宮頸微生物菌群對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響

崔媛媛，葉德盛，鄭煒煒，譚穎，馬從順，詹雪君，宋革*

(1.廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510600；2.廣東省生殖科學(xué)研究所，廣州 510600；3.國家衛(wèi)生健康委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣州 510600；4.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510623)

自1978年世界上第1例試管嬰兒出生，輔助生殖技術(shù)(ART)尤其是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)已成為治療不孕癥的有效手段。垂體降調(diào)節(jié)藥物使促排卵更高效，胚胎玻璃化冷凍技術(shù)大大提升胚胎利用率，臨床妊娠率逐步提高。但事實上，由于胚胎的種植機制仍不明確，即便經(jīng)過遺傳學(xué)篩查胚胎著床率仍較低，孕早期流產(chǎn)率和早產(chǎn)率較高，反復(fù)著床失敗患者缺乏有效的臨床治療手段[1]。因此，改善子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局，成為ART發(fā)展的瓶頸。近年研究發(fā)現(xiàn)，生殖系統(tǒng)微生物組異常不僅導(dǎo)致生殖道感染和女性不孕癥[2-3]，還與胚胎移植后的妊娠結(jié)局有關(guān)[4-6]，是改善IVF預(yù)后的新突破口。

隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，借助高通量測序技術(shù)對可變區(qū)進(jìn)行測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，可全面了解機體內(nèi)的菌群多樣性，同時了解菌群質(zhì)和量的變化與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，也為了解未知菌屬在疾病中的作用開辟了新的研究方法。本文通過高通量測序技術(shù)，研究新鮮取卵周期移植日宮頸微生態(tài)菌群對IVF妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

選擇2020年3—9月在廣東省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI新鮮周期胚胎移植的患者為研究對象，提取其宮頸分泌物作菌群檢測。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<35歲；(2)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L且抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(3)可用胚胎>2個；(4)宮腔鏡檢查排除子宮內(nèi)膜炎；(5)移植術(shù)前3個月內(nèi)行宮頸黏液檢查，排除衣原體、淋病奈瑟菌感染；一周內(nèi)行陰道分泌物檢查，排除陰道特異性及非特異性炎癥；無陰道瘙癢、白帶增多等自覺癥狀；(6)取樣前1個月內(nèi)未使用抗生素；取樣3 d內(nèi)未行陰道沖洗，無性生活。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方急慢性宮頸炎；(2)子宮畸形、宮腔粘連、子宮黏膜下肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水；(3)合并抗磷脂綜合征、甲狀腺功能異常、糖尿病等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾?。?4)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)著床失敗病史。

所有研究對象均簽署書面知情同意書。本研究已獲得廣東省生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查號：論審研第[2019](25)號)。

本研究共收取標(biāo)本33例，其中活產(chǎn)17例，生化妊娠1例，流產(chǎn)2例，未孕13例，選取活產(chǎn)及未孕患者共30例進(jìn)行分析。

二、研究方法

1.IVF/ICSI-ET治療：采用長方案或拮抗劑方案，常規(guī)劑量啟動(150～300 U)，定期監(jiān)測排卵，根據(jù)卵泡生長情況及激素水平適當(dāng)調(diào)整促排藥物劑量。當(dāng)1個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm 時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，德國)或/和GnRH-a(達(dá)菲林，博福-益普生，法國)扳機，36～37 h后取卵。取卵后予黃體酮(浙江仙琚) 60 mg/d 肌肉注射黃體支持，3～5 d后行胚胎移植。移植后予地屈孕酮(達(dá)芙通，雅培，荷蘭) 30 mg/d + 黃體酮凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，德國) 90 mg/d 黃體支持。移植后12 d抽血查β-HCG，生化妊娠者(HCG>5 U/L)繼續(xù)黃體支持。移植28 d后行陰道B超檢查可見宮內(nèi)孕囊確定為臨床妊娠，臨床妊娠者黃體支持至孕10～11周。按常規(guī)流程進(jìn)行隨訪。

2.標(biāo)本采集：患者均于胚胎移植手術(shù)時留取宮頸管分泌物標(biāo)本。清潔外陰，消毒鋪巾，窺陰器撐開陰道，無菌棉球擦拭宮頸表面，用干燥無菌棉簽插入宮頸管內(nèi)轉(zhuǎn)動10圈，待棉簽吸取分泌物后，取出棉簽放入干燥無菌管，折斷尾部。取樣過程中，棉簽避免接觸陰道口及陰道壁，以防發(fā)生標(biāo)本污染。所有研究對象的取樣和移植均為同一操作者。

3.宮頸微生物菌群的檢測：(1)宮頸細(xì)菌總DNA提取：采用PowerSoilDNA分離試劑盒提取宮頸棉簽上的細(xì)菌總DNA，分離出的總DNA含量通過PicoGreen DNAassay(Invitrogen)進(jìn)行定量檢測，并按純化試劑盒說明進(jìn)行純化；(2)16S rRNA基因高可變區(qū)V3-V4高通量測序：使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對總DNA中的16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴增(TransStartFastPfu DNA Polymerase)，并使用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序；(3)生物信息學(xué)分析：使用QIIME進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)OTU分類鑒定結(jié)果，獲得樣本在界、門、綱、目、科、屬、種水平的具體組成和豐度。后續(xù)分析包括聚類分析、Alpha多樣性、Beta多樣性分析、顯著性差異分析、線性判別分析及相關(guān)性熱圖。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本情況比較

本研究共納入患者30例，其中未孕組13例，活產(chǎn)組17例。兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、竇卵泡數(shù)(AFC)、原發(fā)不孕比例及不孕因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者促排卵及胚胎發(fā)育情況比較

兩組患者促排卵方案、受精方式、平均Gn用量、HCG日P水平、HCG日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、可用胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎數(shù)及移植優(yōu)胚數(shù)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，活產(chǎn)組Gn天數(shù)及HCG日E2水平均顯著高于未孕組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，n(%)]

三、兩組患者的宮頸微生物組成

1.菌群多樣性分析：兩組樣本共檢測出有效序列數(shù)2 349 161條。以序列數(shù)與物種數(shù)或多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線。Alpha多樣性是對樣品中物種多樣性的分析，包含物種的豐富度和均勻度兩個方面。其中，Chao1估計菌落中包含物種的數(shù)目；Good’s_coverage代表微生物覆蓋率；Shannon指數(shù)表示物種多樣性。各個標(biāo)本多樣性物種含量經(jīng)秩和檢驗，兩組宮頸菌群在物種豐富度和均勻度方面比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖1 A～F)。

采用Beta多樣性對兩組生物多樣性進(jìn)行比較。Beta多樣性指不同群落之間的物種差異，通過計算樣品間的距離矩陣，觀察樣本間差異。本文采用PCA主成分分析觀察樣本之間的差異，數(shù)據(jù)顯示兩組患者宮頸微生物菌群組成成分有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002)；通過UPGMA層次聚類分析，直觀顯示不同組中的微生物進(jìn)化的差異程度較小(P=0.1)(圖1 G～H)。

A：Chao1指數(shù)稀釋曲線；B：Chao1指數(shù)小提琴圖；C：Goods_coverage稀釋曲線；D：Goods_coverage指數(shù)小提琴圖；E：Shannon指數(shù)稀釋曲線；F：Shannon指數(shù)小提琴圖；G：Beta多樣性PCA分析；H：UPGMA層次聚類分析。N：未孕組；P：活產(chǎn)組。

2.兩組物種豐度聚類分析及組間菌群門、科、屬、種水平差異：根據(jù)feature結(jié)果和各樣品feature特征表，獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表，并對兩組間物種組成及差異進(jìn)行分析。選取豐度最高的30個物種分類，將每組在門、屬的相對豐度以氣泡圖形式展現(xiàn)。采用熱圖展示兩組在門-科-屬-種水平上菌群結(jié)構(gòu)不同(圖2)。

菌門水平，共檢測到25種，相對豐度在1%以上共4種，為厚壁門、變形桿菌門、放線菌門、擬桿菌，占宮頸樣本微生物總數(shù)的90%以上。

科水平，活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌科(67.34%)、雙歧桿菌科(9.99%)、莫拉菌科(2.94%)；未孕組豐度最多的為乳桿菌科(58.40%)、雙歧桿菌科(9.26%)、假單胞菌科(4.64%)，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

屬水平，活產(chǎn)組相對豐度最多的為乳桿菌屬(67.33%)、加德納菌屬(9.90%)、不動細(xì)菌屬(2.76%)；未孕組相對豐度最多的為乳桿菌屬(58.40%)、加德納菌屬(8.84%)、假單胞菌屬(4.64%)、大腸桿菌志賀氏菌屬(2.76%)。兩組患者主導(dǎo)菌群均為厚壁門乳桿菌屬，活產(chǎn)組乳桿菌屬豐度較高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

種水平，兩組主導(dǎo)菌群差異顯著?；町a(chǎn)組豐度最高的分別為卷曲乳桿菌(43.71%)、惰性乳桿菌(13.90%)、陰道加德納菌(6.81%)、詹氏乳桿菌(3.55%)、未培養(yǎng)的乳桿菌(3.19%)；未孕組為惰性乳桿菌(50.29%)、陰道加德納菌(6.90%)、卷曲乳桿菌(3.86%)、假單胞菌(3.37%)、未分類的志賀氏菌(2.83%)。兩組比較，卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌相對豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

采用線性判別分析(LEfSe)方法對兩組患者宮頸微生物群進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)7個生物標(biāo)記物，包括屬水平2個，種水平5個。其中，活產(chǎn)組生物標(biāo)記物主要有種水平的卷曲乳酸桿菌和奧爾塞內(nèi)拉菌，未孕組生物標(biāo)記物有胃瘤球菌屬、理研菌屬，種水平有惰性乳桿菌、未識別的胃瘤球菌、里肯內(nèi)拉菌及未識別的里肯內(nèi)拉菌。

3.環(huán)境因素相關(guān)性分析：為研究環(huán)境因素與宮頸微生物群的影響，采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析各組不孕類型、年齡、AFC、基礎(chǔ)FSH、促排卵方案、HCG日E2水平、Gn天數(shù)等環(huán)境因素對胚胎移植日宮頸菌群屬、種相對豐度最多的10種菌群的關(guān)系。結(jié)果顯示，屬水平，乳桿菌屬相對豐度與各環(huán)境因素?zé)o相關(guān)性，韋榮球菌屬和鏈球菌屬相對豐度與促排卵天數(shù)正相關(guān)(P<0.05)；種水平，優(yōu)勢菌群惰性乳桿菌與促排卵天數(shù)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，未培養(yǎng)的乳桿菌與BMI負(fù)相關(guān)(P<0.05)。其他非優(yōu)勢菌群中，AY-2011-RS11假單胞菌與促排卵方案相關(guān)(P<0.01)；HCG日雌激素水平與屬、種水平豐度前十位菌群均無相關(guān)性(圖3)。

A：兩組菌群氣泡圖；B：兩組門水平熱圖分析；C：兩組科水平熱圖分析；D：兩組屬水平熱圖分析；E：兩組種水平聚類分析；F：種水平主要菌群詹氏卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌兩組的相對豐度；G：兩組經(jīng)線性判別分析(LEfSe)有顯著性差異的物種。N：未孕組；P：活產(chǎn)組

A：環(huán)境因素與宮頸微生物群屬水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖；B：環(huán)境因素與宮頸微生物群種水平相對豐度前10位菌群相關(guān)性熱圖。

討 論

人體不同部位的菌群(例如腸道/呼吸道/皮膚及陰道等)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]，現(xiàn)已成為新的研究熱點。生殖系統(tǒng)的微生物約占人體總菌群的9%。女性正常陰道菌群中，以不同類型的乳酸桿菌為主，還寄生了雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌、鏈球菌、加德納菌等多種細(xì)菌，以及支原體、假絲酵母菌等，它們相關(guān)制約、相互作用，共同構(gòu)成陰道微生態(tài)環(huán)境[8]。同時，陰道微生物隨月經(jīng)周期變化而改變，在排卵期和黃體中期豐度最高[9]。生殖系統(tǒng)的微生態(tài)平衡對女性生育能力影響顯著，菌群紊亂引起生殖系統(tǒng)的炎癥，不僅可能導(dǎo)致不孕[2]，還與子宮內(nèi)膜容受性、早期妊娠維持、早產(chǎn)等有關(guān)[5，10-11]。

絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的陰道-宮頸及子宮內(nèi)膜的微生物菌群異常對胚胎移植的妊娠結(jié)局產(chǎn)生不可忽視的影響[12]。陰道主要菌群為非乳桿菌更容易出現(xiàn)反復(fù)著床失敗、子宮內(nèi)膜炎及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。付敏等[6]留取移植日陰道分泌物，發(fā)現(xiàn)不明原因反復(fù)著床失敗患者陰道微生物多樣性增加，表現(xiàn)為乳桿菌豐度降低，而陰道乳酸桿菌占主導(dǎo)者具有較高的臨床妊娠率。Moreno等[4]采用基因芯片測定內(nèi)膜容受期宮腔內(nèi)菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在容受期內(nèi)膜菌群高度穩(wěn)定，乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群組有更好的臨床妊娠結(jié)局。

對于一般人群，生殖道微生物群分析能否預(yù)測IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局，目前尚存有爭議。2012年Hyman等[13]將高通量測序技術(shù)用于IVF周期內(nèi)患者陰道菌群檢測，發(fā)現(xiàn)移植日陰道菌群會影響IVF妊娠結(jié)局。2017年Franasiak團隊[14]發(fā)現(xiàn)，移植管尖端乳酸桿菌占優(yōu)勢的患者臨床妊娠結(jié)局并沒有出現(xiàn)顯著性增高。目前大部分文獻(xiàn)報道以陰道取樣標(biāo)本為主，但從胚胎移植手術(shù)的操作流程考慮，宮頸內(nèi)菌群在移植過程中會被直接帶入宮腔。因此，本研究選擇年輕(<35歲)、可用胚胎>2個、無反復(fù)種植失敗病史的預(yù)后良好患者作為研究對象，分析其宮頸微生物菌群與臨床妊娠結(jié)局的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，活產(chǎn)組與未孕組在門、屬水平均以乳桿菌為優(yōu)勢菌群，其中活產(chǎn)組的屬水平乳桿菌相對豐度較高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；未孕組患者在胃瘤球菌屬、理研菌屬等異常菌群顯著增加，這與Chen等[15]研究結(jié)果相似。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在IVF/ICSI治療過程中，妊娠組和未孕組厚壁門、乳桿菌屬等優(yōu)勢菌群差異無統(tǒng)計學(xué)意義，乳桿菌屬在患有子宮內(nèi)膜炎妊娠組和未孕組比較仍無差異；菌群異常主要體現(xiàn)在非優(yōu)勢菌群，如放線菌屬、酸桿菌屬等。以上研究均提示，在一般人群，乳酸菌屬優(yōu)勢菌群并不是正常生殖道微生物群和良好妊娠結(jié)局的保障。

在種水平，本研究結(jié)果證實，一般人群中乳桿菌在種水平上的變化對妊娠有一定的預(yù)測作用。活產(chǎn)組以卷曲乳桿菌為主要生物標(biāo)記，未孕組則以惰性乳桿菌為主要生物標(biāo)記，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。荷蘭學(xué)者在303例接受IVF/ICSI治療的女性陰道菌群研究中得出相同的結(jié)論，該研究結(jié)果顯示，卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群是預(yù)測妊娠的重要指標(biāo)[16]。在生育期，高水平的雌激素和孕激素維持乳酸桿菌在陰道內(nèi)占優(yōu)勢：雌激素使陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖原蓄積，孕激素促進(jìn)上皮細(xì)胞脫落，釋放糖原。乳酸桿菌將糖原分解為乳酸，維持正常陰道內(nèi)酸性環(huán)境，抑制其他細(xì)菌繁殖。然而，不同乳桿菌的作用完全不同。卷曲乳桿菌可抑制多種陰道致病菌的黏附和增殖，在健康女性陰道中相對豐度高，卷曲乳桿菌的缺失與菌群失調(diào)有密切關(guān)系[17]。研究表明，卷曲乳桿菌基因序列中包含了抑制陰道加德納菌的蛋白基因，并且可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制白色假絲酵母菌生長以及菌絲形成[18]。而惰性乳桿菌很少與其他乳桿菌共存，容易被細(xì)菌取代，在陰道菌群失衡后大量繁殖而成為優(yōu)勢菌群。大多數(shù)研究認(rèn)為，惰性乳桿菌的增多與亞健康狀態(tài)有關(guān)，惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌增加了患細(xì)菌性陰道病及衣原體的易感性[3，17-19]。異常菌群的存在可能通過宮腔炎性反應(yīng)及影響內(nèi)膜容受性等方式影響胚胎著床[20]。

本研究中，兩組患者在促排卵天數(shù)及HCG日E2水平上有顯著差異，而相關(guān)性分析表明環(huán)境因素對屬水平上的優(yōu)勢菌群無明顯相關(guān)性。2008年Jakobsson等[20]首次用16s RNA測序法研究降調(diào)周期促排卵期間陰道菌群變化，結(jié)果顯示陰道優(yōu)勢菌群保持相對穩(wěn)定，僅少部分菌群在促排卵過程發(fā)生變化。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不孕女性在促排卵前后陰道菌群無顯著變化。以上結(jié)果提示生殖道菌群在個體中保持相對穩(wěn)定性，促排卵前菌群測定對預(yù)測IVF/ICSI治療結(jié)局仍有意義[16]。在種水平上，促排卵天數(shù)與惰性乳桿菌有相關(guān)性。既往研究表明，促排卵天數(shù)對妊娠結(jié)局無影響[22]，由于本研究樣本量較小，仍需進(jìn)一步擴大樣本量分析環(huán)境因素對惰性乳桿菌種相對豐度的影響。

綜上，本文首次采用16s rRNA測序方法研究新鮮周期胚胎移植日宮頸微生態(tài)，針對預(yù)后良好的一般患者展開研究。研究表明，宮頸菌群中優(yōu)勢菌群多為厚壁屬乳桿菌，活產(chǎn)組與未孕組在菌群豐富度及均勻度上無顯著差異，但在物種分布上有顯著差異。卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群可能是預(yù)測分娩的重要指標(biāo)，而惰性桿菌為優(yōu)勢菌群則與著床失敗有關(guān)，其可能原因為菌群失調(diào)導(dǎo)致的免疫紊亂。由于本文關(guān)注的為預(yù)后良好人群，且研究樣本量有限，因此宮頸菌群是否影響新鮮周期胚胎移植妊娠結(jié)局尚需擴大樣本量進(jìn)一步研究。本研究結(jié)論不適用于特殊人群，或者凍融胚胎移植周期。