兒童腹瀉病原體常用檢測方法研究進(jìn)展*

約爾蘭姆·托合提，陸 妍，朱雨悅 綜述，金 玉△ 審校

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210093；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科，江蘇南京 210008

感染性腹瀉是指由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起的以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的胃腸道傳染病，其對兒童健康造成極大威脅[1]。據(jù)《柳葉刀》雜志報道，2019年腹瀉是5歲以下兒童死亡的第三大原因，占全球5歲以下兒童死亡人數(shù)的9.9%(95%CI：9.0%～28.0%)[2]。近3年全球新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染情況的相關(guān)研究表明，腹瀉是SARS-CoV-2感染患兒的常見臨床表現(xiàn)，并且從糞便排出病毒的時間可持續(xù)50 d[3-4]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測引起腹瀉的病原體顯得尤其重要。早期診斷和治療可改善腹瀉患兒預(yù)后，降低醫(yī)療成本，而腹瀉病原體的快速檢測是感染性腹瀉早期診斷和合理用藥的基礎(chǔ)[5-7]。目前常見的腹瀉病原體檢測方法大致分為兩類，即傳統(tǒng)檢測方法和新型分子診斷方法。然而，這些方法的檢測效率因原理和目標(biāo)的不同而有所差異，本文總結(jié)了目前臨床上常見的傳統(tǒng)和新型腹瀉病原體檢測方法，以期為臨床提供參考。

1 傳統(tǒng)檢測方法

1.1顯微鏡檢測 顯微鏡檢測又稱為鏡檢法、涂片法，臨床上主要用于疑似隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲等寄生蟲感染患兒的實(shí)驗診斷[1,8]。鏡檢法的優(yōu)勢在于無須使用額外試劑，檢測周期短，可同時檢測2種以上的腹瀉病原體。然而，鏡檢法需要集卵或特殊染色，靈敏度低，結(jié)果客觀性欠佳，要求檢查者具有豐富的專業(yè)知識和檢測經(jīng)驗[8-9]。

1.2免疫學(xué)檢測技術(shù) 臨床上應(yīng)用比較廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)有金標(biāo)免疫層析法(金標(biāo)法)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。二者主要基于抗原抗體的特異性結(jié)合及顯色反應(yīng)原理來檢測腹瀉患兒糞便中輪狀病毒、諾如病毒、艱難梭菌等病原體抗原[10]。其中，金標(biāo)法具有操作簡便、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，只需肉眼判斷顯色帶顏色，無須借助額外儀器[10-11]。然而，金標(biāo)法受顯色反應(yīng)信號強(qiáng)度、病原體載量等因素影響，靈敏度低于常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[12]，并且通常是單一病原體檢測，無法對復(fù)合感染的患兒進(jìn)行全面診斷[11]。相對金標(biāo)法，ELISA更靈敏、特異，而且通量高，如單次檢測標(biāo)本可達(dá)96份；但是隨著金標(biāo)法的出現(xiàn)，我國ELISA在兒童感染性腹瀉病中應(yīng)用逐漸減少，主要是因為該檢測方法需要配備酶標(biāo)儀，且操作步驟較多，檢測時間較長[9,13]。

1.3培養(yǎng)法 培養(yǎng)法在兒童腹瀉病原體檢測中應(yīng)用廣泛，用于大多數(shù)細(xì)菌或真菌的鑒定及耐藥性檢測，為抗菌藥物的合理使用提供參考[14-15]。與鏡檢法、免疫學(xué)檢測比較，培養(yǎng)法主要優(yōu)點(diǎn)是通量高、特異度高、檢測成本低[10]。然而，該方法最大的缺點(diǎn)是檢測時間長，獲取檢測結(jié)果的時間有數(shù)天不等，這導(dǎo)致急性腹瀉患兒病原學(xué)診斷的延遲[5]。此外，該方法靈敏度低，結(jié)果受抗菌藥物使用、病原體載量、培養(yǎng)基選擇性等因素影響[14,16]，并且操作步驟繁雜，常需要手動操作。

1.4常規(guī)PCR PCR通過DNA互補(bǔ)配對進(jìn)行DNA體外合成，并對相應(yīng)基因片段進(jìn)行檢測。目前，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)在兒童感染性腹瀉的實(shí)驗室診斷及研究中應(yīng)用廣泛，主要用于輪狀病毒、諾如病毒等單一病原體的鑒定和亞型的鑒別[13]。PCR靈敏度高于鏡檢法、免疫學(xué)檢測和大便培養(yǎng)，能鑒定低載量病原體[9,16]。然而，該方法只能針對臨床高度懷疑的病原體進(jìn)行檢測，檢測目標(biāo)單一，存在假陰性的可能[14]。另外，實(shí)驗中的有機(jī)溶劑殘留物等對DNA合成有抑制作用，有假陰性的風(fēng)險[16]。

2 新型分子診斷方法

新型分子診斷方法在病原體核酸或者基因片段水平上明確病原體。常用技術(shù)有核酸擴(kuò)增法、基因芯片法和高通量測序等，但是臨床上應(yīng)用更廣泛的是基于這些分子診斷技術(shù)的眾多商業(yè)化檢測板或檢測系統(tǒng)，以提高病原體檢測效率。新型分子診斷方法可以同時檢測多種病原體[1]，并在病原體未知的情況下檢測可能的致病原[17-18]。然而，也有研究提到，由于新型分子診斷技術(shù)靈敏度高，甚至可檢測到極低載量病原體，而患兒可能并無相應(yīng)癥狀，因此檢測結(jié)果需結(jié)合臨床進(jìn)行合理解釋[19]。

2.1FilmArray胃腸道感染檢測板(FA-GP) 美國BioFire公司的FA-GP是以多重?zé)晒釶CR技術(shù)為基礎(chǔ)的自動化檢測板[6]。AXELRAD等[7]將FA-GP和傳統(tǒng)方法(鏡檢法、ELISA法、細(xì)菌培養(yǎng)法)檢測結(jié)果相比較，結(jié)果顯示FA-GP總檢出陽性率(29.2%)明顯高于傳統(tǒng)方法(4.1%)，并且FA-GP的使用可以有效地減少內(nèi)鏡檢查、放射性檢查和抗菌藥物的使用。與其他新型分子診斷方法比較，F(xiàn)A-GP具有高度自動化、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，其檢測性能的評估一直是研究熱點(diǎn)[6-7,18]。

2.2Luminex胃腸道病原檢測板(GPP) 美國Luminex公司的GPP是基于多重PCR技術(shù)和微球雜交陣列綜合應(yīng)用的檢測板[18,20]。一項臨床研究結(jié)果顯示，GPP檢測慢性腹瀉患兒的臨床糞便標(biāo)本的陽性率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法(鏡檢法、ELISA法、細(xì)菌培養(yǎng)法)，而且GPP對腸道病原體檢測的靈敏度和特異度均較高[15]。一項Meta分析顯示，GPP和FA-GP這兩種新型檢測板均可為早期識別腹瀉病原體提供重要的診斷信息，而對于大多數(shù)腹瀉病原體而言，GPP靈敏度和后驗概率較FA-GP低[21]。

2.3BD Max檢測系統(tǒng) 常用的BD Max檢測系統(tǒng)為美國BD公司的腸道病原體測試及BD Max腸道細(xì)菌擴(kuò)展檢測板。BD Max腸道病原體測試是以多重PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的病原檢測方法。BD Max腸道病原體測試包括3個獨(dú)立模塊，分別用于檢測常見細(xì)菌、病毒和寄生蟲，各模塊可單獨(dú)選擇或疊加使用[20]。BD Max腸道擴(kuò)展檢測板，用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、弧菌和志賀單胞菌，作為對常用細(xì)菌模塊的補(bǔ)充[22]。大多研究僅評價了BD Max單個模塊的檢測表現(xiàn)。例如，STOKES等[23]報道，BD Max病毒測試與PCR擴(kuò)增聯(lián)合測序比較，二者對糞便標(biāo)本中的諾如病毒、札如病毒、星狀病毒、輪狀病毒和腺病毒檢測的陽性符合率分別為92.8%、84.9%、93.0%、100.0% 和 95.6%，陰性符合率均≥99.4%，結(jié)果表明BD Max病毒測試可有效診斷由以上病毒引起的腸道疾病，適用于腸道病毒高?；颊叩呐R床篩查。BD Max檢測系統(tǒng)的特點(diǎn)是針對不同病原體設(shè)有4種檢測模塊，可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇，便于攜帶和操作[22-23]。同樣，如果對模塊選擇不當(dāng)，可能會導(dǎo)致病原體漏檢。

2.4Seegene Allplex胃腸病原檢測系統(tǒng)(Seegene Allplex-GI) 韓國Seegene公司的Seegene Allplex-GI是一種基于qRT-PCR技術(shù)的病原體檢測方法[7]。與BD Max檢測系統(tǒng)類似，該檢測系統(tǒng)針對常見細(xì)菌、少見細(xì)菌、病毒、寄生蟲有4種病原體檢測模塊[20,24]。各模塊可根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)單獨(dú)選擇或疊加使用，如大便隱血試驗陽性者可選用兩種細(xì)菌檢測模塊的組合[7]。MARTN等[25]將Allplex細(xì)菌檢測模塊與大便培養(yǎng)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在394份臨床糞便標(biāo)本中，二者的檢出陽性率分別為66.2%和27.7%；將結(jié)果不一致的標(biāo)本經(jīng)多重PCR驗證時發(fā)現(xiàn)，大便培養(yǎng)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定漏檢了44份標(biāo)本，而Allplex漏檢了5份標(biāo)本；Allplex細(xì)菌檢測模塊對引起兒童腹瀉的病原體的靈敏度和特異度均>95%。該系統(tǒng)還可鑒別輪狀病毒、諾如病毒和腺病毒等5種常見病毒的不同基因型，這有助于兒童病毒性腹瀉的流行病學(xué)觀察和研究[26]。但由于與BD Max同樣包含多個檢測模塊，Allplex系統(tǒng)也同樣具有可選擇性高的優(yōu)點(diǎn)和漏檢的風(fēng)險[20]。

2.5QIAstat-Dx胃腸病原檢測板(GIP) GIP是一種集成了核酸提取、PCR和熒光擴(kuò)增檢測的多重PCR系統(tǒng)。一項多中心臨床研究采用385份糞便標(biāo)本評估GIP的檢測性能，并與FA-GP進(jìn)行比較，將結(jié)果不一致的標(biāo)本采用Allplex系統(tǒng)進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示GIP的檢測靈敏度為98.2%，提示GIP檢測范圍廣，靈敏度好[27]。研究顯示，GIP可用于兒童腹瀉病早期診斷，從而降低病原體傳播的風(fēng)險，進(jìn)一步降低醫(yī)療費(fèi)用[27-28]。

2.6TaqMan微流控芯片(TAC) 美國Life Technologies公司的TAC是一種qRT-PCR技術(shù)和微流控芯片相結(jié)合檢測系統(tǒng)[29]。TAC對每份標(biāo)本可檢測48種目標(biāo)病原體，并且可以根據(jù)需要定制病原體測試模塊[30]。其中，病毒測試可檢測胃腸炎病毒不同基因型，而細(xì)菌測試可檢測大腸埃希菌的耐藥基因[31-32]。一項多中心研究對比GPP、多重PCR和TAC對15種腸道病原體的檢測性能，并與細(xì)菌培養(yǎng)、ELISA、常規(guī)PCR進(jìn)行了比較[16]。結(jié)果顯示，GPP、多重實(shí)時PCR和TAC對15種腸道病原體檢測的靈敏度分別為86.2%、94.1%、90.2%，特異度均≥95%；而傳統(tǒng)方法靈敏度因靶標(biāo)不同波動在20%～85%，特異度為97.3%。結(jié)果證明GPP、多重實(shí)時PCR和TAC均有很好的檢測性能和臨床表現(xiàn)，靈敏度高于傳統(tǒng)方法。

2.7高通量測序 高通量測序又稱為二代基因測序，是一種同時測序數(shù)千到數(shù)十億個DNA片段的技術(shù)。目前已上市的高通量測序產(chǎn)品種類較多，使用最廣泛的是Illumina系列測序檢測板，如iSeq、MiSeq和MiniSeq等[14]。高通量測序(非靶向測序)覆蓋范圍最為廣泛，不僅可以發(fā)現(xiàn)潛在病原體，還能檢測致病菌的耐藥性基因，甚至能檢測到病原體在遺傳基因上發(fā)生的突變[32]。因此，不僅能為患兒提供個體化的治療方案，也可為進(jìn)一步研究提供更多的基因序列數(shù)據(jù)[33-34]。然而，該測序在兒童感染性腹瀉病原體檢測中不宜作為首選，因為其易受人類、腸道菌群和食物等干擾基因的影響，要求參考更多的基因序列數(shù)據(jù)[14,33-34]。同時，高通量測序價格較昂貴，需要平臺建設(shè)和生物信息學(xué)團(tuán)隊的支持，因此更多用于一些病因不明確、培養(yǎng)較困難的病原體(如艱難梭菌等)檢測或病原體基因研究中[13,27]。

綜上所述，臨床上被廣泛應(yīng)用的商業(yè)化檢測系統(tǒng)的性能比較見表1。

表1 各腹瀉病原體檢測系統(tǒng)的性能比較

3 小 結(jié)

相對于傳統(tǒng)檢測方法，新型分子診斷方法在病原體種類覆蓋度、檢測耗時、靈敏性、自動化程度、遠(yuǎn)期醫(yī)療負(fù)擔(dān)等方面均具有獨(dú)到的優(yōu)勢。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子診斷技術(shù)成本也將不斷降低，兒童感染性腹瀉病有望實(shí)現(xiàn)快速、全面、高靈敏度、高特異度、低成本的檢測，從而早期明確導(dǎo)致腹瀉的病原體，指導(dǎo)臨床合理用藥，預(yù)防病原體傳播，降低醫(yī)療費(fèi)用。