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    血清NK細(xì)胞活化性受體、γ干擾素與非小細(xì)胞肺癌患者病情程度、預(yù)后的相關(guān)性分析*

    2022-12-25 10:05:18李艷光宋翔牛潔婷唐國杰
    關(guān)鍵詞:期組清液標(biāo)志物

    李艷光,宋翔,牛潔婷,唐國杰

    (滄州市中心醫(yī)院 胸外科,河北 滄州 061000)

    非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)在原發(fā)性肺癌中最常見,發(fā)生率約為80%~85%,其中75%左右的患者確診時(shí)已處于中晚期,預(yù)后較差[1]。手術(shù)是目前治療肺癌的主要方式,早期診斷、準(zhǔn)確分期是保障療效的前提。臨床至今尚缺乏檢測NSCLC 敏感性較高的指標(biāo),比較常見的包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片 段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(sguamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)等腫瘤標(biāo)志物[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn),機(jī)體T 淋巴細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答是控制腫瘤生長、殺滅腫瘤細(xì)胞的重要途徑。γ 干擾素(Interferon γ,IFN-γ)是由CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群Th1 分泌,能激活效應(yīng)細(xì)胞,提高自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK cell)、巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞等活性,通過免疫機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞[3]?,F(xiàn)代免疫學(xué)研究提出,機(jī)體處于應(yīng)激或感染狀態(tài)下,體內(nèi)一些細(xì)胞受體可產(chǎn)生相關(guān)的分子調(diào)節(jié)免疫功能[4]。NK細(xì)胞活化性受體(NKG2D)是對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)最有效的受體之一,廣泛表達(dá)于NK 細(xì)胞、γ 細(xì)胞中。有研究指出,NKG2D 可通過免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,從而影響機(jī)體免疫狀態(tài)[5]。目前國內(nèi)外針對(duì)NKG2D、IFN-γ 與NSCLC 相關(guān)性的研究不多。本研究探討血清NKG2D、IFN-γ水平與NSCLC 患者病情程度、預(yù)后的相關(guān)性,旨在尋找更有效、準(zhǔn)確的預(yù)測指標(biāo)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    本研究屬于前瞻性研究,且獲得滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。選取滄州市中心醫(yī) 院2020 年5 月—2021 年5 月收治 的NSCLC 患者150 例為研究對(duì)象,根據(jù)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ期組50 例,Ⅲ、Ⅳ期組100 例。Ⅰ、Ⅱ期組男性34 例,女性16 例;年齡39~70 歲,平均(54.69±7.94)歲;病理類型:鱗狀細(xì)胞癌13 例,腺癌21 例,腺鱗癌16 例。Ⅲ、Ⅳ期組男性71 例,女性29 例;年齡38~72 歲,平均(54.87±8.12)歲;病理類型:鱗狀細(xì)胞癌27 例,腺癌43 例,腺鱗癌30 例。兩組患者臨床資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南(2018 版)》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn),并有明確的病理結(jié)果;均為原發(fā)性肺癌;年齡>18 歲;在初次治療前有血清指標(biāo)檢測結(jié)果;造血功能正常;患者對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):造血功能異常;心肝腎臟器功能不正常;有嚴(yán)重感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾?。挥谢熁虬邢蛑委熓?。

    1.2 方法

    1.2.1 儀器與試劑 FACSC Calibur 型流式細(xì)胞儀(美國BD 公司),Centrifuge 5430 高速冷凍離心機(jī)、微量移液器(德國Eppendorf 公司),海爾DW-86L288 型(上海領(lǐng)德儀器有限公司),UniCel DxI 800 Access 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)。鼠免疫球蛋白(Immunoglobulin G,lgG)、鼠抗人抗NKG2D PERCP-CY5.5 抗體、鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD8-PE-CY7、鼠抗人CD56-PE、細(xì)胞因子刺激劑、細(xì)胞固定破膜劑(美國CST 生物科技有限公司),96 孔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)板(美國R&D公司),F(xiàn)icoll 淋巴細(xì)胞分離液(北京Solarbio 化學(xué)試劑公司),ELISA 試劑盒(武漢中美科技公司)。

    1.2.2 標(biāo)本采集 取患者入院時(shí)的外周靜脈血4 mL,3 000 r/min 離心15 min,取上清液分裝于1.5 mL 的EP 管中,置入-80℃冰箱冷凍保存待測。

    1.2.3 NKG2D檢測 取樣本加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻移至15 mL 離心管中,加入等體積的Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液;20℃、2 400 r/min 離心30 min,輕吸單個(gè)核細(xì)胞層,PBS 液100 r/min 離心10 min,洗滌2 次,棄上清液;用適量PBS 液重懸細(xì)胞,混勻注入新離心(EP)管;加入小鼠IgG 10 μg/mL,40℃孵育30 min,排除假陽性;分別加入20 μL 的NKG2D PERCY-CY5.5 抗 體、CD3-FITC、CD56-PE,4℃避光反應(yīng)30 min,1 000 r/min 離心10 min,棄上清液,PBS 液洗滌2 次,移至流式管;加入4% 0.5 mL 多聚甲醛,采用流式細(xì)胞儀檢測488 nm 波長處NKG2D水平。

    1.2.4 IFN-γ 水平檢測 取樣本EDTA 抗凝處理,混勻,分裝于2 個(gè)流式管中,加入30 μL 的外周血、2 μL 的細(xì)胞因子刺激劑、1 mL 1640 培養(yǎng)基,混勻,37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6 h;1 500 r/min離心3~5 min,棄上清液;加入100 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞;加入適量CD3-FITC、CD8-PE-CY7,4℃避光孵育30 min;再加入500 μL 的1640 培養(yǎng)基,洗滌2 次,1 500 r/min 離心3~5min,棄上清液;加入100 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,再加入細(xì)胞固定破膜劑,4℃20 min;加入500 μL 的1×perm/wash buffer 洗滌,1 500 r/min 離心3~5 min,重復(fù)2 次,棄上清液;加入500 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測IFN-γ 水平。

    1.2.5 腫瘤標(biāo)志物水平檢測 采用UniCel DxI 800 Access 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測CEA、CA125、CYFRA21-1 水平。

    1.2.6 預(yù)后情況 采用門診復(fù)查、電話隨訪等方式,記錄患者6 個(gè)月內(nèi)的病死率。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn);繪制ROC 曲線;相關(guān)性分析用Pearson 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較

    兩組患者血清NKG2D、IFN-γ 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期組NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期組,IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期組。見表1。

    表1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較()

    表1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較()

    2.2 兩組患者的腫瘤標(biāo)志物水平比較

    兩組患者的血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期組CEA、CA125、CYFRA21-1 高于Ⅰ、Ⅱ期組。見表2。

    表2 兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較()

    表2 兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較()

    2.3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

    Pearson 相關(guān)分析顯示,血清NKG2D 與CEA(r=-0.683)、CA125(r=-0.615)、CYFRA21-1(r=-0.704)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);IFN-γ 與CEA(r=0.512)、CA125(r=0.439)、CYFRA21-1(r=0.543)均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

    表3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

    2.4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較

    150 例NSCLC 患者總病死率為22.67%(34/150)。Ⅲ、Ⅳ期組6 個(gè)月內(nèi)病死率為28.00%(28/100),Ⅰ、Ⅱ期組6 個(gè)月內(nèi)病死率為12.00%(6/50),經(jīng)χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.868,P=0.027)。死亡組與非死亡組血清NKG2D、IFN-γ 比較,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),死亡組NKG2D 低于非死亡組,IFN-γ 高于非死亡組。見表4。

    表4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較()

    表4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較()

    2.5 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測效能

    ROC 曲線分析結(jié)果顯示,IFN-γ、NKG2D 及兩者聯(lián)合預(yù)測NSCLC 患者預(yù)后的AUC 分別為0.807(95% CI:0.673,0.942)、0.815(95%CI:0.675,0.955)、0.872(95% CI:0.761,0.984),敏感性分別為78.1%(95% CI:0.648,0.892)、82.6%(95% CI:0.713,0.955)、86.5%(95% CI:0.752,0.978),特異性 為51.3%(95% CI:0.443,0.714)、53.6%(95% CI:0.467,0.735)、41.5%(95% CI:0.328,0.616)。見 圖1和表5。

    圖1 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后預(yù)測價(jià)值的ROC曲線圖

    表5 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后預(yù)測的效能分析

    3 討論

    腫瘤細(xì)胞是一群生長調(diào)控機(jī)制失常且可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的自身細(xì)胞[7]。T 淋巴細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答、抑制腫瘤生長的重要免疫細(xì)胞,根據(jù)T 細(xì)胞受體類型和表面標(biāo)志可分為CD4+和CD8+兩個(gè)亞群。CD4+T 細(xì)胞主要是通過激活并釋放效應(yīng)細(xì)胞,增強(qiáng)清除腫瘤細(xì)胞的能力,在抗原特異性免疫過程中,CD4+T 細(xì)胞釋放的IFN-γ 作用于腫瘤細(xì)胞,可誘導(dǎo)多種抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHC-I 類分子,提高靶細(xì)胞對(duì)CD8+T 細(xì)胞的敏感性,同時(shí)還能刺激B 細(xì)胞增殖、產(chǎn)生抗體,通過體液免疫途徑抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制[8]。CD4+T 細(xì)胞亞群按照分泌的細(xì)胞因子與介導(dǎo)的功能不同又分為Th1 和Th2 細(xì)胞。Th1 主要分泌IFN-γ、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β),Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-10,分別具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用[9]。NSCLC 表面表達(dá)的腫瘤抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別后,可通過以上免疫機(jī)制產(chǎn)生免疫應(yīng)答,攻擊并抑制腫瘤生長[10]。

    既往國內(nèi)外研究關(guān)于IFN-γ 的研究較多,NK 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等均有產(chǎn)生IFN-γ 的能力,此效應(yīng)細(xì)胞能夠激活多條信號(hào)途徑,其中被廣泛認(rèn)知的有JAK-STAT 途徑[11]。PAN 等[12]研究顯示,IFN-γ-JAK-STAT 信號(hào)通路可促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。不過IFN-γ 在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面還具有一定爭議性。KANAI 等[13]研究指出,非進(jìn)展期NSCLC 的IFN-γ 水平顯著高于進(jìn)展期NSCLC。本研究結(jié)果顯示,Ⅲ、Ⅳ期組IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期組,提示血清IFN-γ 水平與NSCLC 患者的分期與病情有關(guān)。其原因可能為:①IFN-γ 可通過激活并增強(qiáng)NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等活力,從而調(diào)節(jié)免疫,增強(qiáng)抗腫瘤能力[14];②IFN-γ 可抑制癌基因表達(dá),延緩腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程;③IFN-γ 可增強(qiáng)TNF 的分泌、加強(qiáng)MHC-II 類抗原的表達(dá)、上調(diào)TNF 受體進(jìn)而促進(jìn)殺傷性T 細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞[15];④IFN-γ 還可通過負(fù)性調(diào)控腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞功能,如纖維細(xì)胞中的SMAD 信號(hào)通路,抑制成纖維細(xì)胞牽拉腫瘤細(xì)胞群而導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

    NKG2D 最早被發(fā)現(xiàn)是NK 細(xì)胞表面主要的激活性受體,隨后不斷深入研究發(fā)現(xiàn),NKG2D 還廣泛表達(dá)于γ、δ、T 細(xì)胞等絕大多數(shù)免疫細(xì)胞上,在天然免疫中發(fā)揮著重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示,Ⅲ、Ⅳ期組NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期組,NKG2D 異常降低與NSCLC 患者病情有關(guān)。張靖悅等[18]研究指出,Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者NKG2D 明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者,與本研究結(jié)論相似。分析原因?yàn)椋孩貼KG2D 可通過固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,進(jìn)以影響機(jī)體的免疫功能[19];②NKG2D 可通過與應(yīng)激細(xì)胞表面的配體結(jié)合,傳遞細(xì)胞活化信號(hào),激活效應(yīng)細(xì)胞,發(fā)揮殺害腫瘤細(xì)胞的作用[20];③NKG2D 可與許多配體結(jié)合,如NK 細(xì)胞與其配體MIC-A 結(jié)合,可刺激前者表達(dá)NKG2D,發(fā)揮對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視作用[21];④NKG2D與配體MIC 可同時(shí)刺激CD3+CD4+與CD3+CD8+NKG2 D 細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)免疫。

    CEA、CA125、CYFRA21-1 是臨床比較常見的腫瘤標(biāo)志物,通常用于評(píng)估腫瘤的療效及預(yù)后判斷中。Pearson 相關(guān)性顯示,以上3 項(xiàng)指標(biāo)與NKG2D 呈負(fù)相關(guān),與IFN-γ 呈正相關(guān),兩者對(duì)評(píng)估NSCLC 患者病情程度具有一定價(jià)值。LEE 等[22]研究指出,NSCLC 患者血清IFN-γ 水平較高,可有效預(yù)測NSCLC 的無進(jìn)展生存期。OKITA 等[23]研究顯示,NKG2D 配體表達(dá)水平可以預(yù)測NSCLC 患者的臨床病理學(xué)特征和預(yù)后。本研究ROC 曲線顯示,IFN-γ、NKG2D 及兩者聯(lián)合預(yù)測NSCLC 患者預(yù)后的AUC 分別為0.807、0.815 和0.872,具有較高預(yù)測效能。由此可見,檢測NKG2D、IFN-γ 能夠更好地了解NSCLC的發(fā)生發(fā)展,為預(yù)后提供參考依據(jù)。

    綜上所述,血清NKG2D、IFN-γ 與NSCLC 患者病情程度與腫瘤標(biāo)志物水平有關(guān),且兩者聯(lián)合檢測可有效預(yù)測患者早期預(yù)后。

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