基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究丹參治療漿細胞性乳腺炎的作用機制

潘伍亮，張姜宇，許春燕，曾熠，潘宗宇，游元元

(成都醫(yī)學院 藥學院，四川成都 610500)

漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis，PCM)亦稱乳腺導管擴張癥，是以導管擴張、導管周圍炎癥及漿細胞浸潤為基礎(chǔ)的一種乳腺慢性非細菌性炎癥，臨床表現(xiàn)為乳頭溢液，乳暈下腫塊、乳房局部疼痛不適，化膿潰破后易反復發(fā)作形成瘺管, 經(jīng)久難愈[1-2]。目前西醫(yī)治療以藥物和手術(shù)為主，但藥物治療效果不盡如人意，而手術(shù)切除則不僅會影響乳房外觀，還有較高的復發(fā)率[3-4]。中醫(yī)將PCM歸于乳癰的范疇之內(nèi)，認為該病為肝氣郁結(jié)、血瘀凝聚所致[5]，治療手段有以中藥復方為主的內(nèi)治法，也有包括引流法、墊棉法、箍圍法等的外治法[6]。

在PCM的內(nèi)治法中丹參使用頻率較高[7]。國家級名中醫(yī)周玉朱教授的經(jīng)驗方——丹參化瘀湯對此病有良好的治療效果[8]，消乳散結(jié)湯、蒲公英柴胡湯、柴芩消癰湯等臨床治療PCM的方劑中亦含有丹參。五代時期典籍《日華子本草》記載丹參具排膿止痛、生肌長肉之功效，后世本草對該功效多有記載；宋代劉明之在《圖經(jīng)本草藥性總論》中記載了丹參具有排膿止痛、治惡瘡疥蘚的功效；明代李中梓在《醫(yī)案必讀》《頤生微論》《本草通玄》等多部著作中均強調(diào)了丹參散結(jié)的作用；《本草綱目》丹參項下則記載了以丹參為君藥治療婦人乳癖的方劑。

丹參所含化合物甚多[9]，但治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。目前對于丹參的研究多集中在心腦血管疾病的治療或預(yù)防方面，對PCM 的治療機制研究甚少?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接分析丹參中有效成分對PCM的作用機制，以期為丹參治療PCM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 獲取丹參的藥物活性成分及其潛在作用靶點

以“丹參”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform ，TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中搜尋丹參的有效化學成分[10-11]，根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到的篩選結(jié)果，設(shè)置篩選條件藥物口服生物利用度(oral relative bioavailability，OB)≥30%，設(shè)置類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[12-15]。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到并下載藥物活性成分潛在靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫( https://www.uniprot.org/)對查詢到的藥物活性成分靶點進行靶點蛋白和基因信息校正，得到丹參有效成分的預(yù)測靶點。

1.2 構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

將1.1篩選得到的丹參的所有有效活性化合物及其對應(yīng)的靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建得到中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，確定合適的分析條件，分析得到丹參的主要活性化合物及主要作用靶點。

1.3 篩選PCM的疾病靶點并構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

利用GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫( https://www.disgenet.org/)，搜集PCM的相關(guān)靶點基因，對GeneCard數(shù)據(jù)庫取 Score值大于中位數(shù)的靶點作為PCM的潛在靶點[16]，對DisGeNET數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選條件為相關(guān)系數(shù)(Relevance score)≥1，限定研究物種為人類，對兩數(shù)據(jù)庫篩選出的疾病靶點進行整合去重，并剔除潛在致病靶點中在人體乳腺細胞內(nèi)不表達的基因靶點，得到PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將查詢到的疾病靶點轉(zhuǎn)換為UniProt ID，通過BioinfoGP數(shù)據(jù)庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools.html)的在線工具Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集，得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點[17]。并使用1.2得到的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與PCM的高關(guān)聯(lián)性靶點相映射，利用Cytoscape3.7.2軟件將結(jié)果可視化，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 交集治療靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)是指從生物體內(nèi)各種作用角度研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。將潛在治療靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇中置信度(minimum required interaction score=0.150)選項，構(gòu)建交集治療靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，導出數(shù)據(jù)于Cytoscapoe3.7.2軟件中分析。了解潛在治療靶點的互作信息，以degree值確定其中相對重要的靶點。

1.5 靶點的基因本體功能富集分析

將篩選得到的潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，以p≤0.05為篩選條件，選定研究條件限定為人類，進行基因本體( gene ontology， GO)生物過程、細胞組成、分子功能富集，并分析數(shù)據(jù)得到GO功能富集圖。

1.6 靶點的KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫v6.8、Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.htm)和KEGG API數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/rest/)進行京都基因與基因組百科全書 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集，探究丹參作用于PCM可能的生物功能和信號通路。對于每個給定的基因列表，通路和過程富集分析使用以下本體來源進行：KEGG Pathway、Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、CORUM、DisGeNET、PaGenBase、Transcription factor target、TRRUST、PANTHER Access和WikiPathways分析?；蚪M中的所有基因都被用作富集背景，利用KEGG API數(shù)據(jù)庫對所有潛在基因組的表達通路進行篩選。根據(jù)P(P< 0.01)[18]、最小計數(shù)為3 且富集因子> 1.5(富集因子是觀察到的計數(shù)與偶然預(yù)期的計數(shù)之間的比率)收集靶點基因，并根據(jù)其成員相似性將其分組到集群中。使用Cytoscape3.7.2對數(shù)據(jù)進行可視化網(wǎng)絡(luò)分析[19]，將其中每個節(jié)點代表一個作用靶點基因，以P大小著色，將Cytoscape3.7.2得到的視圖網(wǎng)絡(luò)與Metascape數(shù)據(jù)庫得到的基因列表分析報告結(jié)果進行對比，得到PCM可能的生物功能和信號通路。

1.7 分子對接

為進一步確認潛在疾病治療靶點與丹參有效成分的作用關(guān)系，選擇潛在作用靶點互作程度排名前三的編碼蛋白，在Protein Data Banks(PDB數(shù)據(jù)庫)(https://www.rcsb.org/)上查找其作用三維結(jié)構(gòu)，保留為PDB格式，使用autodock4.0軟件(基于Python語言-使用Python3.7軟件)與丹參主要活性化合物進行分子對接。以對接成功的蛋白和分子的結(jié)合自由能作為判斷方式，若結(jié)合自由能最強，則兩者親和力越大，越有可能實現(xiàn)分子與蛋白相互作用。

2 結(jié)果

2.1 丹參主要活性成分和相關(guān)靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共得到丹參活性化合物丹參65種，其中可結(jié)合靶點的有效成分共計59種，部分丹參有效活性成分見表1(全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1)。同時通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到丹參潛在作用靶點132個。

表1 部分丹參活性成分

2.2 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于Cytoscape3.7.2軟件分析結(jié)果，得到丹參的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-A)， 網(wǎng)絡(luò)共計191個節(jié)點，其中活性成分59個，藥物靶點132個，含有961條邊。以度值(degree)(可體現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中交互能力大小)作為判斷依據(jù)?？傻媚鹃夭菟氐亩戎底畲鬄?4，其次依次為丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、丹參酮，其度值分別為40、38、36、34。說明這5種藥物成分為丹參中作用靶點較多的重要活性成分。

2.3 篩選PCM潛在致病靶點構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

由GeneCard數(shù)據(jù)庫以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜集整合的PCM的相關(guān)靶點基因,經(jīng)過篩選，共有125個靶點與PCM相關(guān)聯(lián)。將所有篩選得到的疾病靶點與丹參有效活性成分作用靶點相映射，得到藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-B)。Venny 2.1軟件對丹參有效成分靶點與PCM的相關(guān)靶點基因取交集，得到丹參治療PCM關(guān)鍵靶點分析網(wǎng)絡(luò)并繪制Venn 圖(圖1)，分析結(jié)果得到潛在治療靶點共有10個，分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3。其中PGR、NR3C1、BCL2L1等3個基因度值最高，分別為8、7、3，且其發(fā)生作用分子多為丹參的有效成分。

圖1 丹參成分靶點與PCM疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn Diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma component ingredient targets and PCM disease targets

2.4 構(gòu)建潛在治療靶點PPI

根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果(圖2)，利用Cytoscape7.2.0分析其數(shù)據(jù)，可知此網(wǎng)絡(luò)圖共10個節(jié)點，42條邊，平均節(jié)點度值為8.4。依據(jù)度值排名，前4名分別為BCL2L1、IL-6、ICAM1和PGR，說明這4個靶點具有更強的交互作用，對疾病的影響更大。經(jīng)過進一步文獻[20-23]篩選確定，丹參對PCM治療的作用靶點主要為IL-6、ICAM1和PGR。

圖2 潛在作用靶點PPIFig.2 PPI network of potential target

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對10個潛在治療基因進行富集分析，得到14個生物過程(biological process，BP)、9個細胞組成(cell composition，CC)、6個分子功能(molecular function,MF)，具體結(jié)果見分析圖(圖見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2-C)。其中生物過程主要涉及細胞對藥物反應(yīng)的調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、趨化因子的正向調(diào)控、MAP激酶活性陽性調(diào)控等；細胞成分主要為細胞質(zhì)、外側(cè)質(zhì)膜,細胞核等；分子功能主要分為細胞因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、 RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性 DNA 結(jié)合等。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果篩選得到16條信號轉(zhuǎn)導通路，包括乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等，有關(guān)于PCM以及乳腺癌的通路共計兩條；第一條，通過直接影響Her-2或其他間接因素，放大PI3K激活PI3K信號通路，影響細胞增殖、存活、翻譯等生物過程，進而影響細胞分裂周期和細胞生物學過程，誘發(fā)炎癥或癌變；第二條，Jagged或Delta通過影響Notch，使Notch信號通路的Her-2過度表達，Her-2/neu在某些乳腺癌和卵巢癌細胞表面過度表達[24]，是乳腺癌變的標志?？傮w結(jié)果見圖3。對關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)進行分析[25]，通過對富集因子、P值及參與調(diào)控通路上的基因數(shù)進行綜合富集通路分析，得到各潛在靶點對生物生理功能的調(diào)節(jié)過程，結(jié)果按照P值大小著色(-logP>10著深橙色，6<-logP<10著橙色，-logP<6著淡橙色)繪制疾病靶點基因KEGG通路富集分析圖，見圖4。

注：相關(guān)信號通路采用紫色標記。圖3 丹參有效成分與乳腺癌及炎癥信號通路的相關(guān)靶點示意圖Fig.3 Schematic diagram of the relevant targets of the active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and the breast cancer and inflammation signaling pathways

注：按照P值大小著色，-log P>10著深橙色，6<-log P<10著橙色，-log P<6著淡橙色。圖4 疾病靶點基因KEGG通路富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of the enrichment analysis of disease target genes KEGG pathway

2.7 分子對接結(jié)果

為了進一步驗證上述篩選的關(guān)鍵成分與重要靶點的準確性，取藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中度值前五的有效活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與篩選出的潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、PGR、ICAM1的靶點蛋白進行相互結(jié)合實驗，以結(jié)合自由能作為篩選條件，結(jié)果15次對接嘗試均獲得成功，其結(jié)果均小于0，且結(jié)合自由能都在-8.368～-20.627 12 kJ/mol范圍內(nèi)，其中木樨草素與3種蛋白分子對接后結(jié)合自由能最小(圖5)，分別為-16.275 76 kJ/mol(圖5(a))、-18.325 92 kJ/mol(圖5(b))及-20.627 12 kJ/mol(圖5(c))，由分子對接結(jié)果可知木樨草素與疾病靶點結(jié)合最為容易且穩(wěn)定。說明木樨草素可能是治療PCM疾病過程中一個重要的活性成分，這就為進一步的研究提供了理論依據(jù)。

圖5 木樨草素與基因的分子對接圖Fig.5 Molecular docking map of luteolin and the gene

3 討論與結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法研究了丹參治療PCM的活性成分，并識別出其中關(guān)鍵的靶點及其調(diào)控的 KEGG 通路和GO生物學過程。

通過構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)以及分子對接驗證，顯示丹參的活性成分木樨草素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌與潛在作用靶點互作程度排名最高的IL-6、P6GR、ICAM1靶點基因?qū)?yīng)的蛋白確有分子結(jié)合的可能。其中，木樨草素可與6個潛在治療靶點(BCL2L1、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6)產(chǎn)生相互作用，提示木樨草素可能在PCM治療過程中發(fā)揮重要作用。此外，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、鼠尾草酚酮、二氫丹參內(nèi)脂、隱丹參醌、丹參酮因能與較多的疾病靶點交互，初步推測其可能在治療PCM中發(fā)揮一定作用。

通過將丹參活性成分靶點與PCM靶點映射后，得到10個潛在治療靶點，分別為BCL2L1、EDNRA、ERBB2、ICAM1、IFNG、IL-4、IL-6、NR3C1、PGR、STAT3，值得后續(xù)深入研究。其中NR3C1、PGR在10個潛在基因靶點中互作的丹參活性成分最多，同時也是degree值最高的兩個基因，提示二者的靶點與丹參有效成分交互作用最強。對潛在治療靶點構(gòu)成的PPI進行分析，可得到互作程度居于前兩位的靶點基因PGR(NR3C3)、IL-6。其中IL-6可介導IL-6產(chǎn)生，IL-6是由活化的單核巨噬細胞、B細胞等細胞分泌產(chǎn)生，是人體內(nèi)促炎細胞因子和抗炎性肌細胞因子[26]，IL-6作為抗炎細胞因子的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的活化來介導的[27]，并通過一系列生物效應(yīng)從而刺激人體免疫應(yīng)答[28]，臨床將其作為一個PCM的重要指標[29]，也有研究表明外界因素是通過IL-6/JAK2/STAT3途徑誘發(fā)PCM[30]，故丹參可能通過抑制此途徑發(fā)揮治療作用。PGR基因是編碼類固醇受體超家族的一個成員，負責編碼蛋白質(zhì)介導孕酮的生理效應(yīng)。孕酮在妊娠有關(guān)的生殖事件中起著核心作用，是否與PCM相關(guān)需要進一步研究[31-34]。

GO富集分析表明丹參可能的作用機制為調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞對藥物反應(yīng)、增加一氧化氮在體內(nèi)的含量、介導產(chǎn)生趨化因子、激活并加強MAP激酶活性、增強IL-6受體的拮抗等，KEGG富集分析表明丹參也可能是通過乳腺癌通路、癌癥信號通路、庫欣綜合征通路、NF-κB信號通路、卵巢類固醇合成通路等對PCM進行治療。而在NF-κB通路中，若藥物能抑制NF-κB活性，便可抑制細胞因子TNF-α，作為PCM另一關(guān)鍵指標TNF-α，藥物若能降低其在病灶的表達水平，則此藥物對PCM就具有良好治療效果[35-36]，說明此通路是丹參作用于PCM的一條作用通路。通過對NF-κB通路的分析，側(cè)面反映了丹參也可能通過上述其余通路作用于PCM。

綜上所述，中藥丹參治療PCM是通過多成分、多靶點、多途徑共同調(diào)控的結(jié)果。本研究初步揭示了其治療PCM的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制。在的后續(xù)研究中，將對本研究篩選的關(guān)鍵靶點和信號通路進行體內(nèi)外的實驗驗證。