長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)肺癌發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后評(píng)估作用的研究進(jìn)展*

陳 宇 綜述,張艷亮審校

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科/云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床研究中心/云南省臨床檢驗(yàn)診斷省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南昆明 650000

肺癌是指起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約為85%，是最常見的病理類型。長(zhǎng)期以來，肺癌都是世界范圍內(nèi)發(fā)病率極高的惡性腫瘤，且是癌癥患者死亡的最主要原因。2021年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌患者約占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的22%，5年生存率僅21%[1]。發(fā)病機(jī)制的闡明對(duì)肺癌的早期診斷及有效治療意義重大。近年來，lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用引起了研究人員的廣泛關(guān)注。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸、不具有或僅具有有限編碼功能的內(nèi)源性單鏈RNAs[2]。早期研究認(rèn)為lncRNA是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”“垃圾”?，F(xiàn)有研究表明異常表達(dá)的lncRNA可通過表觀遺傳調(diào)控、選擇性剪接、微小RNA(miRNA)樣分子等多種機(jī)制在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。因此，了解lncRNA影響肺癌發(fā)生、發(fā)展的研究進(jìn)展對(duì)評(píng)價(jià)lncRNA在肺癌診療中的潛在應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。

1 lncRNA作用機(jī)制概述

隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)，其中l(wèi)ncRNA約占68%[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)lncRNA具有小開放閱讀框，可以翻譯成具有生物活性的多肽[5]，如LINC00460在一定條件下可以編碼小肽，但其中的分子機(jī)制尚不清楚[6]。而絕大多數(shù)lncRNA雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但能通過轉(zhuǎn)錄前水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞生物學(xué)過程[7]。

1.1轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控 許多l(xiāng)ncRNA可以招募染色質(zhì)修飾復(fù)合物到特定DNA上，調(diào)節(jié)染色質(zhì)上的核小體定位或組蛋白修飾，實(shí)現(xiàn)從轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(lncRNA MALAT1)過表達(dá)能將染色質(zhì)修飾復(fù)合體招募到結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物2蛋白(TSC2)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而抑制TSC2基因轉(zhuǎn)錄[8]。一些lncRNA能通過表觀遺傳途徑影響基因前轉(zhuǎn)錄，甲基化是常見的表觀遺傳修飾方式。lncRNA MIR210HG能與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)結(jié)合，促進(jìn)電壓依賴性鈣通道的輔助亞基(CACNA2D2)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，抑制CACNA2D2基因表達(dá)[9]。lncRNA二肽基肽酶10的反義RNA1(DPP10-AS1)和蛋白編碼基因DPP10在肺癌中協(xié)同上調(diào)且二者存在4個(gè)共同的甲基化位點(diǎn)，DPP10-AS1可調(diào)節(jié)DPP10的甲基化狀態(tài)[10]。

1.2轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 基因轉(zhuǎn)錄的過程需要多種因子如轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、增強(qiáng)子等的參與，lncRNA能與這些因子結(jié)合并調(diào)控其活性，從而影響基因轉(zhuǎn)錄水平。lncRNA叉頭框蛋白C2的反義RNA1(FOXC2-AS1)能與轉(zhuǎn)錄因子FOXC2形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，增加FOXC2的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)ATP結(jié)合盒亞家族B成員1(ABCB1)基因表達(dá)[11]。也有研究表明在熱休克過程中，lncRNA可與RNA聚合酶Ⅱ直接接觸，抑制特定mRNA的轉(zhuǎn)錄[12]。

1.3轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 lncRNA能以堿基配對(duì)的方式與其他RNA或DNA特異性結(jié)合，且這種配對(duì)能發(fā)生在基因表達(dá)的任何時(shí)間點(diǎn)，因此lncRNA能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄、加工、編輯、翻譯或降解。lncRNA WT1-AS在NSCLC中表達(dá)下調(diào)，lncRNA尿路上皮癌原基因1(UCA1)在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，二者呈負(fù)相關(guān)。而WT1-AS的過表達(dá)使UCA1的表達(dá)受到抑制；UCA1可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而WT1-AS則通過下調(diào)UCA1并促進(jìn)p53表達(dá)抑制這些過程[13]。另外，lncRNA可以通過與miRNA的5′端序列結(jié)合，作為miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)，影響miRNA對(duì)下游mRNA的調(diào)節(jié)作用。lncRNA生長(zhǎng)抑制特異性基因(5GAS5)通過影響miR-23a的表達(dá)，從而調(diào)控自噬相關(guān)基因3(ATG3)表達(dá)[14]。類似地，miR-365也能靶向ATG3 mRNA的3′非編碼區(qū)，抑制其表達(dá)，而lncRNA漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1(PVT1)可作為miR-365的ceRNA降低其對(duì)mRNA的作用，從而上調(diào)ATG3基因表達(dá)[15]。

2 lncRNA在肺癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥的作用

近年來不斷有研究通過高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析等陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了眾多在肺癌中表達(dá)失調(diào)的lncRNA，這些lncRNA與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，且通過功能研究發(fā)現(xiàn)它們能夠影響肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)特性。

2.1lncRNA與肺癌的發(fā)生 肺癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，目前已發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在肺癌組織中差異表達(dá)，它們可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。張艷秋[16]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫和表達(dá)譜芯片分別篩選與肺癌相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA，并綜合分析篩選出11個(gè)異常表達(dá)的lncRNA。WANG等[17]對(duì)從高通量基因表達(dá)(GEO)數(shù)據(jù)庫篩選得到新的肺癌相關(guān)lncRNA AC079630.4，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其潛在功能，發(fā)現(xiàn)AC079630.4主要與細(xì)胞凋亡以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)信號(hào)通路相關(guān)，且經(jīng)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，AC079630.4過表達(dá)可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖和克隆，上調(diào)TRAIL受體的表達(dá)，因此AC079630.4在肺癌發(fā)生中起著抑制因子的作用。WANG 等[18]采用生物信息學(xué)方法篩選并在59對(duì)肺腺癌及癌旁組織中驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了3種表達(dá)上調(diào)且與患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)的lncRNA(CASC8、LINC01842、VPS9D1-AS1)。其中VPS9D1-AS1通過發(fā)揮ceRNA的功能，靶向miR-532-3p并正向調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白A2(HMGA2)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展[19]。

高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用為尋找與肺癌相關(guān)的lncRNA提供了便捷，但篩選出的許多l(xiāng)ncRNA具體功能和機(jī)制還不清楚。肺癌的發(fā)生可能涉及多種lncRNA，這些lncRNA是否存在以及如何發(fā)揮作用也尚未可知，仍需進(jìn)一步研究。

2.2lncRNA與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移 侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一大特征，也是腫瘤復(fù)發(fā)的最主要原因之一，且肺癌患者即使手術(shù)切除原發(fā)病灶后仍可能復(fù)發(fā)，這涉及多種生物學(xué)過程如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、血管生成等，而lncRNA可調(diào)節(jié)這些過程從而參與肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)是EMT過程的重要作用因子。肝細(xì)胞癌預(yù)后不良相關(guān)lncRNA(lncRNA AWPPH)在發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中顯著上調(diào)，并能促進(jìn)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，而抑制TGF-β1能減低AWPPH對(duì)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，提示AWPPH過表達(dá)可能通過激活TGF-β1信號(hào)通路參與EMT過程，促進(jìn)NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。lncRNA X-非活性特異轉(zhuǎn)錄物(XIST)在肺癌中過表達(dá)，可作為ceRNA下調(diào)miR-367/141的表達(dá)，從而增加E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB蛋白)的表達(dá)，促進(jìn)EMT過程[21]。LIU等[22]同樣對(duì)XIST進(jìn)行了研究，他們的結(jié)果顯示XIST通過影響細(xì)胞增殖發(fā)揮作用，敲低XIST后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量減少，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞存活率降低。類似地，lncRNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄物5(GAS5)也能同時(shí)影響細(xì)胞凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移。GAS5在肺癌中低表達(dá)，過表達(dá)GAS5可吸附miRNA-29-3p從而促進(jìn)抑癌基因磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)的表達(dá)，抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)蛋白磷酸化，進(jìn)而抑制靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡[23]。GAS5還能誘導(dǎo)EMT過程中上皮標(biāo)志蛋白E-鈣黏蛋白表達(dá)并抑制間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[24]。

目前研究顯示，lncRNA在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的確發(fā)揮重要作用，但其中的具體機(jī)制尚未完全闡明，不同研究人員對(duì)同一lncRNA進(jìn)行研究時(shí)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮生物學(xué)功能的途徑有所不同。這可能是由于同一種lncRNA在肺癌中發(fā)揮作用時(shí)可能存在多種途徑，最終都導(dǎo)致同樣的促癌或抑癌作用。

2.3lncRNA與肺癌耐藥 肺癌患者早期雖可手術(shù)切除治療，但事實(shí)上許多患者確診時(shí)已進(jìn)展到了中晚期，沒有手術(shù)指征或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，仍需靶向治療或化療?？拱┧幍氖褂们捌陔m取得了一定的臨床療效，但患者卻也逐漸產(chǎn)生了耐藥性，這一過程lncRNA也參與其中。

順鉑是目前應(yīng)用于晚期肺癌的標(biāo)準(zhǔn)抗癌藥，順鉑的抗腫瘤作用主要是通過與DNA結(jié)合形成復(fù)合物，阻礙其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并激活各種信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。lncRNA能影響這些通路從而參與耐藥。如AKT/mTOR信號(hào)通路的激活可抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖[26]。lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)可激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞耐藥[27]。miR-101-3p的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感，且能有效抑制糖酵解，而lncRNA XIST可作為miR-101-3p的ceRNA，顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的糖酵解，從而介導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥[28]。有研究表明自噬也可改變NSCLC細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[29]。lncRNA膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(BLACAT)就通過調(diào)節(jié)自噬參與順鉑耐藥，它作為ceRNA下調(diào)miR-17的表達(dá)，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)自噬，參與順鉑耐藥[30]。另外，除了順鉑，lncRNA也可誘導(dǎo)其他藥物的耐藥，如lncRNA代謝誘導(dǎo)的腫瘤激活因子1(MITA1)通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬促進(jìn)吉非替尼耐藥[31]。

總之，lncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等參與NSCLC患者耐藥的發(fā)生，對(duì)這些作用機(jī)制研究有助于尋找防止耐藥發(fā)生的新方法。

3 lncRNA在肺癌診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

3.1lncRNA作為生物標(biāo)志物診斷肺癌 目前臨床診斷肺癌主要依靠支氣管鏡檢、病理活檢、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)和影像學(xué)檢查。但肺癌患者早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，影像學(xué)表現(xiàn)難以與炎癥、結(jié)核等區(qū)別，且放射性物質(zhì)對(duì)機(jī)體有害。支氣管鏡檢和病理活檢雖可作為金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有侵襲性，患者依從性不高。而目前的腫瘤標(biāo)志物由于靈敏度、特異度不高，診斷效能有限。因此探尋有效的早期診斷標(biāo)志物仍是肺癌研究中的一大問題。

某些lncRNA能穩(wěn)定地存在于人的血清或血漿中[32]，這為lncRNA作為肺癌的診斷標(biāo)志物提供了可能。XIE等[33]構(gòu)建了由lncRNA SOX2重疊轉(zhuǎn)錄本(SOX2OT)、INK4基因座的一種反義非編碼RNA(ANRIL)與常規(guī)肺癌標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)聯(lián)合診斷NSCLC的診斷模型，其診斷效能明顯優(yōu)于單獨(dú)使用一種標(biāo)志物；不僅如此，該研究還驗(yàn)證了血清經(jīng)過室溫孵育不同時(shí)間以及反復(fù)凍融不同次數(shù)后SOX2OT和ANRIL的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示SOX2OT和ANRIL的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。TBILA和AGAP2-AS1可能作為NSCLC的潛在診斷標(biāo)志物，雖然與單獨(dú)檢測(cè)相比，二者聯(lián)合檢測(cè)不能提升診斷效能，但與CYFRA21-1聯(lián)合檢測(cè)能提高準(zhǔn)確性[34]，可這項(xiàng)研究并未驗(yàn)證TBILA和AGAP2-AS1在血清中的穩(wěn)定性。除了尋求血清中游離lncRNA，研究人員也在努力探索血細(xì)胞中的lncRNA作為標(biāo)志物的可能性。在腫瘤發(fā)展過程中，血小板受到癌細(xì)胞的影響可改變其分子表達(dá)，肺癌和早期肺癌患者血小板中的lncRNA linc-GTF2H2-1和RP3-466P17.2都顯著下調(diào)，而ST8SIA4-12顯著上調(diào)，將三者聯(lián)合檢測(cè)比單獨(dú)檢測(cè)對(duì)肺癌和早期肺癌的診斷效能均有提高；此外，聯(lián)合檢測(cè)linc-GTF2H2-1和CEA、CYFRA21-1、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)能有效鑒別早期和晚期肺癌[35]。

由此可見，就診斷效能來說，lncRNA有望成為新的肺癌診斷標(biāo)志物，且與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物或多種lncRNA聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)。但lncRNA畢竟是RNA的一種，由于RNA酶的廣泛存在，不能保證血清中所有游離lncRNA均穩(wěn)定存在，因此在將其作為診斷標(biāo)志物前還需要驗(yàn)證其穩(wěn)定性。另外，血細(xì)胞如血小板中也存在可能作為診斷標(biāo)志物的lncRNA，這為發(fā)掘新的肺癌標(biāo)志物提供了新思路。

3.2lncRNA與肺癌預(yù)后相關(guān) 肺癌患者預(yù)后差主要是由于早期不易確診、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、化療耐藥等，因此與侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制相關(guān)的lncRNA都可能與預(yù)后密切相關(guān)。預(yù)后差的肺癌患者通常TNM分期較晚，且已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，許多l(xiāng)ncRNA與這些臨床病理特征相關(guān)，可能是肺癌預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

例如，lncRNA PVT1在肺癌中表達(dá)上調(diào)，與PVT1低表達(dá)相比，高表達(dá)的肺癌患者預(yù)后更差[36]。lncRNA DLX-AS高表達(dá)與肺癌細(xì)胞分化程度及TNM分期顯著相關(guān)[37]。lnRNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子亞基β1-內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(GABPB1-IT1)在NSCLC患者中低表達(dá)，且TNM分期高者較分期低者表達(dá)水平更低，而高表達(dá)者的總體生存率高于低表達(dá)者，提示GABPB1-IT1可能作為NSCLC患者的預(yù)后標(biāo)志物[38]。

這些研究說明，lncRNA與肺癌患者預(yù)后具有一定相關(guān)性，尋找與肺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征相關(guān)的lncRNA并應(yīng)用于臨床監(jiān)控將有助于及時(shí)評(píng)估患者預(yù)后。

4 小結(jié)與展望

近年來，基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展逐步成熟，在肺癌中表達(dá)失調(diào)的lncRNA越來越多地被發(fā)現(xiàn)。但對(duì)于這些lncRNA的功能機(jī)制研究就相對(duì)滯后，絕大多數(shù)與肺癌相關(guān)的lncRNA的生物學(xué)效應(yīng)尚未了解完全，以及是否能用于臨床診斷和預(yù)后判斷也需要經(jīng)過大量驗(yàn)證。但毋庸置疑的是，lncRNA與肺癌關(guān)系密切，是肺癌潛在的生物標(biāo)志物，相信隨著研究的深入，lncRNA能為肺癌的診療及預(yù)后判斷提供新途徑。