小反芻獸疫基因工程疫苗的研究進展

郗珊珊，賈偉娟，秦瑤，楚秋娟，李文博，何云江，孟慶磊，陳云嬌，王學(xué)理

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 內(nèi)蒙古良欣農(nóng)牧業(yè)開發(fā)有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3. 巴林左旗科技創(chuàng)新和成果轉(zhuǎn)化中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000 )

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus， PPRV)引起的一種危害嚴(yán)重的山羊、綿羊和野生小反芻獸高度接觸性傳染病。PPRV 屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，同屬的成員還包括牛瘟病毒(Rinderpest virus， RPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper vieus， CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus， PDV)及麻疹病毒(Measles virus，MV)等。PPRV 基因組全長15 948 nt，病毒粒子大多數(shù)呈圓形或橢圓形，直徑為130 ～ 390 nm，有囊膜包裹，主要包含N、P、M、F、H、L 六種結(jié)構(gòu)蛋白和C、V 兩種非結(jié)構(gòu)蛋白[1－3]，其結(jié)構(gòu)、復(fù)制周期及各蛋白功能分別如圖1、圖2、表1 所示。

表1 小反芻獸疫病毒編碼蛋白

圖1 PPRV 結(jié)構(gòu)示意圖[15]

圖2 PPRV 復(fù)制周期[16]

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PPRV 只有一個血清型，可分為4 個系，Ⅰ系主要分布在西非，Ⅱ系在尼日利亞、喀麥隆北部等地大量分布，Ⅲ系主要分布在非洲東部，Ⅳ系主要在中東和西亞地區(qū)流行。1942年P(guān)PR 首次發(fā)現(xiàn)于西非的科特迪瓦，之后擴散到阿拉伯半島、中東、南亞等地，2007年傳入我國西藏阿里地區(qū)，2013年后新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地陸續(xù)有該病的報道[4，5]。2015—2019年間，66 國向世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)報告了12 757 起疫情，亞洲和中東9 582 起，占75.1%；非洲3 166 起，占24.8%；歐洲(保加利亞)9 起，占0.1%。其中貝寧(480 起)、阿富汗(824 起)、伊朗(3 710 起)、科威特(761 起)和土耳其(402 起)這五個國家的PPR 疫情占比48.4%，迫切需要加強對PPR 的預(yù)防和控制[6]。PPRV 的潛伏期為2～7 d，以高熱、口腔黏膜糜爛、眼部分泌物增加、白細(xì)胞數(shù)量減少、腹瀉和呼吸困難為特征。通常在出現(xiàn)發(fā)熱癥狀后的4 ～ 6 d 內(nèi)迅速死亡，有著高發(fā)病率(可達100%)和高死亡率(可達90%)。該發(fā)病特點給PPRV 的臨床預(yù)防、診斷和治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，OIE 和糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)計劃將在2030年前徹底消除PPR[7，8]。

目前該病主要靠疫苗免疫進行預(yù)防，科研人員已研發(fā)出Nigeria 75/1、Sungri/96、Arasur/87 和Coimbatore/97 四種PPR 同源弱毒苗[9]，其中以Nigeria 75/1 和Sungri/96 應(yīng)用最為廣泛，可對四種譜系的PPRV 產(chǎn)生良好的保護性免疫[10－13]。但是這種疫苗還不能達到區(qū)分疫苗毒株和野毒株感染(differentiation of infected versus vaccinated animals， DIVA)以及安全高效的效果，因此新型疫苗的研發(fā)顯得尤為重要[14]。隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展，基因工程苗研究也隨之成熟，并且有著與弱毒疫苗相似的效果，有望進行大規(guī)模應(yīng)用。

1 重組亞單位疫苗

F 蛋白和H 蛋白是PPRV 囊膜表面的兩種糖蛋白，均可誘發(fā)保護性免疫應(yīng)答，其中H 蛋白相較F 蛋白能產(chǎn)生更高水平的中和抗體，是宿主免疫應(yīng)答的主要靶點，因此H 蛋白是目前PPR 亞單位疫苗和重組活載體疫苗的主要免疫性抗原[24]。在研究中可將表達H 和F 蛋白的桿狀病毒用作亞單位疫苗的抗原，它們能引起強烈的中和抗體反應(yīng)，卻不能對強毒株提供免疫保護，但將桿狀病毒表達的H 蛋白嵌入免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)中，就可對強毒攻擊起到較好的保護作用[25]。其中ISCOM 能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此該反應(yīng)可能是誘導(dǎo)針對PPRV 的保護性免疫反應(yīng)的主要因素。

目前已有多種原核和真核表達系統(tǒng)用于制備病毒樣顆粒(virus－like particle， VLP)，VLP 僅由PPRV 衣殼蛋白組成，缺乏感染性基因組，其結(jié)構(gòu)模擬親本病毒粒子的構(gòu)象和組織，卻不能在細(xì)胞內(nèi)進行自我復(fù)制[26]。桿狀病毒是昆蟲的主要病原體，研究者構(gòu)建了重組桿狀病毒來共表達PPRV－H、N 和M 蛋白，可使昆蟲細(xì)胞膜上的VLP出芽增殖，同時發(fā)現(xiàn)這些VLP 還可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)大量的病毒特異性中和抗體，這表明基于VLP制成的疫苗具有抗PPRV 的潛力[27，28]。有研究發(fā)現(xiàn)，僅M 蛋白的表達就足以組裝和釋放PPRV的VLP，單獨通過F 蛋白的表達也可支持低水平的VLP 裝配，但在不存在M 的情況下未觀察到VLP 的釋放，進一步突顯了M 蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白在VLP 裝配和釋放中的關(guān)鍵作用[23]。

利用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達VLP 已被證明是疫苗研發(fā)的有效策略，Engerix－B，Porcilis和Cervarix 等基于VLP 的疫苗已經(jīng)獲得商業(yè)化許可。基于VLP 制成的疫苗，通常是利用病毒疫苗株序列構(gòu)建的，然而，由于某些結(jié)構(gòu)蛋白翻譯后糖基化修飾的改變和遺傳物質(zhì)的缺乏，衍生自疫苗株的VLP 的免疫原性并不總是最佳，需要通過測定進行判斷。Yan 等[29]利用桿狀病毒對PPRVM、H 和F 蛋白表達后，產(chǎn)生了兩種PPRV VLP 候選毒株，分別來自Ⅳ系Tibet/30 毒株和Ⅱ系Nigeria 75/1 疫苗株；使用這些VLP 來免疫小鼠、山羊和綿羊，二次免疫后發(fā)現(xiàn)兩種PPRV 的VLP 都能夠在小鼠、山羊和綿羊體內(nèi)引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，與Nigeria 75/1 VLP 相比，Tibet/30毒株的VLP 表現(xiàn)出更大的免疫原性。以上研究表明兩種PPRV VLP 都是控制和根除PPR 的合適候選疫苗株，而Tibet/30 VLP 由于具有更大的免疫原性而成為最有前途的候選疫苗株。

2 活載體疫苗

2.1 痘病毒載體

痘病毒因其基因組容量大、含有大量的非必需基因、可載入大片段的外源基因而被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因載體病毒疫苗。孫一瑞等[30]利用egfp報告基因和gpt篩選基因篩選純化了包含PPRV H 基因的重組綿羊痘病毒(Sheeppox virus，SPV)，將其經(jīng)皮內(nèi)注射105.5TCID50免疫綿羊，結(jié)果顯示該疫苗能夠誘導(dǎo)綿羊產(chǎn)生高滴度的抗PPRV 特異性中和抗體，抗體陽轉(zhuǎn)率達100%，并且外源H 基因的插入并未影響親本病毒的復(fù)制，為研究PPR 新型痘病毒重組疫苗的研制提供了理論依據(jù)。Chen 等[31]研究制備了表達PPRV H和F 蛋白的重組羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)rCPV－PPRV－H 和rCPV－PPRV－F，發(fā)現(xiàn)相比于rCPV－PPRV－F，rCPV－PPRV－H 能誘導(dǎo)更強的PPRV 中和抗體，首次免疫rCPV－PPRV－H 后，羊群的血清轉(zhuǎn)化率大于80%，6 個月后進行二次接種，免疫效果更強，可保護山羊免受強毒株攻擊。Chandran 等[32]利用安卡拉病毒(MVA)構(gòu)建了兩種重組痘病毒MVA－F 和MVA－H，用105空斑形成單位(pfu)的MVA－F 和MVA－H 通過肌肉注射免疫山羊，結(jié)果顯示，該疫苗安全性較好，未出現(xiàn)不良反應(yīng)，即使是免疫4 個月后的山羊依然具有抵抗PPRV 攻擊的能力。痘病毒載體疫苗盡管被發(fā)現(xiàn)具有相對的熱穩(wěn)定性，但并沒有激活最佳的抗體反應(yīng)，此外，使用痘病毒載體重組疫苗時疫苗接種員的安全性也不容忽略。

2.2 腺病毒載體

腺病毒載體疫苗能誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，這種T 細(xì)胞反應(yīng)通常是模擬了病原體誘導(dǎo)的保護性反應(yīng)，最常用的為人5 型腺病毒(Ad 5)[33]。Ad 5 被認(rèn)為是一種較好的用于小型反芻動物的重組載體，由于動物對該種載體缺乏先天免疫力，因此可達到更好的免疫效果。

研究發(fā)現(xiàn)將PPRV－H 和F 基因插入腺病毒載體構(gòu)建的Ad－H 和Ad－F 疫苗，對山羊進行單獨免疫和聯(lián)合免疫，均可誘導(dǎo)高效抗體和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，但Ad－H 和Ad－F 聯(lián)合使用比Ad－H或Ad－F 單獨使用誘導(dǎo)的保護效果更好[34，35]。Holzer 等[36]為了確定表達PPRV－H、F 蛋白的Ad制成疫苗的最低劑量，對東非PPR 常發(fā)國家肯尼亞的山羊展開了研究，發(fā)現(xiàn)僅需107pfu 的Ad－H或108pfu 的Ad－F 就可保護機體不受野生型PPRV 的攻擊，同時還發(fā)現(xiàn)由108pfu(Ad－H＋Ad－F)組成的疫苗可能對山羊提供無菌保護，并且聯(lián)合使用Ad－H 和Ad－F 比單獨使用Ad－H 具有更強的保護作用。Rojas 等[37]檢測到，在接種重組Ad 5 疫苗和感染PPRV 后觸發(fā)的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)十分相似，在PPRV 強毒株攻擊下可激活A(yù)d 5－F 和Ad 5－H 疫苗誘導(dǎo)的CD4＋、CD8＋T 記憶細(xì)胞分化。這些研究表明使用表達PPRV 基因的重組腺病毒疫苗可在機體受到PPRV 攻擊后，誘導(dǎo)T 細(xì)胞大量增殖起到保護作用。

有研究者對表達PPRV－F 和H 蛋白的重組雞痘病毒與Ad 5 載體疫苗進行了免疫效果比較，發(fā)現(xiàn)Ad 5 載體疫苗誘導(dǎo)了更高水平的病毒特異性抗體和中和抗體，并激發(fā)了更多數(shù)量的CD8＋T細(xì)胞，同時還發(fā)現(xiàn)，無論是否添加集落刺激因子或綿羊白細(xì)胞介素－2(IL－2)，Ad－H 均能在免疫4個月后誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生較強的抗體和細(xì)胞免疫，并能完全保護山羊免受PPRV 強毒株的攻擊[38，39]。重組腺病毒載體疫苗具有高度免疫原性，可誘導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫，是能夠區(qū)別自然感染動物與疫苗接種感染動物的疫苗。

3 核酸疫苗

PPR 核酸疫苗是將編碼PPRV 抗原的基因制成疫苗，再接種到動物體內(nèi)使之可在機體內(nèi)進行表達，并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，從而起到免疫的效果。核酸苗接種后與自然免疫相似，不存在毒力返強和散毒的風(fēng)險，是由于在激發(fā)機體細(xì)胞免疫的同時還激發(fā)了體液免疫。Wang 等2013年構(gòu)建了一種基于西門利克森林病毒(SFV)復(fù)制子的自殺DNA 疫苗，并測試了其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性的能力，首先將克隆的PPRV H 基因插入SFV復(fù)制子載體pSCA1 中，再將pSCA1－H 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK－21 細(xì)胞中，最后通過Western blot 來檢測表達蛋白的抗原性。將pSCA1－H 質(zhì)粒通過肌肉注射入BALB/c 小鼠體內(nèi)，共注射3 次，每次間隔兩周，檢測結(jié)果表明pSCA1－H 可在BHK－21 細(xì)胞中表達H 蛋白，并且可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性抗體、中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[40]；2015年又利用同樣的方法對表達PPRV－F 基因構(gòu)建的pSCA1－F 質(zhì)粒的抗原性進行了測試，結(jié)果表明pSCA1－F 也可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)同樣的反應(yīng)，并且pSCA1－F 在初次免疫小鼠24 h 后，白細(xì)胞介素(IL－2、IL－10)含量不斷升高，干擾素(IFN－γ)和腫瘤壞死因子(TNF－α)也從此時開始上升，之后逐漸下降，這種自殺性DNA 疫苗為PPR 新型疫苗的研發(fā)提供了新思路[41]。由此可見核酸苗具有同時引起細(xì)胞免疫和體液免疫的特性，還具有抗體產(chǎn)生制備周期短、效價高、儲存條件簡單等優(yōu)點。

4 反向遺傳學(xué)技術(shù)重組苗

反向遺傳學(xué)技術(shù)可從遺傳上改變病毒RNA組成，用于添加標(biāo)記基因(陽性標(biāo)記疫苗)或刪除抗原成分(陰性標(biāo)記疫苗)，利用這種方法操控PPRV 基因組來引入特異性突變位點，從而為疫苗的研發(fā)提供了一種新的思路[42]。有研究者為了從血清學(xué)上區(qū)分野毒株和疫苗毒株，利用反向遺傳技術(shù)建立了帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的PPRV 重組疫苗，同時還構(gòu)建了表達PPRV－H 和F 基因的山羊痘病毒(Goatpox virus，GPV)活載體苗，這種情況下只需要對PPRV－H 或F 基因進行檢測就可有效區(qū)分疫苗株和野毒株，如果在注射過疫苗的動物體中檢測到H 或F 蛋白的抗體，那么證明其感染毒株為野毒株，反之則證明為免疫毒株感染，注射此種疫苗可同時預(yù)防PPRV 和SPV 的感染[43]。Muniraju 等[44]通過反向遺傳學(xué)技術(shù)，利用PPRV Nigeria 75/1 疫苗株研發(fā)了一種rPPRV－C77 重組苗，注射山羊后沒有表現(xiàn)出任何不良反應(yīng)，但是，該疫苗在PPRV 血凝素(H)包膜糖蛋白上缺乏C77 單克隆抗體的結(jié)合位點，對此需要進行更深入的研究。使用反向遺傳學(xué)方法研發(fā)的疫苗的一個潛在問題是，標(biāo)記蛋白可能會被整合到病毒的包膜中，因此可能會改變宿主的趨向性和致病性。

各疫苗優(yōu)缺點具體見表2。

表2 幾種疫苗的優(yōu)缺點

5 展望

動物在接種疫苗后由于接種時間、接種部位、母源抗體及疫苗配制時間等原因會造成不同的免疫效果[45]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，90 日齡以上的羊群免疫后抗體合格率和抗體水平最高，具有母源抗體的羔羊100 日齡為最佳免疫時間；頸部皮下注射優(yōu)于肌肉注射，但兩者均能獲得一定水平的免疫效果。魯立柱等[46]對初免21 d 后羊群進行了第二次免疫，同時監(jiān)測不同時間血清中抗體濃度，結(jié)果顯示，初免21 d 抗體滴度平均可達5.18±2.87；二次免疫后3、7、14、21 d 平均滴度分別為5.65±2.56、6.95±1.82、7.28±1.18、8.12±1.31，呈上升趨勢，試驗表明，對已經(jīng)有PPR 抗體的羊進行二次免疫可增強免疫效果。嚴(yán)斯剛等[47]為測試PPRV 疫苗配置后不同時間接種的免疫效果，將疫苗配置后1、1～2、2～3、5～6 h 分別免疫本地山羊，并在接種后當(dāng)天和30、120 d 分別測定抗體水平，結(jié)果顯示前三組在30 d 和120 d 抗體阻斷率均在85%以上，表明稀釋后的疫苗在3 h 內(nèi)用完均有良好的免疫效果。

由于內(nèi)蒙古地區(qū)得天獨厚的生態(tài)環(huán)境和我國畜牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，蒙東地區(qū)肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，個別養(yǎng)殖企業(yè)由于飼養(yǎng)管理體系、防疫體系不健全導(dǎo)致一些羊源病毒性疾病頻繁發(fā)生，給個體養(yǎng)殖戶及大型養(yǎng)殖場均造成了一定的經(jīng)濟損失。但到目前為止，還未研發(fā)出一種各方面都完美的疫苗，其中應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)弱毒苗和滅活苗無法將接種疫苗的動物與自然感染的動物區(qū)分開來，而基因工程苗有實現(xiàn)這一目標(biāo)的可能。減毒活疫苗免疫效果好卻不耐熱，需要健全的冷鏈運輸系統(tǒng)送到現(xiàn)場，故還需要研發(fā)一種熱穩(wěn)定性疫苗，但技術(shù)及基因工程苗在研發(fā)上還存在一些問題，需要更深入的探索。此外，還應(yīng)研發(fā)氣霧劑、滴眼液疫苗，為大規(guī)模免疫提供方便。防止病毒傳播所需的群體免疫水平為80%，然而，阻止PPR 有效傳播所需的確切群體免疫水平需要進一步研究。綜上所述，新興的PPR 基因工程疫苗和減毒活疫苗在實驗室研究中取得了飛躍性進展，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但研制安全高效的疫苗仍存在很多問題，如病毒的易變異性、保護性抗原的不確定性、活載體的不穩(wěn)定性、免疫效果的評價指標(biāo)不健全等，這將導(dǎo)致未來PPR 疫苗的發(fā)展仍然艱辛。