當歸揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

郭田甜，房兆營，劉震遠，張微，畢艷艷，孫艷，關永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南貝特制藥有限公司，山東 臨沂 276006)

當歸屬于傘形科植物，入肝、心、脾經(jīng)，有補血活血、潤腸通便等功效[1]。當歸化學成分主要含有揮發(fā)油、有機酸類、多糖類、黃酮類等多種物質，而揮發(fā)油是當歸主要功效成分之一，含量約為1%[2-3]。揮發(fā)油大多由小分子物質組成，容易被機體快速吸收，大部分揮發(fā)油類具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌驅蟲及鎮(zhèn)痛等方面的藥理作用[4-5]。當前包含揮發(fā)油的中藥材廣泛，尤以傘形科[6]、唇形科[7]、菊科[8]、姜科[9]、蕓香科[10]等科含量較為豐富。近年來，含揮發(fā)油類的中藥材在保健、醫(yī)療、日用產(chǎn)品等方面的研究日益增多，展現(xiàn)出廣闊的應用前景。

揮發(fā)油提取方法一般分為有機溶劑萃取法[11]、超臨界萃取法[12]與水蒸氣蒸餾法[13]等，前兩種提取方法具有操作繁瑣、成本高、環(huán)境污染嚴重等缺點，而水蒸氣蒸餾法克服了以上問題，成為了提取方法研究熱點。齊巧明等[14]用水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油并優(yōu)化了提取工藝，結果表明該法揮發(fā)油提取率高，操作方法可行，工藝參數(shù)穩(wěn)定。除此之外，大部分揮發(fā)油都具有抗氧化的藥理作用，當機體內自由基含量過高時，對機體內的核酸、蛋白質等產(chǎn)生破壞，加速機體代謝、衰老，而揮發(fā)油能夠有效清除體內自由基類物質，有益于維持身體健康[15]。目前，當歸藥材的研究主要集中在栽培種植和藥理作用方面，但對當歸揮發(fā)油的抗氧化性報道相對較少，所以此方面的研究與應用非常必要。

本文以水蒸氣蒸餾法提取當歸揮發(fā)油，以當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間作為考察因素。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對提取工藝進行了優(yōu)化，篩選出最佳工藝條件參數(shù)，并對所提取的揮發(fā)油進行了抗氧化研究，為日后當歸揮發(fā)油大規(guī)模提取生產(chǎn)及中藥材資源的綜合開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

當歸藥材來源于魯南厚普制藥有限公司，經(jīng)魯南厚普制藥有限公司質檢中心高級工程師范建偉鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典(一部)》[16]來源規(guī)定；無水乙醇(分析純)，天津天力化學試劑有限公司；抗壞血酸(純度99%)，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，美國Sigma-Aldrich生物技術公司。

1.2 試驗儀器

S-10揮發(fā)油提取器，天津歐普化學儀器有限公司； MS1003TS02型電子天平，梅特勒-托利多有限公司；KM-1型可調控溫電熱套，鄄城華魯電熱儀器有限公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，北京賽默飛科技有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；SPECORD 210 PLUS紫外分光光度計，江蘇精誠儀器設備有限公司。

1.3 當歸揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1.3.1 當歸揮發(fā)油提取工藝

使用水蒸氣蒸餾法，取當歸粉碎后過篩，將400 g當歸顆粒置于圓底燒瓶中，加自來水3～7倍加熱回流，提取4～8 h后停止蒸餾，將藥液靜置冷卻，待油水分離后收集揮發(fā)油。

1.3.2 單因素試驗設計

經(jīng)預試驗確定將當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間3個因素作為當歸揮發(fā)油提取工藝的考察對象，結果表明當歸粒徑可取值范圍為10～80 目，加水倍數(shù)可取值范圍為當歸質量的3～7倍，煎煮時間可取值范圍為4～8 h，由此設計單因素試驗：各組平行均稱取400 g陰干后的當歸，固定加水倍數(shù)5倍，煎煮時間6 h，分別考察10、24、50、65、80 目篩粉碎粒徑對揮發(fā)油提取率的影響；固定當歸粒徑50 目，煎煮時間6 h，分別考察3、4、5、6、7倍加水量對揮發(fā)油提取率的影響；固定當歸粒徑50 目，加水倍數(shù)5倍，分別考察4、5、6、7、8 h煎煮時間對揮發(fā)油提取率的影響。

按2020年版《中國藥典(四部)》[17]中揮發(fā)油測定甲法測定當歸揮發(fā)油提取率，具體計算方法見式(1)。

(1)

式中，V為當歸揮發(fā)油出油量，mL；M為當歸藥材顆粒質量，g。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)響應面試驗設計原理和單因素試驗結果以及生產(chǎn)實際需要，選取當歸粒徑(A)、加水倍數(shù)(B)、提取時間(C)等3個影響因素，以揮發(fā)油提取率作為響應值，各取3個水平，進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平與編碼

1.4 當歸揮發(fā)油抗氧化性的測定

參考羅秋水等的測定方法[18]，并作出略微修改。

1.4.1 DPPH自由基溶液的配制

精確稱取6 mg DPPH標準品，置于100 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，配成0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液，冷藏待用[19]。

1.4.2 當歸揮發(fā)油樣品溶液的配制

取適量的揮發(fā)油置于100 mL的容量瓶中，用無水乙醇將樣品配制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的樣品溶液。分別取2 mL以上樣品溶液，置于離心管中，分別加入2 mL 0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液，混勻后避光靜置30 min，再用分光光度計分別測定混合溶液在517 nm處的吸光度，記為a1，用無水乙醇代替DPPH標準品溶液，517 nm處測定吸光度，記為a2，用無水乙醇代替樣品溶液，相同條件下測定吸光度，記為a0，見式(2)。陽性對照采用與樣品質量濃度相同的抗壞血酸(維生素C)對照品溶液。

DPPH自由基清除率=[1-(a1-a2)/a0]×100%。

(2)

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert 10.0以及Excel 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，每個樣品3次重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，當歸粒徑24 目、加水倍數(shù)6倍、提取時間7 h時揮發(fā)油提取率均最高。當歸粒徑大于24目時，當歸顆粒與水的接觸面積較小，顆粒內部揮發(fā)油難以蒸出；而粒徑小于24 目時，粒徑較小，接觸面積過大，藥材顆粒與水充分接觸后內部含有的多糖、內酯類等小分子物質經(jīng)水煎煮后極易被提取出來，導致水中的黏性物質增多，造成當歸藥材顆粒發(fā)生黏結、成團現(xiàn)象，不利于揮發(fā)油的蒸出，同時燒瓶底部還會有少量顆粒粘在瓶壁，出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，這也可能是揮發(fā)油量損失的原因之一。加水過多會使揮發(fā)油在水中部分溶解，而加水過少無法充分浸潤當歸藥材；提取時間縮短，顆粒內部的有效成分不能完全溶出，而時間過長提取率變化不大且會提高生產(chǎn)成本，耗時、費力。綜上所述，各個因素的改變均會造成揮發(fā)油提取率的下降。因此，為了綜合考量揮發(fā)油提取工藝參數(shù)，本試驗結合單因素結果進行后續(xù)響應面分析。

圖1 當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effects of the particle size of angelica granules, water addition factor,and extraction time on the extraction rate of volatile oil

2.2 響應面試驗設計與結果

根據(jù)單因素試驗結果，并考慮實際生產(chǎn)需要的條件。以當歸粒徑(A)、加水倍數(shù)(B)、提取時間(C)為自變量，以揮發(fā)油提取率為響應值設計試驗，試驗方案及結果見表2。采用Design Expert 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應面回歸分析，得出當歸揮發(fā)油提取率與各因變量的模擬方程為：

Y=0.55-0.006 625A+0.007 875B+0.015C-0.001 500AB-0.002 250AC+0.002 250BC-0.029A2-0.020B2-0.013C2。

表2 響應面試驗方案及結果

表2(續(xù))

2.3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

根據(jù)表3可知，回歸模型P值<0.001，處在極顯著水平，表明該模型顯著回歸，方程可以確切表明揮發(fā)油提取率與各因素之間的關系。表中多元相關系數(shù)R2=0.989 2，表明該回歸方程具有極高的可信度；失擬項P=0.061 9>0.05，表示極不顯著，證明了該回歸模型與試驗擬合度極高。表中A2、B2、C2各項的P值都小于0.05，均對響應值結果影響顯著。根據(jù)F值可以看出影響揮發(fā)油提取率的因素由大到小順序為提取時間、加水倍數(shù)、當歸粒徑。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

2.4 響應面及等高線分析

等高線圖和響應面圖可以直觀地反應出各因素交互作用對揮發(fā)油提取率的影響，等高線中的圓形表示兩因素交互作用不太明顯，而橢圓形則表示兩因素的交互作用比較明顯[20-21]。如圖2所示，提取時間與粒徑兩者的等高線圖呈橢圓形，交互作用較為顯著，而當歸粒徑與加水倍數(shù)、提取時間與加水倍數(shù)的等高線圖均呈現(xiàn)出圓形，表明兩者交互作用不顯著。

圖2 因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of factor interaction

2.5 當歸揮發(fā)油工藝驗證

響應面法得出該模型最優(yōu)解：當歸粒徑20.248目、加水倍數(shù)6.246 倍、提取時間7.757 h。根據(jù)藥典規(guī)定并結合實際生產(chǎn)條件，將工藝條件修正為：當歸粒徑24目、加水倍數(shù)6 倍、提取時間7 h，在此條件下提取3批當歸揮發(fā)油，見表4。結果表明了上述工藝參數(shù)條件準確可靠，具有實際生產(chǎn)價值。

表4 工藝驗證實驗結果

2.6 當歸揮發(fā)油抗氧化性試驗結果

由圖3可知，當歸揮發(fā)油從0.2 mg/mL增加到1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率從12.7%增加到51.9%，即揮發(fā)油抗氧化性對樣品質量濃度有一定依賴性。圖中可以發(fā)現(xiàn)，使用相同質量濃度的維生素C代替樣品質量濃度時，DPPH自由基清除率高于當歸揮發(fā)油，維生素C對DPPH自由基的清除率一直處于較高水平。結果表明了當歸揮發(fā)油抗氧化能力比對照品維生素C差，當歸揮發(fā)油的IC50為0.953 mg/mL。

圖3 當歸揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of A. sinensis volatile oil

3 結果與討論

為了有效提高當歸藥材的使用價值，本試驗以當歸藥材為研究對象，利用響應面法對當歸揮發(fā)油提取工藝進行優(yōu)化。優(yōu)選出的工藝參數(shù)如下：當歸粉碎粒徑24目，加水倍數(shù)6倍，提取時間7 h，在此條件下?lián)]發(fā)油提取率可達到0.538%。然后，對該當歸揮發(fā)油進行DPPH自由基的清除率研究，結果表明當歸揮發(fā)油具有一定的抗氧化性，樣品質量濃度在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范圍內時，DPPH自由基清除率與當歸揮發(fā)油的質量濃度呈顯著的正比量效關系，當歸揮發(fā)油質量濃度為1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率最高。此研究為當歸藥材的提取工藝摸索出最優(yōu)條件，結果參數(shù)穩(wěn)定、可行。本試驗使用響應面法優(yōu)化了當歸揮發(fā)油的提取工藝并測定了其抗氧化活性，旨在為揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用提供理論指導，為當歸臨床應用范圍的擴展提供新的思路。