中藥復(fù)方專利治療心力衰竭用藥規(guī)律及其核心藥物作用機(jī)制研究

鐘 勰，陳向云，張 瑤，詹家儀，彭 芳，唐文超，李堯鋒

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

心力衰竭是指由于心功能不全從而出現(xiàn)各種心臟循環(huán)障礙證候群的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致呼吸困難、心律失常、肺水腫等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還可引發(fā)心源性休克，是心臟疾病的終末階段[1]。心力衰竭治療方法的改善雖然提高了心力衰竭患者的生存率，降低了住院率，但預(yù)后仍不盡如人意，因其發(fā)病率高、死亡率高，是目前心血管疾病防治中亟待解決的問題之一[2]。

在心力衰竭的防治中，中醫(yī)藥因具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，在控制癥狀、降低病死率及再住院率等方面呈現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”的角度研究中藥，契合中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用的特點(diǎn)，也符合中醫(yī)理論中的“整體觀”和“辨證論治”思想。

本研究收集、整理、歸納了國家專利數(shù)據(jù)中治療心力衰竭的中藥復(fù)方，分析其配伍用藥規(guī)律，并應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)核心藥物作用機(jī)制進(jìn)行分析，探尋中醫(yī)藥治療心力衰竭的用藥規(guī)律及其藥物作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及檢索方法

登錄“中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局”網(wǎng)站(https：//www.cnipa.gov.cn/)，以 “心衰and中藥”及“心力衰竭and中藥”進(jìn)行檢索，專利公布時(shí)間為2002年1月-2021年2月，收集中藥復(fù)方專利。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入治療心力衰竭的相關(guān)中藥復(fù)方專利及中藥提取物專利，包含丸劑、散劑、膠囊、湯劑等劑型；排除食品、酒水及保健品類專利。將藥物組成相同的條目合并為1條。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范及錄入

以2020年版《中華人民共和國藥典》為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)規(guī)范[4]。將專利中出現(xiàn)的中藥及其藥性、藥味、歸經(jīng)、功效分類等數(shù)據(jù)錄入Excel，建立心力衰竭中藥復(fù)方數(shù)據(jù)庫，若有《中華人民共和國藥典》未收錄的藥物則參考2006年版《中藥大辭典》[5]。數(shù)據(jù)規(guī)范并錄入后再請(qǐng)兩人進(jìn)行兩次數(shù)據(jù)審核，將相異率控制在5%以下。

1.4 數(shù)據(jù)挖掘與統(tǒng)計(jì)

將中藥數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件中，進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)和藥物功效、性味、歸經(jīng)、主治證型等分析，統(tǒng)計(jì)不同證型的用藥頻次規(guī)律，并制作相關(guān)圖表。根據(jù)詞頻g指數(shù)閾值法篩選高頻藥物，使用SPSS Modeler軟件中的Apriori 算法，分析常用藥物的對(duì)藥及角藥配伍規(guī)律，構(gòu)建藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖并獲得核心藥物。

1.5 核心藥物活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，設(shè)置 ADME 參數(shù)(OB≥30%、DL≥0.18)，篩選核心藥物活性成分及相關(guān)作用靶點(diǎn)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.6 核心藥物治療心力衰竭靶點(diǎn)篩選

使用CTD(http：//ctdbase.org)、OMIM(https：//omim.org)、GeneCardes(https：//www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫篩選心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)。采用Venny分析將藥物活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到核心藥物治療心力衰竭的潛在靶點(diǎn)。

1.7 靶點(diǎn)蛋白互作分析及基因功能和通路富集分析

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件(https：//cytoscape.org/)中，構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用MCC算法篩選出核心靶點(diǎn)。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，設(shè)定閾值P<0.05。

1.8 藥物活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，并使用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)特征。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次統(tǒng)計(jì)

檢索出治療心力衰竭中藥復(fù)方專利161項(xiàng)，涉及中藥432味，復(fù)方中最多藥味數(shù)為51，最少藥味數(shù)為2，平均12味。頻次在5次及以上的中藥有78味，共出現(xiàn)1 270次，占總頻次的70.32%，為常用藥物；詞頻g指數(shù)閾值確定高頻藥物的臨界值為20.7[6]，頻次在21次及以上的中藥為高頻藥物，經(jīng)統(tǒng)計(jì)有18味。見表1。

表1 治療心力衰竭中藥復(fù)方專利常用藥物 (頻次≥5)

2.2 常用中藥功效、性味、歸經(jīng)分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，常用中藥功效分類涉及19類，累計(jì)頻次1 270次，占比較高的4類中藥為補(bǔ)氣藥(297次，23.39%)、活血藥(289次，22.76%)、利水滲濕藥(122次，9.61%)、溫里藥(81次，6.38%)，見圖1-A；常用中藥藥性有性溫、平、微寒、寒、微溫、涼、大熱、大寒和熱9種，以溫性(25次，32.05%)和平性(19次，24.36%)為主，見圖1-B；藥味有甘、苦、幸、酸、淡、澀和咸7種，以辛(52次，29.55%)、甘(50次，28.41%)和苦(45次，25.57%)為主，見圖1-C。常用中藥的歸經(jīng)主要以歸肝(36次，17.82%)、脾(36次，17.82%)、心(32次，15.84 %)、肺(31次，15.35%)、腎(29次，14.36%)、胃經(jīng)(22次，10.89%)為主，見圖1-D。

圖1 中藥復(fù)方治療心力衰竭常用藥物功效分類、藥性、藥味及歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)

2.3 復(fù)方專利主治證型及其常用藥物分析

依據(jù)《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)，將治療心力衰竭161首復(fù)方專利主治證型分為氣虛血瘀型、陽虛水泛型、氣陰兩虛型和喘脫危證型4類；其中以氣虛血瘀型(72次，44.72%)和陽虛水泛型(65次，40.37%)占比較多，主治證型及常用藥物頻次統(tǒng)計(jì)，見表2。

表2 復(fù)方專利主治證型及常用藥物頻次統(tǒng)計(jì)

2.4 藥物相關(guān)性分析

對(duì)常用藥物進(jìn)行Aprirori算法相關(guān)性分析，得到黃芪-丹參、黃芪-茯苓、黃芪-附子等10個(gè)支持度≥16%、置信度≥60%的高頻藥對(duì)，見表3；得到丹參-附子-黃芪、黃芪-葶藶子-茯苓、丹參-桂枝-黃芪等10個(gè)支持度≥12%、置信度≥60%的高頻角藥，見表4。通過構(gòu)建藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖并獲得復(fù)方專利治療心力衰竭核心藥物組黃芪-丹參-茯苓-附子，見圖2。

表3 治療心力衰竭復(fù)方高頻藥對(duì)

表4 治療心力衰竭復(fù)方高頻角藥

圖2 心力衰竭中藥復(fù)方藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心藥物黃芪、丹參、茯苓、附子治療心力衰竭潛在靶點(diǎn)篩選

本研究在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得黃芪活性成分20個(gè)，丹參活性成分65個(gè)，茯苓活性成分15個(gè)，附子活性成分21個(gè)，共121個(gè)，其作用靶點(diǎn)153個(gè)。在CTD、OMIM、GeneCardes數(shù)據(jù)庫中得到心力衰竭相關(guān)疾病靶點(diǎn)434個(gè)。兩者交集分析得到共同靶點(diǎn)43個(gè)，即黃芪、丹參、茯苓、附子等治療心力衰竭的潛在作用靶點(diǎn)。

2.6 核心藥物治療心力衰竭靶點(diǎn)蛋白互作分析

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)上述43個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，共涉及43個(gè)節(jié)點(diǎn)和346條邊，見圖3-A。運(yùn)用MCC算法找出該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，包括IL-6、TNF、VEGFA、CCL2、IL1B、MPO、PTGS2、MAPK1、TP53和MAPK14，見圖3-B。

2.7 核心藥物治療心力衰竭靶點(diǎn)GO和KEGG分析

應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)上述43個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG分析。GO分析顯示顯著富集的分子功能(molecular function)包含33個(gè)條目，包括蛋白結(jié)合(protein binding)、金屬離子結(jié)合(metal ion binding)等；生物過程( biological process )有234個(gè)條目，包缺氧應(yīng)答(Response to hypoxia)、血管生成(Angiogenesis)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory response)等；細(xì)胞組分( cellular component)有27個(gè)條目，包括細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol)、線粒體(Mitochondrion)等，見圖4-A。

KEGG分析結(jié)果顯示顯著富集的生物信號(hào)通路90條，包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)(Adrenergic signaling in cardiomyocytes)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)等與心力衰竭密切相關(guān)的信號(hào)通路，見圖4-B。

圖4 黃芪、丹參、茯苓、附子治療心力衰竭靶點(diǎn)GO富集分析與KEGG分析

2.8 核心藥物治療心力衰竭有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用Cytoscape軟件繪制核心藥物有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，涉及有效成分72個(gè)、靶點(diǎn)27個(gè)、信號(hào)通路12條。網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的活性成有槲皮素、山柰酚、木犀草素、丹參酮IIA、常春藤皂甙元、Deltoin等；度值靠前的靶點(diǎn)有PTGS2、NOS2、GSK3B等；度值靠前的通路有TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。見圖5。

圖5 黃芪、丹參、茯苓、附子治療心力衰竭有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，也是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[7]。本研究通過對(duì)161項(xiàng)治療心力衰竭的國家中藥復(fù)方專利進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)治療心力衰竭的常用藥物多為補(bǔ)氣藥、活血藥，其次是利水滲濕藥和溫里藥。藥物的性味歸經(jīng)顯示，心力衰竭用藥主要以溫藥、平藥居多，溫性藥在心力衰竭治療中應(yīng)用廣泛。五味中，心力衰竭用藥主要為辛味、甘味和苦味藥。高頻藥物以黃芪、丹參、茯苓和附子使用最多，其次是葶藶子、麥冬、桂枝、川芎、人參、當(dāng)歸等。

主治證型分析的結(jié)果顯示，中藥專利復(fù)方治療心力衰竭氣虛血瘀型以使用補(bǔ)氣藥黃芪與活血藥丹參頻次最高；陽虛水泛型以使用溫里藥附子與利水滲濕藥茯苓最多；氣陰兩虛型以使用補(bǔ)氣藥黃芪、利水滲濕藥茯苓和補(bǔ)陰藥麥冬最多；喘脫危證型以使用補(bǔ)氣藥人參和溫里藥附子頻次最高。可見心力衰竭的用藥配伍主要圍繞補(bǔ)氣藥搭配活血藥、溫里藥、利水滲濕藥等進(jìn)行組方遣藥，體現(xiàn)了益氣活血、溫陽利水法在治療心力衰竭中的運(yùn)用[8-9]。

本研究通過分析獲得高頻核心藥物組黃芪、丹參、茯苓、附子，其中黃芪的活性成分槲皮素、山柰酚，丹參的活性成分木犀草素、丹參酮IIA，茯苓的活性成分常春藤皂甙元，附子的活性成分Deltoin等均可能是其發(fā)揮作用的主要活性成分。槲皮素能降低心力衰竭患者血液中TNF-α、IkBα、IL-10和IL-1β的表達(dá)量[10]，預(yù)防血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌纖維化，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和遷移[11]。山柰酚可抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并預(yù)防血管緊張素II誘導(dǎo)的心室重構(gòu)[12]。木犀草素可調(diào)控STAT3、NF-κB、AP-1等因子發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[13]。丹參酮ⅡA能夠明顯抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)增和Ca2+的升高，抑制動(dòng)脈粥樣硬化、減少心肌細(xì)胞凋亡[14]。常春藤皂甙元能抑制巨噬細(xì)胞COX-2的活性，有明顯的抗炎功能，同時(shí)具有利尿作用[15]。Deltoin可調(diào)控心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)通路，同時(shí)有顯著的抗炎癥效果[16]。

核心藥物治療心力衰竭的核心靶點(diǎn)包括IL-6、TNF、VEGFA、MAPK14等。IL-6是在心力衰竭過程中顯著增高的炎性因子之一，可介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，降低心肌收縮功能，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[17]。TNF的過量表達(dá)可出現(xiàn)左心室射血分?jǐn)?shù)降低、主動(dòng)脈壓下降等心功能不全表現(xiàn)，TNF-α還能獨(dú)立誘發(fā)AT1受體上調(diào)，增強(qiáng)AngⅡ的纖維化作用[18]。VEGFA與心室重構(gòu)密切相關(guān)，可通過抗氧化、抗肥大、抗纖維化和促血管生成的作用改善心室重構(gòu)[19]。MAPK14(p38)參與了LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TNF-α表達(dá)的信號(hào)分子調(diào)控過程，可直接損傷細(xì)胞和組織并參與心肌細(xì)胞肥大的信號(hào)傳導(dǎo)過程[20]。

以往的實(shí)驗(yàn)研究指出，以黃芪、丹參、茯苓、附子為核心的中藥復(fù)方或中藥成分提取物在TNF信號(hào)通路[14，21-22]、PI3K-AKT信號(hào)通路[23-24]、HIF-1信號(hào)通路[25]、cGMP-PKG信號(hào)通路[26]、VEGF信號(hào)通路[27]、Toll樣受體信號(hào)通路[28]和鈣信號(hào)通路[29]等多種通路中均有顯著的作用，與KEGG通路分析得出的結(jié)果相同。故這些通路及其涉及的靶點(diǎn)可能是黃芪-丹參-茯苓-附子藥物組合在心力衰竭治療過程中發(fā)揮作用的有效通路與靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究基于國家專利數(shù)據(jù)庫，總結(jié)了中藥復(fù)方治療心力衰竭的用藥規(guī)律，以補(bǔ)氣活血、溫陽利水的配伍為主，挖掘出高頻核心藥物“黃芪、丹參、茯苓、附子”，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其作用機(jī)制，構(gòu)建了核心藥物有效成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，初步揭示了治療心力衰竭的作用機(jī)制，為臨床用藥及闡釋中醫(yī)藥對(duì)心力衰竭的治療機(jī)制提供參考。