Notch信號通路在骨肉瘤增殖、耐藥、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制

侯偉巖，曹云鵬， 孔令偉，紀(jì)海茹

骨肉瘤是一種原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率高、增長幅度快，多見于兒童和青少年。骨肉瘤好發(fā)于血運(yùn)豐富、生長迅速的骨骺區(qū)[1]。原發(fā)性骨肉瘤早期易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移[2]，肺是其最常見的轉(zhuǎn)移器官[3]。目前，綜合治療模式雖然使患者生存率有了一定的提高，而早期肺轉(zhuǎn)移依然導(dǎo)致患者預(yù)后較差。

Notch信號通路高度保守，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，參與腫瘤的增殖、浸潤轉(zhuǎn)移、血管生成、多藥耐藥等多種生物學(xué)行為，且調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已成為近期研究的熱點(diǎn)，深入剖析Notch信號通路在骨肉瘤中的作用機(jī)制，可給予其臨床治療方式的研究以新啟發(fā)。本文現(xiàn)對Notch信號通路與骨肉瘤的關(guān)系作一綜述。

1 Notch信號通路

Notch基因最早于1919年被提出，而Notch信號通路與骨肉瘤的研究始于2004年[4]，其與其他腫瘤細(xì)胞信號通路的不同之處在于具有抑癌和(或)致癌的雙重性，具體表現(xiàn)由Notch通路的強(qiáng)度、表達(dá)時機(jī)及細(xì)胞種類的不同來決定[5]。Notch信號通路包括4個受體(Notch1/2/3/4)、5個配體(DLL1/3/4、JAG1/2)和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子[6]。Notch信號通路激活以其受體與鄰近細(xì)胞上所表達(dá)的同源配體結(jié)合為起始，通過兩次蛋白酶水解切割后形成Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD。NICD由細(xì)胞質(zhì)膜釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在核內(nèi)與RBPJ結(jié)合，達(dá)到使下游轉(zhuǎn)錄因子活化表達(dá)的目的[7]。

2 Notch信號通路與骨肉瘤細(xì)胞增殖

Notch信號通路可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖，當(dāng)Notch信號通路被阻斷時可使骨肉瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。在體外實驗中，Engin等[8]通過對3例經(jīng)治療和7例未經(jīng)任何治療處理的骨肉瘤患者活檢標(biāo)本進(jìn)行檢測對比后，發(fā)現(xiàn)受體Notch1、配體Jagged1、靶基因Hes1、Hey2的表達(dá)均較野生型成骨細(xì)胞明顯增加，且在經(jīng)DAPT阻斷Notch信號通路后，骨肉瘤細(xì)胞增殖均受抑制；在體內(nèi)實驗中，Qin等[9]通過構(gòu)造骨肉瘤K7M2細(xì)胞系的小鼠脛旁腫瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，進(jìn)一步證明DAPT可通過抑制Notch激活來抑制Erk通路磷酸化，以有效抑制腫瘤生長、血管生成和肺轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高患者生存率；Li等[10-11]通過對二烯丙基三硫化物(DATS)和姜黃素在骨肉瘤中的作用進(jìn)行深入探究，發(fā)現(xiàn)大部分骨肉瘤細(xì)胞系中均有Notch1/2/3基因信號存在，且在Notch1與下游基因表達(dá)下調(diào)時，骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移被抑制。

2.1 γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch通路與骨肉瘤細(xì)胞增殖Notch信號通路的激活需要經(jīng)過3次酶切過程，第3次酶切過程位于S3酶切位點(diǎn)，由Notch通路中的關(guān)鍵酶γ-分泌酶進(jìn)行[12]，而γ-分泌酶抑制劑(GSI)可阻止該酶合成，從而使Notch通路不被激活。DAPT作為一種常見的人工合成GSI，對γ-分泌酶的阻斷作用具有特異性，可以阻止Notch信號通路的激活[13]。

游浩等[14]用不同濃度DAPT處理體外培養(yǎng)的MG-63骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Notch信號被阻斷時MG-63細(xì)胞增殖受限，并呈劑量、時間依賴性；實驗還發(fā)現(xiàn)，Notch1及其下游靶基因HES1的表達(dá)均下調(diào)，提示DAPT抑制MG-63細(xì)胞的增殖可能與Notch1、HES1下調(diào)有關(guān)。

2.2 Notch配體Jagged1與骨肉瘤細(xì)胞增殖腫瘤細(xì)胞的異常增殖與其細(xì)胞周期調(diào)控紊亂密切相關(guān)，Notch信號通路參與多種腫瘤的細(xì)胞周期調(diào)控，Jagged1作為Notch的重要配體，是Notch信號通路激活不可或缺的部分，其與Notch1受體的結(jié)合可促進(jìn)Notch信號通路的激活，在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)lncRNA MEG3的骨肉瘤細(xì)胞可顯著降低Jagged1與Notch1的表達(dá)水平，細(xì)胞增殖受限。Lu等[17]發(fā)現(xiàn)miR-26a可直接抑制Jagged1配體，進(jìn)而減少Notch信號通路激活來抵抗骨肉瘤的增殖。

3 Notch信號通路與骨肉瘤多藥耐藥

多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因，可能的機(jī)制包括腫瘤干細(xì)胞存活、藥物外排增加、藥物靶標(biāo)突變、DNA損傷修復(fù)、替代信號激活及細(xì)胞凋亡逃逸等[18]。Notch信號通路可通過減少細(xì)胞內(nèi)藥物積累、調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、導(dǎo)致microRNA失調(diào)和細(xì)胞凋亡基因的紊亂、調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞等方面，影響腫瘤的耐藥性[19]。以Notch信號通路為中心開展對骨肉瘤多藥耐藥的研究，探尋逆轉(zhuǎn)耐藥治療的手段，增強(qiáng)骨肉瘤對化療藥物的敏感性，對提高骨肉瘤患者的生存率具有重要的臨床意義。

3.1 骨肉瘤順鉑耐藥與Notch信號通路順鉑作為經(jīng)典鉑類藥物，最早于1970年引入骨肉瘤治療中，并已成為多種惡性腫瘤的一線化療藥物，其抑制腫瘤生長與Notch信號通路有關(guān)。劉蓋為等[20]用不同濃度的順鉑(2、4、6、8、10 μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞(1、2、3、4、5天)后，發(fā)現(xiàn)低濃度順鉑(≤4 μmol/L)處理48 h后會激活Notch信號通路，而高濃度順鉑(≥6 μmol/L且<8 μmol/L)處理48 h后會通過抑制Notch信號通路來抑制骨肉瘤生長，由此可見，順鉑對Notch信號通路的影響呈劑量和時間依賴性。也有研究證明，Notch目的基因的表達(dá)與化療敏感性呈負(fù)相關(guān)，即上調(diào)Notch信號通路可增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性[21]，因此可在適當(dāng)范圍內(nèi)提高化療藥物的濃度來降低骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性，起到更有效的治療效果。

骨肉瘤順鉑耐藥并非一成不變，其耐藥狀態(tài)可逆，給予骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞一個“藥物假期”，即停止用藥一段時間后發(fā)現(xiàn)Notch通路等因子的表達(dá)水平較骨肉瘤順鉑耐藥組明顯下降，說明藥物中斷可使骨肉瘤順鉑耐藥細(xì)胞再敏化，提示可通過間歇化療保證骨肉瘤細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性[22]。

3.2 骨肉瘤干細(xì)胞阿霉素耐藥與Notch信號通路阿霉素作為一種有效的一線抗腫瘤藥物，對實體腫瘤有著廣泛的活性譜[23]。阿霉素耐藥也是影響骨肉瘤療效及預(yù)后的重要因素。余玲等[24]證實骨肉瘤細(xì)胞具有阿霉素耐藥性，化療可富集骨肉瘤干細(xì)胞，他們發(fā)現(xiàn)耐阿霉素骨肉瘤干細(xì)胞中Notch受體胞內(nèi)段NICD1及靶基因表達(dá)量上調(diào)，說明Notch通路可富集阿霉素誘導(dǎo)的骨肉瘤干細(xì)胞；Notch通路被阻斷后，骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性提高，提示可通過抑制Notch通路提高阿霉素靶向殺傷骨肉瘤細(xì)胞的能力。

張義等[25]證實，沉默MG-63阿霉素耐藥株中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1的表達(dá)可阻斷Notch1通路的激活，提高對阿霉素的敏感性，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的耐藥。

3.3 骨肉瘤乏氧與Notch信號通路乏氧微環(huán)境是腫瘤耐藥的重要因素，順鉑等臨床常用化療藥物在乏氧狀態(tài)下MG-63骨肉瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50顯著高于常氧狀態(tài)[26]。乏氧與Notch信號通路存在相互作用關(guān)系，乏氧狀態(tài)下Notch-ICN、MRP1等蛋白的表達(dá)水平均較常氧狀態(tài)下顯著升高，表明MG-63細(xì)胞內(nèi)Notch信號通路被激活，利用siRNA干擾乏氧狀態(tài)下的Notch1后，MG-63細(xì)胞耐藥性明顯下降[27]。王淼等[28]發(fā)現(xiàn)，乏氧微環(huán)境與常氧環(huán)境相比，可明顯促進(jìn)MG-63細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與Notch信號通路相關(guān)蛋白HIF-1α、Notch1、Hes-1的表達(dá)；而在乏氧狀態(tài)下加入Notch1通路抑制劑DAPT后，MG-63細(xì)胞株的增殖與侵襲能力均較單獨(dú)乏氧條件下得到有效抑制，因此通過阻斷Notch1表達(dá)可改善骨肉瘤細(xì)胞在乏氧狀態(tài)下的多藥耐藥。

3.4 骨肉瘤內(nèi)耐藥因子與Notch信號通路減少細(xì)胞內(nèi)的藥物積累是調(diào)節(jié)腫瘤耐藥的一條重要途徑，ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette, ABC)介導(dǎo)的藥物外排與骨肉瘤多藥耐藥相關(guān)，MDR相關(guān)蛋白-1(MDR related protein-1, MRP1)(又名ABCC1)是ABC的主要靶點(diǎn)[29]。ABCC1高表達(dá)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞內(nèi)NICD和PSEN1(一種γ-分泌酶的催化劑，參與細(xì)胞內(nèi)Notch1蛋白的合成)的表達(dá)顯著增加，Notch通路激活后，可促使NICD/CBF1復(fù)合物形成，進(jìn)而降低ABCC1表達(dá)，從而使骨肉瘤細(xì)胞的藥敏性增強(qiáng)[30]。這也證明了上文中所提到的Notch1在乏氧狀態(tài)下參與骨肉瘤的多藥耐藥，其發(fā)生機(jī)制可能與MRP1等蛋白的表達(dá)水平提高有關(guān)的結(jié)論。

BCL蛋白家族由促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bad)和抗凋亡蛋白(BCL-2和BCL-xL)組成，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。通過慢病毒體外敲除BCL-2基因可顯著增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性；反之，敲除Bax基因可降低骨肉瘤細(xì)胞的化療敏感性[31]。吳德明等[32]通過用mNotch-1 shRNA干擾骨肉瘤細(xì)胞后，可有效地使BCL-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。Ye等[33]通過在其他腫瘤中沉默Notch1表達(dá)也得到了相似結(jié)果，并證實了Notch信號通路與BCL-2和Bax共同參與腫瘤化療敏感性的調(diào)節(jié)。

p53是目前被研究最為透徹的抑癌基因，被認(rèn)為是細(xì)胞基因組的看家基因，與生長停滯、衰老、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)等多種生物學(xué)行為關(guān)系密切。先天性p53基因失活所引起的Li-Fraumeni綜合征患者的骨肉瘤發(fā)病風(fēng)險要遠(yuǎn)比p53基因正常人群高[34]。突變型p53基因可通過上調(diào)促凋亡基因p21和Bax增加骨肉瘤耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性[35]。p53基因靶向激活Notch1信號通路，進(jìn)而通過Notch/Hes相關(guān)阻遏蛋白轉(zhuǎn)錄途徑抑制促凋亡基因叉頭框蛋白O3(forkheadbox O3, FOXO3)，抵抗由順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[36]，從而產(chǎn)生多藥耐藥。

4 Notch信號通路與EMT

癌癥致死的重要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移，而EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，EMT可使上皮細(xì)胞失去極性成為間充質(zhì)細(xì)胞，獲得遷移能力，侵襲周圍組織。E-鈣黏蛋白屬于細(xì)胞間的黏附因子，參與EMT的產(chǎn)生，該蛋白表達(dá)水平的下調(diào)會使細(xì)胞間黏附能力降低，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[37]。有研究證明，在眾多腫瘤的早期轉(zhuǎn)移中，EMT發(fā)揮重要作用，提示可研究如何抑制腫瘤細(xì)胞的EMT，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，以提高癌癥患者的生存率。

Su等[38]通過小干擾敲低ATG4A在骨肉瘤中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Notch1、Hes1表達(dá)均下調(diào)，E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，證明了ATG4A可通過激活Notch信號通路促進(jìn)骨肉瘤的EMT。

誘導(dǎo)啟動EMT的方式有多種，如乏氧可通過活化Notch通路的方式來促進(jìn)EMT、Notch配體與受體的結(jié)合激活Notch通路產(chǎn)生EMT、Notch1受體高表達(dá)誘導(dǎo)EMT的發(fā)生等。陳敬騰等[39]在體內(nèi)外實驗中敲除轉(zhuǎn)錄因子Slug后，可逆轉(zhuǎn)Notch通路誘導(dǎo)的EMT，進(jìn)而減弱骨肉瘤的轉(zhuǎn)移侵襲能力。

5 結(jié)語

Notch信號通路在胚胎發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、機(jī)體免疫調(diào)控及腫瘤等疾病的誘發(fā)產(chǎn)生過程中發(fā)揮著不可或缺的重要作用。在Notch信號通路對治療惡性腫瘤所具有的廣闊前景下，Notch信號通路已成為研究熱點(diǎn)。但有文獻(xiàn)報道[40]，在哺乳動物某些細(xì)胞中存在與RBPJ無關(guān)的信號，可使NICD與細(xì)胞質(zhì)蛋白或核轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用，這種Notch非典型信號通路在骨肉瘤中的作用研究甚少，可能會成為未來的一個研究方向。在對Notch信號通路與骨肉瘤的關(guān)系研究中，不同學(xué)者仍持有不同觀點(diǎn)，但我們堅信隨著對Notch信號通路研究的不斷深入，其具體作用機(jī)制將會被闡明，為Notch通路在骨肉瘤的臨床診療及預(yù)后提供理論依據(jù)。