小麥灌漿期耐高溫性狀QTL定位與分析

劉秀坤，王克森，翟勝男，張華鋒，單寶雪，肖延軍，李豪圣，劉建軍，張玉梅，孟福燕，曹新有，趙振東

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東 青島 266109；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/小麥玉米國家工程中心/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創(chuàng)新中心，山東 濟南 250100；3. 陵縣友合種業(yè)有限公司，山東 德州 253500；4. 鄆城縣種子公司，山東 鄆城 274700)

小麥是世界上的主要口糧作物之一，也是我國第二大糧食作物[1]，是全球35%～40%人口的主食。2019年初，世界氣象組織(WMO)發(fā)布了2018年全球平均氣溫數(shù)據(jù)，相較于1980—2010年的平均值上升了0.38℃，亞歐大陸的地表平均氣溫較2017年上升了0.58℃[2]。在全球變暖趨勢下，未來我國高溫天氣可能將趨于常態(tài)化。小麥是喜涼的C3作物，日均溫20～24℃有利于其籽粒灌漿[3－5]。而我國黃淮冬麥區(qū)小麥揚花后常出現(xiàn)30℃以上的高溫天氣，再加上低濕及一定風力的影響，常表現(xiàn)出較嚴重的干熱風危害，成為限制小麥產(chǎn)量和品質提高的重要環(huán)境因素之一[5，6]。因此，定位耐高溫相關性狀QTL，開發(fā)與耐高溫特性關聯(lián)位點緊密連鎖的分子標記，對小麥耐高溫遺傳特性研究具有重要的理論意義。

旗葉是小麥重要的感光部位，在開花后期和籽粒灌漿階段發(fā)生高溫脅迫時，葉片衰老速率顯著增強[3]。小麥旗葉干尖指數(shù)是描述葉片持綠性的重要指標[7]，能直觀地反映植株生長發(fā)育后期的耐高溫特性，可以作為小麥葉片持綠性和耐高溫特性的鑒定指標[8]。千粒重作為產(chǎn)量三要素之一，直接影響小麥產(chǎn)量。灌漿期高溫脅迫會導致灌漿速率下降，縮短籽粒成熟期，致使千粒重降低[9，10]。同時，高溫脅迫會使小麥淀粉含量下降，降低直鏈淀粉含量，影響面團強度，進而對面粉的加工品質造成影響[11，12]。

小麥耐高溫相關性狀屬于多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，易受環(huán)境影響。評價指標、目標性狀、生育時期、高溫處理方法和時間等因素都會影響品種的耐高溫特性評價結果[13]。學者們在對小麥耐高溫特性研究的過程中，選用的鑒定方法和評價指標有所差異，所得到的結果也不盡相同。陳希勇等[14]以中國春－HOPE 染色體代換系為試驗材料，通過細胞膜熱穩(wěn)定性和大田生產(chǎn)條件下高溫脅迫處理的方法，將耐高溫QTLs 定位在2A、2B、3A、3B、4B 染色體上。Pinto 等[15]以“Seri/Babax”重組自交系為研究對象，高溫脅迫下冠層溫度為鑒定指標，將耐高溫QTL 定位在1B、2B、3B、4A、4B 和7A 染色體上。Mason 等[16]利用RIL 群體，定位到多個千粒重熱感指數(shù)QTLs，分布于1B、5A 和6D 染色體上。

為加快耐熱育種的進程，定位更多的耐熱相關主效QTL，將為小麥耐熱機理解析提供支撐。本研究以耐高溫的菏麥13 和對高溫敏感的臨麥2 號構建的F8代RIL 群體為試驗材料，通過大田人工模擬高溫脅迫試驗，以旗葉干尖指數(shù)和千粒重熱感指數(shù)作為鑒定指標綜合衡量小麥耐高溫特性，通過SNP 芯片進行連鎖分析，定位與高溫脅迫相關的QTLs，以期為挖掘響應高溫脅迫的基因及小麥耐高溫脅迫遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以耐高溫品種菏麥13 為母本、感高溫品種臨麥2 號為父本，雜交F1代后自交得到F2代，通過單籽粒傳法直至自交得到200 個株系的F8代RIL群體。

1.2 大田試驗設計與研究方法

1.2.1 試驗設計與處理方法 RIL 群體及其親本分別于2017年和2018年10月上旬種植于山東省濟南市試驗基地，2018年10月中旬種植于山東省德州市陵城區(qū)試驗基地。采用隨機區(qū)組設計，3 次重復，3 行區(qū)種植，行長2 m，行距0.25 m，每行均勻點播50 粒種子；每一重復加耐高溫(菏麥13)和高溫敏感(臨麥2 號)對照。田間管理與大田試驗一致。

試驗設置高溫脅迫和正常條件2 種處理。高溫脅迫處理是在小麥揚花后14 天進行人工扣棚增溫，白天扣棚，晚間移除；正常條件即不扣棚，保持自然環(huán)境下生長。棚內外掛溫度計，記錄棚內外溫度。

1.2.2 調查性狀 (1)旗葉干尖指數(shù):指旗葉干尖面積占旗葉總葉面積的比例。共分為4 個等級:Ⅰ(0 ～ 10%)、Ⅱ(20% ～ 50%)、Ⅲ(60% ～80%)、Ⅳ(90%～100%)。隨等級升高，株系對高溫脅迫的敏感度增強。從揚花第14 天進行人工扣棚高溫處理，處理第7 天調查旗葉干尖指數(shù)，以株系材料種植區(qū)50%以上旗葉所處的等級作為該株系旗葉干尖指數(shù)。

(2)千粒重熱感指數(shù):指株系在高溫脅迫條件下千粒重性狀值與對照條件下千粒重性狀值的比較，計算公式為千粒重熱感指數(shù)(S)＝(1－YD/YP)/，YD 為某一品種(系)在高溫脅迫下的千粒重，YP 為某一品種(系)在正常環(huán)境下的千粒重，為品種(系)在高溫脅迫處理下的千粒重均值，為品種(系)在正常環(huán)境下的千粒重均值。收獲后利用萬深SC－G 自動種子考種分析及千粒重儀測定RIL 群體及親本千粒重。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對小麥RIL 群體200 個株系及其親本的旗葉干尖指數(shù)性狀和千粒重熱感指數(shù)性狀進行相關分析和基本統(tǒng)計量分析。

1.3 群體全基因組SNP 芯片分析

利用北京中玉金標記公司與中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所合作研發(fā)的15K 育種芯片對RIL群體200 個株系及其親本的基因組進行高通量基因分型，并對樣品及分析結果進行質控:①計算樣品的DQC(Dish QC)和CR(call rate)值，判斷樣品數(shù)據(jù)是否適合進行后續(xù)基因分型分析；②SNP位點質控，標記質量分類，選擇群體最優(yōu)標記分型類型；③基因分型分析，根據(jù)Affymetrix (Thermo Fisher)的篩選標準[17]過濾標記，篩選后得到8 558個多態(tài)性位點用于遺傳圖譜構建。

1.4 遺傳圖譜構建

以菏麥13 和臨麥2 號為親本構建的RIL 群體為作圖群體，對8 558 個多態(tài)性位點進行篩選:舍去雜合率高的標記(>10%)和缺失率高的標記(>10%)；應用Tassel v5.0 過濾偏分離標記(0.3 ∶0.7)。

通過QTL IciMapping v4.2 對標記初步分組。應用QTL IciMapping v4.2－Bin 功能整合同一位點的所有共分離標記，僅保留一個用于后續(xù)做圖；QTL IciMapping v4.2 Map 過程識別基因型數(shù)據(jù)，根據(jù)連鎖關系將標記分到小麥21 條染色體上。

應用JoinMap v4 構建全基因組遺傳連鎖圖譜。對IciMapping 初步分組結果進行檢驗，Regression mapping 過程確定標記位置并計算遺傳距離。

1.5 QTL 分析

利用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件，通過復合區(qū)間作圖法(CIM)進行QTL 定位，設置程序掃描步長為1.0 cM，置換檢測(permutation test)參數(shù)設置為P＝0.05 水平下1 000 次重復排列[18]。當位點LOD 閾值大于2.5 時，就認為此位點上存在一個QTL。QTL 命名方法[19]:q＋目標性狀(大寫英文字母)＋“－”＋所在染色體編號＋“－”＋QTL 序數(shù)。

2 結果與分析

2.1 遺傳圖譜

遺傳圖譜包含741 個SNP 標記，覆蓋15 條染色體，全長1 720.43 cM，標記間平均距離2.32 cM(表1)。

表1 遺傳圖譜標記分布及密度

2.2 旗葉干尖指數(shù)和千粒重熱感指數(shù)表型分析

2.2.1 旗葉干尖指數(shù) 兩個親本的旗葉干尖指數(shù)性狀存在明顯差異，菏麥13 具有較低的旗葉干尖指數(shù)，比臨麥2 號低1～2 個等級(表2)。旗葉干尖指數(shù)在RIL 群體內表現(xiàn)出超高親分離，呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布(圖1)，屬于多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，可以進行QTL 定位。

圖1 3 個環(huán)境下RIL 群體旗葉干尖指數(shù)分布

表2 RIL 群體及其親本旗葉干尖指數(shù)的表型分析

2.2.2 千粒重熱感指數(shù) 兩個親本的千粒重熱感指數(shù)有明顯差異，菏麥13 熱感指數(shù)較低，具有較好的耐高溫特性；臨麥2 號則表現(xiàn)出明顯的感高溫特性，熱感指數(shù)大于1.4(表3)。千粒重熱感指數(shù)在RIL 群體內表現(xiàn)出雙向超親分離，分布圖呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布(圖2)，屬于多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，可以進行QTL 定位。

表3 RIL 群體及其親本千粒重熱感指數(shù)的表型分析

2.3 QTL 定位結果

2.3.1 旗葉干尖指數(shù)QTLs 在LOD>2.5 水平下，共檢測到10 個旗葉干尖指數(shù)QTLs，分布于小麥的1A(2 個)、1B(2 個)、2A、4A、5B(2 個)、7A和7B 染色體上(表4 和圖3)，可解釋5.03%～13.11%的表型變異。其中1B 染色體定位到2 個QTLs(qFLS － 1B － 1和qFLS － 1B － 2)， AX －108920629～AX－111220018 區(qū)間內的qFLS－1B－1可解釋9.47%的表型變異，LOD 值為4.64；AX－111608329～AX－111548801 區(qū)間內的qFLS－1B－2可解釋12.44%的表型變異，LOD 值為2.70；兩個QTLs 的加性效應均為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥 13。4A 染色體 AX －110410155～AX－95629274 區(qū)間內的qFLS－4A可解釋13.11%的表型變異，LOD 值為2.60，加性效應為正值，位點增效等位基因來源于父本臨麥2號。5B 染色體上定位到2 個QTLs(qFLS－5B－1和qFLS－5B－2)，AX－110490429～AX－111478844區(qū)間內的qFLS－5B－1 可解釋9.13%的表型變異，LOD 值為2.85，加性效應為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥13；AX－108922118～AX－108930395 區(qū)間內的qFLS－5B－2可解釋8.11%的表型變異，LOD 值為4.25，加性效應為正值，位點增效等位基因來源于父本臨麥2 號。7B 染色體AX－108861535～AX－109325469 區(qū)間內的qFLS－7B在2019年濟南、陵城兩地均定位到，LOD 值在3.39～4.33，可解釋6.53%～8.32%的表型貢獻率，加性效應均為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥13，是穩(wěn)定的QTL。

表4 旗葉干尖指數(shù)性狀的QTL 定位結果

2.3.2 千粒重熱感指數(shù)QTLs 在LOD>2.5 水平下，共檢測到11 個千粒重熱感指數(shù)QTLs，分布于2B、3A(2 個)、4B(2 個)、5A、5D、6A、6D、7B 和7D 染色體上(表5 和圖3)，可解釋4.89% ～15.60%的表型變異。3A 染色體上分別在2018年濟南(qITKW－3A－1)和2019年陵城(qITKW－3A－2)定位到QTLs，表型貢獻率分別為5.83%和12.54%，LOD 值分別為2.97 和2.62，加性效應均為正值，位點增效等位基因來源于父本臨麥2 號。4B 染色體上也定位到2 個QTLs，分別是2018年濟南定位到的qITKW－4B－1和2019年濟南定位到的qITKW－4B－2，其表型貢獻率分別為8.97%和6.33%，LOD 值分別為2.57 和3.32，加性效應均為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥13。6A 染色體AX－109536927～AX－95012251 區(qū)間內的qITKW－6A可解釋15.60%的表型變異，LOD 值為3.22，加性效應為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥13。7B 染色體AX－108762687～AX－111137553 區(qū)間內的qITKW－7B在兩年三點的定位中均檢測到，LOD 值在2.58～4.69，可解釋5.27%～9.15%的表型貢獻率，加性效應均為正值，位點增效等位基因來源于父本臨麥2 號，是穩(wěn)定的QTL。

圖3 RIL 群體耐熱相關性狀QTL 定位結果

表5 千粒重熱感指數(shù)的QTL 定位結果

3 討論與結論

小麥的耐熱機制非常復雜[12]，其耐熱性狀是多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[13]，同一染色體上可能存在多個有關耐熱的QTL 位點，是小麥本身的遺傳特性和環(huán)境共同作用的結果。本研究從灌漿期經(jīng)歷高溫脅迫的小麥旗葉中定位到與旗葉干尖指數(shù)性狀相關的QTLs 共10 個，分別位于1A(2個)、1B(2 個)、2A、4A、5B(2 個)、7A 和7B 染色體上。白海波等[20，21]以葉綠素含量作為耐熱指標檢測到與耐熱相關的QTLs 分布在2A、5B、7A、7B 染色體上，Talukder 等[22]發(fā)現(xiàn)控制葉綠素的QTLs 分布在1B、7A 染色體，這些QTLs 雖然與本研究中的QTLs 定位在了相同的染色體，但距離相差較遠，并不相同。Vijayalakshmi 等[23]在高溫脅迫下在7A 染色體定位到與旗葉相關的QTL，與本研究定位到的qFLS－7A位置距離差異較小，預測在該位置附近存在與耐熱相關的基因。1A、4A 染色體上檢測到與耐熱有關QTLs 前人還少有涉及，這可能與試驗材料、所用芯片、鑒定方法等不同有關，但qFLS－4A可解釋13.11%的表型變異，意味著可能存在與耐熱相關的新基因未發(fā)掘，有待于進一步研究。

有關千粒重的QTLs 幾乎分布在小麥各個染色體[24]，但與耐熱性相關的相對較少。本研究在2B、3A(2 個)、4B(2 個)、5A、5D、6A、6D、7B 和7D 染色體上檢測到11 個與千粒重熱感指數(shù)相關的QTLs。與本研究結果相似的是，李世平等[25]利用DH 群體，在6A 染色體上定位到千粒重熱感指數(shù)QTL，加性效應為負值；陳希勇等[14]研究指出，2B、3A、4B 染色體均與耐熱性有關。但在5A染色體上檢測到的qITKW－5A與張業(yè)倫等[4]檢測到的qTKW－5A加性效應不同。白海波等[20]在高溫脅迫下檢測到控制千粒重的QTLs 分布于2A、2B、3B、4B、5D、6D 染色體上，與本研究結果不盡相同，也說明了小麥耐熱機制的復雜性。

本研究檢測到的控制旗葉干尖指數(shù)的QTLqFLS－7B在濟南和陵城兩地穩(wěn)定存在，標記區(qū)間為AX－108861535～AX－109325469，加性效應為負值，位點增效等位基因來源于母本菏麥13?？刂魄ЯＶ責岣兄笖?shù)的QTLqITKW－7B在兩年三點試驗中穩(wěn)定存在，標記區(qū)間為AX－108762687～AX－111137553，加性效應為正值，位點增效等位基因來源于父本臨麥2 號。以旗葉干尖指數(shù)和千粒重熱感指數(shù)兩個性狀為鑒定指標均在7B 染色體上定位到與耐熱相關的QTL，表明7B 染色體上很可能存在響應高溫脅迫的基因。白海波[20]、Paliwal[26]和Mohammadi[27]等均在7B 染色體上檢測到與耐熱性有關的QTL 也證實了這一推論。這可為進一步研究耐熱機制及挖掘新的耐熱基因提供一定的理論支撐。同時用于小麥耐熱QTL定位的鑒定指標較多，選擇合適且有效的鑒定指標有助于提高定位精度，加快育種進程，本研究以旗葉干尖指數(shù)和千粒重熱感指數(shù)作為耐熱鑒定指標取得了較好QTL 定位結果，可為選育小麥耐熱新品種提供借鑒。