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    罕見(jiàn)IVS Ⅱ-705(T>G) β-地中海貧血基因攜帶者2例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)*

    2022-11-21 02:08:14黃心怡
    關(guān)鍵詞:血液學(xué)基因突變表型

    黃心怡,林 靖

    1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,四川成都 611137;2.貴州省人民醫(yī)院輸血科,貴州貴陽(yáng) 550002

    β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱β-地貧)是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的一種遺傳性溶血性貧血病,臨床表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血。β-地貧是由于β-珠蛋白(HBB)基因突變導(dǎo)致β-珠蛋白肽鏈缺如(β0)或合成不足(β+)引起的常染色體隱性遺傳病[1-2]。到目前為止,在人類血紅蛋白(Hb)變異和地中海貧血數(shù)據(jù)庫(kù)(HbVar:https://globin.bx.psu.edu/)中收錄的β-地貧突變類型有300多種。不同地域和人群之間的β-地貧基因突變譜存在較大差異。目前在中國(guó)人群中已發(fā)現(xiàn)129種HBB基因點(diǎn)突變(含異常Hb)和16種β-地貧缺失突變。其中8種突變(c.124_127delTTCT、c.52A>T、c.316-197C>T、c.-78A>G、c.216_217insA、c.79G>A、c.92+1G>T、c.-79A>G)占中國(guó)人β-地貧突變總體的95%以上[3]。隨著測(cè)序技術(shù)在臨床上的廣泛運(yùn)用,一些罕見(jiàn)突變類型也不斷被發(fā)現(xiàn),為臨床遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了更多的依據(jù)[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)了2例罕見(jiàn)IVS Ⅱ-705(T>G) β-地貧攜帶者,現(xiàn)對(duì)其臨床表型及基因型進(jìn)行分析。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 2例患兒之間無(wú)血緣關(guān)系,患兒1為女性,年齡10個(gè)月;患兒2為男性,2歲?;純涸谫F州省人民醫(yī)院血常規(guī)檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)有小細(xì)胞低色素貧血表現(xiàn),Hb電泳發(fā)現(xiàn)HbA2升高,需進(jìn)一步做β-地貧基因檢測(cè)。經(jīng)家屬知情同意后抽取乙二胺四乙酸二鉀抗凝外周靜脈血2 mL。

    1.2主要儀器與試劑 Sysmex XN-9000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑;法國(guó)Sebia毛細(xì)管電泳儀及配套試劑;天隆NP968核酸自動(dòng)提取儀,E-Cycler TM 96 PCR擴(kuò)增儀;β-地貧基因突變檢測(cè)試劑盒由凱普生物科技有限公司提供。

    1.3方法

    1.3.1血液學(xué)檢測(cè) 在儀器最佳狀態(tài)下檢測(cè)標(biāo)本,嚴(yán)格按照操作程序檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、Hb水平、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度的標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)等紅細(xì)胞參數(shù)。采用Sebia毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)HbA、HbA2、HbF等Hb成分的相對(duì)水平。

    1.3.2β-地貧基因檢測(cè) 采用PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交(RBD-PCR)技術(shù)[6],檢測(cè)17種HBB基因點(diǎn)突變,依次為CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD17(A>T)、-28(A>G)、CD26(G>A)、CD71-72(+A)、CD43(G>T)、-29(A>G)、Int(T>G)、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、-32(C>A)、-30(T>C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、IVS-Ⅰ-5(G>C)、CD31(-C)、CAP +40-+43(-AAAC)。對(duì)罕見(jiàn)β-地貧基因突變類型,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBB基因全長(zhǎng),引物序列為F:5′-ACGGCTGTCATCACTTAGAC-3′,R:5′-CTCCCACATTCCCTTTTTAG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GeneBank上的HBB基因參考序列進(jìn)行比對(duì)分析測(cè),查找是否存在其他罕見(jiàn)突變類型。

    2 結(jié) 果

    2.1血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 2例患兒的血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為輕度小細(xì)胞低色素貧血,MCV、MCH降低,血紅蛋白電泳HbA2水平升高,HbF水平輕度升高,提示為輕型β-地貧(攜帶者)。見(jiàn)表1。

    表1 2例患兒的血液學(xué)表型結(jié)果

    2.2基因檢測(cè)結(jié)果 2例患兒均未檢出17種中國(guó)人群常見(jiàn)的β-地貧基因突變類型。經(jīng)HBB基因序列分析,發(fā)現(xiàn)2例患兒均為HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合突變,國(guó)際命名法(HGVS name)為HBB:c.316-146T>G。該突變?yōu)镠BB基因第二個(gè)內(nèi)含子的705號(hào)堿基T突變?yōu)镚,為致病性突變,臨床表型為β+。見(jiàn)圖1。IVS Ⅱ-705(T>G)突變形成的異常HBB基因mRNA剪接體見(jiàn)圖2。

    注:A、B分別為患兒1、患兒2的HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合突變(箭頭所示為突變基因位點(diǎn))。圖1 2例患兒HBB基因測(cè)序結(jié)果

    注:標(biāo)識(shí)508的箭頭為IVS Ⅱ-508位點(diǎn),潛在的3′剪接受體;標(biāo)識(shí)705的箭頭為IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點(diǎn),產(chǎn)生5′剪接位點(diǎn)。圖2 IVS Ⅱ-705(T>G)突變引起異常剪接示意圖

    3 討 論

    β-地貧是一種遺傳異質(zhì)性較大的溶血性貧血病,已發(fā)現(xiàn)的HBB基因突變類型有800多種,其中致病性突變有300多種。不同地域和人群的β-地貧基因突變譜存在較大差異。盡管我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)β-地貧基因突變類型基本一致,但不同地區(qū)最常見(jiàn)的突變類型有所不同,如廣東、廣西以CD41-42(-TCTT)最為常見(jiàn),福建、江西以IVS-Ⅱ-654(C>T)最為常見(jiàn),貴州、重慶以CD17(A>T)最為常見(jiàn),云南以CD26(G>A)最為常見(jiàn)[7]。目前國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室常用β-地貧基因檢測(cè)方法可檢出中國(guó)人群常見(jiàn)的17種突變類型,但不能檢測(cè)到罕見(jiàn)的突變類型,在臨床應(yīng)用上具有一定的局限性。

    本研究中的2例患兒均表現(xiàn)為輕度小細(xì)胞低色素性貧血,且Hb電泳HbA2升高,為典型的輕型β-地貧表型。采用常用的β-地貧基因檢測(cè)方法未檢測(cè)出中國(guó)人群常見(jiàn)的17種突變類型,考慮可能存在罕見(jiàn)β-地貧基因類型。采用Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)2例患兒均為HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者。在HbVar數(shù)據(jù)庫(kù)的收錄信息顯示為致病性突變,臨床表型為β+。2例患兒的基因型與表型一致,診斷輕型β-地貧明確。

    IVS Ⅱ-705(T>G)是一種非常罕見(jiàn)的β-地貧基因突變類型,最早是由美國(guó)學(xué)者M(jìn)AQUAT等[8]于1980年報(bào)道。隨后,DOBKIN等[9]研究發(fā)現(xiàn),IVS Ⅱ-705(T>G)突變導(dǎo)致了在HBB基因IVS Ⅱ內(nèi)產(chǎn)生了一個(gè)新的功能性的5′剪接位點(diǎn)GAG GTA AGA,與IVS Ⅱ正常的3′剪接受體之間產(chǎn)前一個(gè)潛在的剪接體。同時(shí),IVS Ⅱ-705(T>G)突變還激活了IVSⅡ第508位潛在的3′剪接受體,與IVS Ⅱ正常的5′剪接供體之間產(chǎn)前異常剪接。因此,IVS Ⅱ-705(T>G)突變阻止了IVS Ⅱ正常的5′剪接位點(diǎn)與3′剪接受體之間的剪接,從而形成異常的HBB基因mRNA剪接體(圖2)。

    國(guó)內(nèi)外對(duì)IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點(diǎn)的報(bào)道很少。國(guó)內(nèi)僅JIANG等[10]在廣東的一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)2例IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者,紅細(xì)胞參數(shù)均表現(xiàn)為MCV、MCH降低,HbA2升高,其中1例有輕度貧血。MURAD等[11]在一個(gè)敘利亞家系中發(fā)現(xiàn)2例IVS-Ⅰ-1(G>A)/IVS-Ⅱ-705(T>G)復(fù)合雜合患者,臨床表現(xiàn)為重型β-地貧,Hb分別為46 g/L和52 g/L。本研究發(fā)現(xiàn)的2例IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者均表現(xiàn)為輕度小細(xì)胞低色素貧血。因此,IVS Ⅱ-705(T>G)突變攜帶者臨床上表現(xiàn)為輕型β-地貧,多數(shù)有輕度貧血。當(dāng)IVS Ⅱ-705(T>G)突變合并有其他β-地貧基因突變位點(diǎn)時(shí),可表現(xiàn)為重型或中間型β-地貧。其他人群中尚未見(jiàn)該突變位點(diǎn)報(bào)道。本研究在貴州地區(qū)發(fā)現(xiàn)較罕見(jiàn)的IVS Ⅱ-705(T>G)突變。

    IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點(diǎn)不在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室β-地貧基因突變檢測(cè)的位點(diǎn)范圍內(nèi),容易造成漏診。為提高β-地貧基因突變檢測(cè)的靈敏度,需要結(jié)合患者的血液學(xué)表型和基因型進(jìn)行綜合分析。經(jīng)血液學(xué)表型檢查提示為β-地貧,但常規(guī)方法檢測(cè)為陰性的樣本,需要進(jìn)一步采用Sange測(cè)序和MLPA技術(shù)等二線技術(shù)檢測(cè)罕見(jiàn)的HBB基因點(diǎn)突變和大片段缺失突變。此外,有條件的實(shí)驗(yàn)室也可采用二代測(cè)序(NGS)技術(shù)直接檢測(cè)β-地貧基因突變。有研究報(bào)道NGS可將地中海貧血高風(fēng)險(xiǎn)夫婦基因突變的檢出率提高到23.2%[12-13]。盡管NGS檢測(cè)β-地貧基因的靈敏度很高,尤其是提高了罕見(jiàn)突變類型的檢測(cè)率,但仍存在一些不能檢出的位點(diǎn)。由于檢測(cè)過(guò)程中還存在其他影響因素,任何一種檢測(cè)方法均存在假陰性的可能。因此,臨床上仍然要重視β-地貧表型分析,當(dāng)表型與基因型不一致時(shí),需要重新檢測(cè)或采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)以避免假陰性的發(fā)生。

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