與KBr以1∶100比例混合，充分研磨后壓片，以2 cm?1的分辨率在4000～400 cm?1進(jìn)行掃描。結(jié)果見圖3，Har在1700～1000 cm?1存在集中的吸收峰，且在3500～3100 cm?1存在N-H的吸收。HP-β-CD在3400 cm?1左右出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)峰，2930 cm?1處C-H伸縮振動(dòng)峰和1035 cm?1處的C-O-C的伸縮振動(dòng)峰等特征峰。Har和HP-β-CD的特征峰在物理混合物中均有所體現(xiàn)。Har-CD中Har的特征峰強(qiáng)度明顯減弱，表明Har與HP-β-CD不是簡單的混合，而是發(fā)生了相互作用，證明包合物已經(jīng)形成[19]。

圖2 Har (A)、HP-β-CD (B)、Har和HP-β-CD的物理混合物 (質(zhì)量比為1∶8, C) 和Har-CD (質(zhì)量比為1∶8, D) 的DSC分析圖譜

2.3.3 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析 X射線衍射的測定條件為CuKα輻射，管壓40 kV，石墨單色器，掃描范圍為0°～90°，管流為100 mA，掃描速度1°/min。由圖4可知，Har的特征晶體衍射峰在10.2°、20.6°和25°出現(xiàn)，HP-β-CD未出現(xiàn)明顯晶體衍射峰，物理混合物呈現(xiàn)出與Har類似的特征晶體衍射峰，而Har-CD未出現(xiàn)尖銳的特征晶體衍射峰，結(jié)果表明Har被包裹進(jìn)HP-β-CD的空腔結(jié)構(gòu)中，形成非晶態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖3 Har(A)、HP-β-CD (B)、Har和HP-β-CD的物理混合物 (質(zhì)量比為1∶8, C) 和Har-CD (質(zhì)量比為1∶8, D) 的FTIR分析圖譜

圖4 Har(A)、Har-CD (質(zhì)量比為1∶8, B)、Har和HP-β-CD的物理混合物(質(zhì)量比為1∶8, C)和HP-β-CD (D)的XRD圖

2.3.4 形態(tài)觀察 采用真空鍍金方法制備了Har、HP-β-CD、Har和HP-β-CD物理混合物、Har-CD樣品，通過SEM對各樣品的形態(tài)進(jìn)行觀察[20]，由圖5可知，Har為不規(guī)則的棒狀晶型結(jié)構(gòu)，HP-β-CD為含有空腔的類球形結(jié)構(gòu)。在物理混合物中觀察到了Har和環(huán)糊精的特征結(jié)構(gòu)，而在Har-CD中觀察到大部分非晶型結(jié)構(gòu)，顯示為大小不一的塊狀結(jié)構(gòu)，這種顯著的形態(tài)變化可能與Har和環(huán)糊精的相互作用有關(guān)，從而也進(jìn)一步證實(shí)了DSC和XRD結(jié)果。

2.3.5 包合率和載藥量的測定 精密稱取20 mg Har-CD于50 mL量瓶中，用65%乙腈溶解并定容，得樣品，取1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜的濾液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算載藥量和包合率。結(jié)果顯示，HP-β-CD與Har的質(zhì)量比為8∶1時(shí)制得的包合物的載藥量為（107.0±0.4）mg/g，包合率為（96.33±0.39）%。

圖5 Har (A)、HP-β-CD (B)、Har和HP-β-CD的物理混合物(質(zhì)量比為1∶8, C)和Har-CD(質(zhì)量比為1∶8, D)的SEM圖

2.3.6 平衡溶解度的測定 采用搖床法。取過量Har、Har-CD，分別加至3 mL雙蒸水和0.5%聚山梨酯-80溶液中，搖床振搖（37 ℃，160 r/min，48 h）。振搖結(jié)束后4 ℃放置過夜，第2天取1 mL上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算Har和Har-CD的平衡溶解度。結(jié)果見表3，Har-CD在水溶液和0.5%聚山梨酯-80溶液中的溶解度較Har分別提高了3.17、3.83倍，表明包合物技術(shù)可顯著提高Har的溶解度。

表3 Har和Har-CD的溶解度(, n = 3)

2.3.7 體外釋放實(shí)驗(yàn) 采用槳法進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。分別精密稱取20 mg各比例Har-CD及Har，同時(shí)倒入裝有150 mL PBS 7.4溶液的溶出杯中，立即開始轉(zhuǎn)動(dòng)［（37±2）℃、100 r/min］，分別于0.08、0.16、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 h取樣1 mL，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，同時(shí)在溶出杯中補(bǔ)加相同體積（1 mL）和溫度的PBS 7.4溶液。將續(xù)濾液按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄對應(yīng)的峰面積，計(jì)算各樣品的累積釋放率。結(jié)果見圖6。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，所有比例的Har-CD包合物的釋放均高于Har，表明包合物技術(shù)可顯著改善Har的體外釋放，與前文結(jié)果一致。且隨著HP-β-CD與Har比例的增加，體外累積釋放率也隨之增加，但10∶1與12∶1體外釋放量接近，在8 h的累積釋放率分別為（62.23±4.59）%和（61.25±6.32）%。雖然8∶1 Har-CD 8 h時(shí)的累積釋放率為（56.49±4.43）%，但其載藥量為107.0 mg/g，高于10∶1和12∶1 Har-CD的載藥量（91.52、80.06 mg/g）。

圖6 Har和不同比例Har-CD的體外釋放曲線(, n = 3)

因此，綜合體外釋放度及載藥量考慮，HP-β-CD與Har的比例為8∶1為制備Har-CD的最佳比例。即精密稱取300 mg Har溶于180 mL無水乙醇待用，將2.4 g HP-β-CD溶于162 mL雙蒸水中，于40 ℃下磁力攪拌，轉(zhuǎn)速500 r/min。將溶有Har的無水乙醇慢慢滴入HP-β-CD溶液中，持續(xù)攪拌48 h至乙醇揮盡，4 ℃下放置1夜后于烘箱50 ℃烘干，即得。

2.4 Har-DCL的制備及表征

2.4.1 脂質(zhì)體制備方法

（1）空白脂質(zhì)體的制備：精密稱取HSPC、膽固醇于圓底燒瓶中，用適量氯仿溶解后，在50 ℃條件下水浴真空旋蒸1 h，圓底燒瓶中形成干燥的白色磷脂膜。加入一定體積250 mmol/L (NH4)2SO4溶液水化，通過超聲波細(xì)胞粉碎儀冰浴超聲得到泛藍(lán)色乳光的脂質(zhì)體懸液，過0.45 μm濾膜后，即得空白脂質(zhì)體。

（2）Har-DCL的制備：稱取適量Har-CD于西林瓶中，加入一定體積空白脂質(zhì)體和一定體積雙蒸水，在60 ℃水浴條件下加熱攪拌2 h，冷卻后得Har-DCL[21]。

2.4.2 HSPC與膽固醇質(zhì)量比考察 精密稱取HSPC與膽固醇為2∶1、3∶1、4∶1的質(zhì)量比，采用上述方法制備Har-DCL，測定粒徑、ζ電位、載藥量及包封率。

采用超濾法測定包封率[22]。取0.5 mL Har-DCL于超濾離心管（截留相對分子質(zhì)量10 000）中，于12 000 r/min、4 ℃、15 min條件下離心（離心半徑6.2 cm），吸取濾液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，隨著磷脂與膽固醇的比例增加，載藥量逐漸下降，當(dāng)HSPC與膽固醇為3∶1時(shí)，包封率相對較高，形成的脂質(zhì)體均勻穩(wěn)定，載藥量與2∶1相近，因此選擇3∶1的比例制備Har-DCL。

2.4.3 藥物與脂質(zhì)體質(zhì)量比（藥脂比）考察 精密稱取藥脂比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的量，采用“2.4.1”項(xiàng)下方法制備Har-DCL，測定其粒徑、ζ電位、載藥量及包封率，結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，隨著藥脂比的增加，Har-DCL的載藥量明顯上升，但包封率有所下降，藥脂比1∶10時(shí)，Har-DCL載藥量最高，且包封率與其他比例相差較小，因此選擇1∶10的藥脂比進(jìn)行載藥。

表4 HSPC與膽固醇質(zhì)量比考察(, n = 3)

最終確定以HSPC與膽固醇質(zhì)量比為3∶1，藥脂比為1∶10制備Har-DCL，并進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.4 形態(tài)分析 取Har-DCL，加入適量雙蒸水稀釋后，滴至專用銅網(wǎng)上，靜置使脂質(zhì)體粒子在銅網(wǎng)上沉積后自然揮干，用2%磷鎢酸負(fù)染，采用TEM觀察其形態(tài)。結(jié)果如圖7所示，可見Har-DCL呈現(xiàn)均勻球形，脂質(zhì)體輪廓形狀清晰，且未觀察到藥物晶體沉淀。

表5 藥脂比考察(, n = 3)

圖7 Har-DCL的TEM圖

2.4.5 粒度分布及電位測定 取適量Har-DCL用純水稀釋至一定濃度，用馬爾文激光粒度儀測得平均粒徑為（85.24±0.60）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.193±0.009，粒徑呈正態(tài)分布（圖8），分布范圍較窄，ζ電位為（?3.57±0.28）mV。

2.4.6 Har-DCL穩(wěn)定性考察 將Har-DCL儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中，分別于儲(chǔ)存的第1、3、5、7、15天取出觀察外觀，并測定脂質(zhì)體的粒徑、ζ電位和包封率，考察Har-DCL的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Har-DCL在4 ℃環(huán)境下放置15 d，外觀無明顯變化，粒徑、ζ電位和包封率結(jié)果見表6，15 d內(nèi)的變化幅度較小，表明Har-DCL在低溫環(huán)境（4 ℃）短時(shí)間儲(chǔ)存的穩(wěn)定性良好。

圖8 Har-DCL粒徑分布

表6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果(, n = 3)

2.5 Har-DCL凍干的考察

水態(tài)脂質(zhì)體在長期儲(chǔ)存期間存在磷脂的水解和氧化、脂質(zhì)體囊泡聚集融合和藥物泄漏等問題，為提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，延長儲(chǔ)存時(shí)間，通過冷凍干燥技術(shù)將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化為固態(tài)粉末。低溫條件的干燥方法可以有效提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，凍干后的脂質(zhì)體大多呈現(xiàn)出多孔形狀，在提高儲(chǔ)存時(shí)間的同時(shí)，還具有良好的復(fù)溶特性，可以快速吸收水分，恢復(fù)活性[15]。

2.5.1 凍干保護(hù)劑的選擇 選用糖類作為凍干保護(hù)劑，分別稱取10.0 mg/mL海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、環(huán)糊精于西林瓶中，其中空白對照不加保護(hù)劑，分別加入2 mL Har-DCL攪拌溶解后放置在?21 ℃冰箱預(yù)凍12 h，凍干后加入2 mL雙蒸水復(fù)溶測定粒徑及ζ電位。由圖9可知，空白對照、海藻糖及環(huán)糊精所制備的凍干粉出現(xiàn)塌陷，從復(fù)溶結(jié)果（表7）可得出乳糖的再分散系數(shù)（redispersibility index，RDI）接近1，再分散性最好，凍干后的粉末形態(tài)飽滿，因此，選擇乳糖作為Har- DCL的凍干保護(hù)劑。

2.5.2 凍干保護(hù)劑用量的選擇 按照保護(hù)劑的用量為2.5、5.0、15.0、20.0、25.0 mg/mL分別稱取乳糖于西林瓶中，分別加入2 mL Har-DCL攪拌溶解后放置在?21 ℃冰箱預(yù)凍12 h，凍干后加入2 mL雙蒸水復(fù)溶測粒徑及ζ電位。由圖10和表8可知，隨著凍干保護(hù)劑用量的增加，凍干粉均呈現(xiàn)為飽滿的白色疏松塊狀物，但是復(fù)溶后Har-DCL的RDI逐漸減小。加入20.0 mg/mL乳糖時(shí)，Har-DCL凍干粉的外觀良好，復(fù)溶后的RDI最低，粒徑由凍干前的（112.20±0.46）nm增至（148.60±4.85）nm，復(fù)溶后的包封率為（85.860±0.475）%，相較于凍干前的（89.940±0.019）%變化較小。

從左往右依次為空白對照、海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、環(huán)糊精

表7 凍干保護(hù)劑考察(, n = 3)

從左往右凍干保護(hù)劑用量依次為2.5、5.0、15.0、20.0、25.0 mg?mL?1

表8 凍干保護(hù)劑用量考察(, n = 3)

3 討論

Har藥理作用廣泛，可以促進(jìn)如腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，具良好的抗腫瘤作用。另有研究表明Har可以穿越血腦屏障，對腦部疾病有一定的治療作用。但Har水溶性差、生物利用度低，在普通脂質(zhì)體中主要存在于磷脂雙分子層之間，導(dǎo)致藥物容易泄漏，嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用。DCL作為一種新型的藥物載體，綜合了包合物提高水溶性和脂質(zhì)體靶向遞藥的優(yōu)勢，將Har從雙分子層轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)體內(nèi)水相，提高藥物的穩(wěn)定性和載藥效果[23-24]。同時(shí)也能提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少藥物的泄漏，增加緩釋性，延長藥物的作用時(shí)間[25]。

本研究采用兩步法制備Har-DCL，兩步法需先制備好包合物，如此可以提高藥物以包合物形式包裹入脂質(zhì)體內(nèi)水相的幾率，且不容易發(fā)生藥物的滲漏，穩(wěn)定性較高。脂質(zhì)體雖然可以搭載藥物，但是Har作為難溶性藥物難以進(jìn)入內(nèi)水相，而是嵌入脂質(zhì)體雙分子層之間，容易破環(huán)雙分子層結(jié)構(gòu)導(dǎo)致泄漏。環(huán)糊精包合技術(shù)讓Har等難溶于水的藥物進(jìn)入環(huán)糊精內(nèi)部空腔，形成環(huán)糊精包合物，可有效進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)水相。由于環(huán)糊精的內(nèi)部空腔有限，環(huán)糊精與藥物的比例會(huì)影響環(huán)糊精的包合程度，進(jìn)而影響藥物的利用率。

本研究結(jié)果表明采用飽和水溶液法，環(huán)糊精與Har的質(zhì)量比為8∶1時(shí)，制備的包合物載藥量和包合率分別為（107.0±0.4）mg/g和（96.33±0.39）%，其水溶性提高了3.17倍。體外溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Har-CD可有效提高Har的釋放量。其余表征結(jié)果均顯示Har-CD的制備成功。包合物脂質(zhì)體制備的最佳處方為HSPC與膽固醇質(zhì)量比為3∶1，藥脂比為1∶10，固化所選用的凍干保護(hù)劑為20.0 mg/mL乳糖。所制備的Har-DCL粒徑為（85.24±0.60）nm，ζ電位為（?3.57±0.28）mV，載藥量和包封率分別為1.740 mg/mL和95.65%，TEM結(jié)果未觀察到Har晶體，表明Har-CD成功裝載在脂質(zhì)體中，且未影響脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。

綜上所述，本研究成功制備了Har-CD，且顯著提高了Har的水溶性，所制備的Har-DCL為均勻球體，載藥量及包封率均較高。通過凍干技術(shù)固化后的Har-DCL外觀疏松飽滿，復(fù)溶性良好，有利于提高長期貯存穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)為該制劑體內(nèi)外的進(jìn)一步研究等工作打下了堅(jiān)實(shí)地基礎(chǔ)。同時(shí)DCL技術(shù)結(jié)合了環(huán)糊精包合物和脂質(zhì)體的優(yōu)勢，通過包合物的形式將藥物轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)體內(nèi)水相，提高藥物溶解度的同時(shí)，也降低了藥物的泄漏，能有效克服難溶性中藥成分吸收差、生物利用度低等缺點(diǎn)，表明DCL新型脂質(zhì)體在解決難溶性中藥成分的成藥性和劑型設(shè)計(jì)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andproperties evaluation of harmine drug-in-cyclodextrin- in-liposome

ZHOU Wei-cheng1, LIU Yu-ling2, CHEN Ying-chong1, GUAN Yong-mei1, HUANG Li-zhen1, FAN Hui1, LIU Li-li1, YUE Peng-fei1

1. Key Lab of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To prepare harmine drug-in-cyclodextrin-in-liposome (Har-DCL) and evaluate the physicochemical properties andcharacteristics of this formulation.The solubility, inclusion rate andrelease of the inclusion complex were used as the evaluation to obtain optimal formulation of harmine inclusion complex (Har-CD). The degree of inclusion of Har-CD was determined using Fourier transform infrared spectroscopy, scanning electron microscopy, X-ray diffraction analysis, etc. to confirm the feasibility of the preparation method. The pH gradient active drug loading method was used to investigate the mass ratio of phospholipid and cholesterol, and the effect of the mass ratio of liposome and Har on the particle size distribution, drug loading and encapsulation efficiency of Har-DCL. Influence of drug dosage and to obtain Har-DCL with uniform particle size distribution, high drug loading and stable Har-DCL.The optimum preparation method was confirmed for Har-CD preparation: the solubility of the inclusion compound prepared by the saturated aqueous solution method was 42.81 μg/mL, and the inclusion rate was 95.50%. The inclusion compound with the mass ratio of hydroxypropyl-β-cyclodextrin and Har of 8:1 had the best solubility, the drug loading capacity and the inclusion rate of Har-CD was (107.0 ± 0.4) mg/g and (96.33 ± 0.39)%, respectively. The mean particle size of liposomes prepared with phospholipid: cholesterol ratio of 3:1 and drug-lipid ratio of 1:10 using the pH gradient method was (85.24 ± 0.60) nm, and the ζ potential was (?3.57 ± 0.28) mV. The drug loading capacity and encapsulation efficiency reached (1.740 ± 0.001) mg/mL and (95.650 ± 0.003)%, respectively. The liposome freeze-dried powder obtained by adding 20.0 mg/mL lactose had a plump appearance and good reconstitution performance.The use of saturated aqueous solution method to make Har into the cavity structure of cyclodextrin can effectively enhance the water solubility of Har. The Har-DCL obtained by transferring Har in the form of Har-CD from the liposome bilayer to the inner aqueous phase is uniform and stable, which provides a reference for the development of new formulation for Har.

harmine; cyclodextrin inclusion compound; liposome; freeze drying; inclusion complex; pH gradient active drug loading method; saturated aqueous solution method; solubility; resolubility; encapsulation efficiency; drug loading capacity

R283.6

A

0253 - 2670(2022)24 - 7696 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.007

2022-07-13

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20202BAB216038）；江西中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金（2018WBZR001）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（82260816）；江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑技術(shù)與制藥裝備創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXTD22006）；江西中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210412363）

周偉成（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。E-mail: Zhouwc163@163.com

陳穎翀，女，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。Tel: (0791)87118658 E-mail: yc_chen1020@163.com

岳鵬飛，男，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮录夹g(shù)與新產(chǎn)品開發(fā)。Tel: (0791)87118658 E-mail: ypfpharm@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]