結直腸癌干細胞和腫瘤微環(huán)境的相互影響及靶向策略

徐聶，曾永軍

0 引言

結直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著治療手段的不斷增多，患者的生存時間得到了明顯延長，但腫瘤復發(fā)和耐藥仍然是臨床工作中面臨的巨大難題。越來越多的證據(jù)表明，結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是轉化細胞和其微環(huán)境相互作用的結果，腸癌干細胞被認為是腫瘤復發(fā)、耐藥和轉移的主要觸發(fā)因素[1]。深入了解腸癌干細胞的調控機制、異質性、特異性標志物、信號通路以及它們與腸道微環(huán)境組分的相互聯(lián)系是提高結直腸癌治療效果的必要條件。因此，根除腸癌干細胞可能是結直腸癌新的治療方向。

1 腸癌干細胞的特性及演變

腫瘤干細胞是腫瘤內(nèi)少量的具有惡性表型特征的未分化致瘤細胞。20世紀90年代科學家證實了腫瘤干細胞的存在[2]。腫瘤干細胞不斷積累突變，具有干細胞性、多藥耐藥、放射耐藥、凋亡耐藥、DNA修復等各種能力。因其具有對上皮組織進行自我更新和分化克隆等獨特特征，故具有明顯的異質性。

在人類結腸的每個隱窩中，只有4～6個具有無限增殖能力且能長時間存活的腸道干細胞（intestinal stem cells，ISCs），分布在腸上皮細胞中的兩個不同的干細胞池：活躍的腸干細胞和儲備的腸干細胞。前者位于隱窩基底膜，在完整條件下負責維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而后者能促進損傷后上皮再生。這兩個細胞池可以相互轉化，從而保持數(shù)量平衡。

研究發(fā)現(xiàn)，腸道干細胞是啟動腸癌細胞重要的細胞來源。活躍的腸道干細胞使上皮細胞轉換，通常由以下信號通路介導：Wnt/β-連環(huán)蛋白[3]、Ras/Raf/Mek/Erk/MAPK、Notch和ΒMP/Smad。APC誘導的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活被認為是腸道干細胞引發(fā)腸道畸形的第一步。隨著P53功能的喪失，異常的ISCs數(shù)量明顯增加，表現(xiàn)出較差的分化能力[4]。同時，當Smad4和Kras發(fā)生突變[5]時，這些細胞具有明顯的侵襲性。異常的Wnt信號壓倒性地驅動了腸癌細胞的發(fā)病程序。由于這些級聯(lián)反應，正常的腸干細胞便轉化為腸癌干細胞（cancer stem cells,CSCs）。

另一方面，結直腸黏膜的上皮細胞向間充質細胞的正常轉化（EMT）可以使結直腸癌細胞獲得腫瘤干細胞特征[6]。在EMT期間，緊密排列的上皮細胞轉變?yōu)殚g充質細胞，表現(xiàn)為高侵襲性和運動性，在腫瘤的侵襲、進展和治療中起著關鍵作用[7]。

2 腸癌干細胞標志物

CSCs可以從一個或多個細胞表面標志物的表達中被識別出來，如CD133、CD44、CD24、CD166和Lgr5[8]等。目前報道的所有CSCs標志物都在具有腫瘤起始能力[9]的結腸癌細胞上共表達。在人類前列腺、腎臟、肝細胞[10]、結腸和胰腺癌中，相比CD133-的細胞而言，少量的CD133+細胞被證明有更高的致瘤和克隆潛能。然而，大多數(shù)關于CSCs標志物在人類腫瘤中表達的爭議都集中在這一最常用的標志物上。研究發(fā)現(xiàn)CD133+和CD133-的細胞在免疫缺陷小鼠中均能促進腫瘤生長，認為CD133不能作為轉移性結腸癌CSCs的標志物，但沒有證據(jù)證明CD133-群體在原發(fā)腫瘤中的腫瘤起始能力，不能表明CD133的表達在原發(fā)腫瘤中與腫瘤干細胞群體無關，有可能原發(fā)性腫瘤和轉移性腫瘤的CSCs之間存在區(qū)別。因此，盡管CD133不是一個完美的標志物，但它已經(jīng)是識別、富集和分離各種腫瘤CSCs的最成功的標志物之一。然而，并非所有的CSCs都具有相同的基因圖譜。結直腸CSCs的一些亞群有自己的標志物，如CD26、CD110和含cub結構域的蛋白-1（CDCP-1）[11]。這些結果表明，結直腸CSCs具有不同的基因譜，這是一個反映CSCs異質性[12]的證據(jù)。

3 腫瘤微環(huán)境與腸癌干細胞的關系

在腫瘤進展過程中，基質與腫瘤細胞進行物質交換并共同發(fā)展。一方面腫瘤細胞改變基質的組成及性質，另一方面形成適應腫瘤細胞生長的微環(huán)境（tumor microenvironment,TME），還為腫瘤細胞提供保護。腫瘤微環(huán)境中的多種細胞和非細胞元素之間存在著復雜和動態(tài)的相互作用。

腫瘤微環(huán)境中包含癌相關成纖維細胞（carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）、間質肌成纖維細胞、骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）、樹突狀細胞（dendritic cell,DC）、內(nèi)皮細胞、炎性反應免疫細胞和組織細胞。這些非腫瘤細胞被認為可以保護CSCs免受抗腫瘤治療的影響。另外，腫瘤微環(huán)境中的各種成分，如細胞因子、轉錄因子、細胞外囊泡和自由基均互相應答，互相交叉，如TGF-β、NF-κΒ、IL-6、IL-8以及缺氧等因素均在調節(jié)腸癌干細胞功能方面發(fā)揮著關鍵作用[13]。同時，微環(huán)境中的不同成分在細胞可塑性中起著關鍵作用?？伤苄允荰ME影響腫瘤復發(fā)的一個主要特征，可導致致瘤細胞和非致瘤細胞之間的可逆轉變?？伤苄员徽J為是單周期治療不足、僅消除活躍CSCs而治療效果不佳的一個原因[14]，也叫作腫瘤干細胞的自主耐藥性[15]。Garza-Trevi?o等[16]發(fā)現(xiàn)，與HCT116高密度單培養(yǎng)相比，在高密度微環(huán)境共培養(yǎng)中，HCT116干細胞標志物（CD133）的表達顯著增加，說明腫瘤微環(huán)境是刺激和支持腫瘤干細胞形成的主導因素。

3.1 缺氧

缺氧，作為腫瘤微環(huán)境的一個組成部分，被認為是腫瘤進展的主調節(jié)因子和驅動力，也是CSCs/TME相互作用的主要標志。腫瘤干細胞可能位于腫瘤微環(huán)境的缺氧區(qū)，缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor,HIF）與腫瘤干細胞的存活有關[17]。miR210是抑制DNA修復的重要調控因子，其表達受到HIF1α的直接調控，并促進常氧基因mRNA的降解。敲除miR210可抑制缺氧誘導的膠質瘤干細胞樣細胞的自我更新能力和抗性。miR210和HIF1α在多種腫瘤中正相關，而miR126和HIF1α在結腸癌中顯著負相關，提示它們的表達可用于腫瘤的早期診斷和篩查[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，包括Wnt和Notch通路在內(nèi)的腫瘤干細胞信號通路在缺氧的微環(huán)境中被激活[1]。此外，在微環(huán)境中，CSCs能表達高水平的程序性死亡配體1（programmed death ligand 1,PD-L1），該配體與程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）結合抑制T細胞的功能。腫瘤干細胞還能向TME分泌多種細胞因子，如TGF-β、IL-4、IL-10和IL-13，對免疫細胞產(chǎn)生抑制作用，從而獲得免疫逃逸[10]。

3.2 癌相關成纖維細胞

活化的成纖維細胞在腫瘤內(nèi)受細胞因子和趨化因子的刺激，被稱為癌相關成纖維細胞（CAFs）[19]。CAFs是腫瘤微環(huán)境中顯示異質性和復雜性的主要組成部分。在腫瘤微環(huán)境中，癌相關成纖維細胞已被證明在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮多種作用[20]。研究表明，CAFs可分泌多種可溶性信號因子，誘導多種表型，如增強細胞增殖、改變代謝、增加細胞運動性、上調鄰近腫瘤細胞的血管生成以及其他基質細胞類型的調控[21]。

CAFs能激活Hedgehog（Hh）干細胞信號通路，Hh也是腫瘤干細胞在微環(huán)境中的另一個重要的調節(jié)因子。特別是CD10+癌相關成纖維細胞，研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中[22]，CD133+細胞和CD133-細胞分別在體內(nèi)外與初級CD10成纖維細胞共同培養(yǎng)，與CD10-成纖維細胞相比，CD10+成纖維細胞共培養(yǎng)顯著提高了CD133+細胞的致瘤能力和侵襲性。

3.3 微環(huán)境中EMT介導的腸癌干細胞

腫瘤微環(huán)境中的各種因素能促進上皮-間充質轉化的進程，進一步誘導腫瘤干細胞形成，上皮-間充質轉化可能是侵襲轉移的先導機制[23]。EMT能誘導癌細胞具有侵襲和轉移性，也被認為是腫瘤干細胞形成的觸發(fā)因素。其過程包括下調細胞黏附分子等鈣黏蛋白，同時促進N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白、鋅指蛋白（SNAIL、Slug、ZEΒ）和基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，引導腫瘤細胞表現(xiàn)出更大的細胞流動性和惡性特征。

整個EMT過程主要受到TGF-β調控。轉化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能多肽，在正常組織的分化、增殖和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。組織細胞合成并分泌TGF-β進入微環(huán)境，與特定的受體結合，進行旁分泌和自分泌信號傳遞。這種配體和受體復合物刺激細胞內(nèi)信號級聯(lián)，包括典型的Smad2信號通路，它與Smad4形成復合物，在細胞核中調節(jié)特定基因的轉錄，并最終調節(jié)細胞周期和組織修復[24]。

在口腔癌中，上皮-間充質轉化對于獲得干細胞特性至關重要。Zubeldia[25]等用TGF-β1轉染結腸癌干細胞，顯示轉染的細胞具有α-平滑肌肌動蛋白的強信號，該肌動蛋白是EMT表型的標志物。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導結腸癌中Twist1的激活，在淋巴結轉移的樣本中TGF-β1的表達較高，TGF-β1 mRNA的表達與Twist1正相關，而Twist正是上皮-間充質轉化過程中的調節(jié)因子，在乳腺癌、前列腺癌和皮膚癌中高表達。

3.4 炎性反應免疫細胞

炎性反應免疫細胞如單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞是腫瘤微環(huán)境中的細胞成分。炎性反應免疫細胞由CAFs和癌細胞分泌的趨化因子和細胞因子所招募。大量證據(jù)表明，阿司匹林（環(huán)氧化酶抑制劑）和其他傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥可以降低結腸癌發(fā)生轉移的風險[27]。炎性腸病與結腸癌的關系可能是微環(huán)境中炎性反應對細胞的刺激作用所致[28]。炎性腸病中持續(xù)的黏膜炎性反應和其他相關因素，如黏膜破裂和腸道微生物群，可促進胃腸道的細胞變化為癌前細胞，并最終形成腸癌干細胞，其機制可能是COX酶通過抑制β-連環(huán)蛋白降解驅動前列腺素E2，并作為介導Wnt通路的信號。

3.5 微環(huán)境中的血管生成

CSCs的自我更新和腫瘤的啟動伴隨著促血管生成因子的分泌如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[29]來促進血管生成。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)結腸癌干細胞預處理的SW480細胞培養(yǎng)后，能增強HUVEC管的形成，VEGFA表達明顯升高[30]。使用TGF-β1干預結腸癌干細胞在體外顯示出更高的血管密度，而小鼠轉染這些TGF-β1陽性細胞導致內(nèi)皮細胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細胞高表達，表明TGF-β1誘導血管生成[31]。這些證據(jù)表明，TGF-β在結腸癌干細胞血管生成的起始過程中起著關鍵作用。

4 腫瘤微環(huán)境靶向治療策略

目前腸癌干細胞被認為是治療耐藥性和腫瘤復發(fā)的主要原因，了解腫瘤微環(huán)境中腫瘤干細胞和其他成分之間的聯(lián)系，可能是抑制CSCs生長潛能的一個重要治療靶點。因此，為了制定新的腸癌治療策略，有必要更詳細地研究腸癌干細胞與微環(huán)境中各個成分的相互作用，以闡明其發(fā)生發(fā)展的詳細機制。

4.1 上皮細胞向間充質細胞轉化的阻斷

EMT不僅能誘導癌細胞獲得侵襲性和轉移性，還能使癌細胞獲得耐藥性，使治療方法復雜化。其根本機制是觸發(fā)了結腸癌干細胞的逆轉，或使休眠干細胞轉為活躍，這可能就是EMT、CSCs和耐藥性之間的關聯(lián)。靶向EMT通路可能是一種很有前途的治療策略。Qi等[32]已經(jīng)證明了Dickkopf-1（Dkk1）可以作為一種Wnt信號抑制劑逆轉結腸癌中的EMT。在217例結腸癌患者中，發(fā)現(xiàn)Dkk1的表達與腫瘤分期、轉移和復發(fā)負相關；Dkk1陽性樣本比陰性樣本能更高地表達上皮標記E-鈣黏蛋白，降低間充質標記波形蛋白和細胞質分布，表明Dkk1在結腸癌可能減少間充質化，能使EMT過程逆轉，因此可作為腫瘤治療的靶點。

4.2 調控癌相關成纖維細胞

TGF-β、Hh等多個信號通路參與不同來源細胞的CAF激活，靶向這些信號通路可能是調控癌相關成纖維細胞的重要途徑。TGF-β被認為是CAF分化、激活和擴張的主要中介物。TGF-β及其家族成員激活TGF-βR1受體，而TGF-βR1受體進而磷酸化Smad2/3，形成核易位的Smad2/3/4復合物，這些復合物通過與轉錄因子、共激活因子等信號通路合作，負責靶基因的表達。另外，癌相關成纖維細胞不僅可以分泌多種細胞因子或代謝產(chǎn)物抑制免疫細胞的功能，還能塑造腫瘤外基質，形成藥物或免疫細胞滲透屏障，阻止藥物和免疫細胞向腫瘤組織滲透。Colangelo等[33]報道使用抗纖維化藥物或多靶向藥物可使CAFs逆轉為正常成纖維細胞。通過調控癌相關成纖維細胞或克服其屏障作用可能是腫瘤治療的新手段。

4.3 微環(huán)境中血管生成的干預

證據(jù)表明，腸癌干細胞可直接分化為血管內(nèi)皮細胞，從而產(chǎn)生腫瘤所需的血管系統(tǒng)。異常的血管系統(tǒng)能夠阻礙腫瘤的免疫反應以及氧氣和化療藥物的運輸和分配，這種惡劣的腫瘤微環(huán)境也可以導致對放化療耐藥[34]。另一方面，抗血管生成藥物易誘導腫瘤缺氧，使CSCs存活和傳播，從而推動腫瘤進展，所以目前臨床上使用的VEGF靶向藥物對腫瘤患者的生存獲益有限。由于CSCs是微環(huán)境中VEGF的主要來源，因此特異性地靶向CSCs或干細胞來源的VEGF可能是有效的?？梢姡玫亓私釩SCs與腫瘤血管生成之間的關系是研究血管生成靶向藥物的新途徑。

4.4 天然植物化學物質作為CSCs靶向的抗癌藥物

近年來，一些天然植物化學物質，比如姜黃素、白藜蘆醇、環(huán)巴胺、胡椒堿等均被報道能針對腸癌干細胞的活性。Sankpal等[35]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過影響核因子κΒ（NF-κΒ）進入細胞核，抑制微環(huán)境中成纖維細胞和結腸CSCs之間的連接，并使腸癌干細胞對5-Fu敏感。白藜蘆醇是一種多酚類化合物，存在于許多植物物種中，如葡萄、花生和漿果中[36]，研究發(fā)現(xiàn)其對胰腺癌干細胞和胰腺癌細胞的遷移、侵襲和上皮-間充質轉化均有潛在的抑制作用。因此，開發(fā)天然植物化學物質并探討其作用機制，是針對腫瘤干細胞治療的另一重要途徑。

5 結語

結直腸癌的生長、復發(fā)和轉移可能取決于腫瘤干細胞及其微環(huán)境，腫瘤干細胞需要與微環(huán)境相互作用才能生存，微環(huán)境的組成可能影響患者對治療的反應，因此，結直腸癌的治療不僅要針對腸癌干細胞，還需要針對腫瘤微環(huán)境及其成分，但腫瘤微環(huán)境中的各種細胞和非細胞成分間存在著復雜的動態(tài)平衡，深入了解其作用機制，尋找合適的生物標志物，如何通過精準靶向來提高結直腸癌的療效是我們面臨的一個重大挑戰(zhàn)。