微波水解-氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定酪蛋白胨中的17種氨基酸

王國英,王瑞生,朱樹國,王 勤,莫日根,周 剛*,朱葉青*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.呼和浩特市檢驗(yàn)檢測(cè)中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

酪蛋白胨是以酪蛋白(從牛奶中提取,又稱干酪素、酪朊、乳酪素)作為原材料,經(jīng)胰蛋白酶消化水解、中和、過濾、濃縮精制而成的粉末。酪蛋白胨與一般蛋白胨相比水解程度更高、胨分子量分布更加均衡,國際上普遍將酪蛋白胨用作培養(yǎng)基的氮源[1]。然而國內(nèi)外普遍存在培養(yǎng)基質(zhì)量差異和批間質(zhì)量不穩(wěn)定的問題[2-4],酪蛋白胨作為培養(yǎng)基的主要原材料,其質(zhì)量已經(jīng)成為培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)提升產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸[5]。在我國培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)較為落后[6],對(duì)培養(yǎng)基原料的系統(tǒng)研究較少[7],對(duì)酪蛋白胨的檢測(cè)指標(biāo)主要有pH值、澄明度、含水量、熾灼殘?jiān)?、含氮量等[8]。為了提升我國培養(yǎng)基的總體質(zhì)量,縮小與國際知名品牌培養(yǎng)基的差距,我們通過對(duì)酪蛋白胨中氨基酸進(jìn)行定量,來有效的控制培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量。

目前,氨基酸的測(cè)定方法很多,有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、離子色譜法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]、同位素質(zhì)譜法[14]等。氨基酸自動(dòng)分析儀法是最常用的一種分析方法[15-17],它是以陽離子交換樹脂為固定相,酸性緩沖液為流動(dòng)相,在柱后采用茚三酮溶液與氨基酸衍生生成具有可見光吸收的衍生物進(jìn)行檢測(cè),具有重復(fù)性好、儀器穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[18]。本文通過對(duì)酪蛋白胨的水解條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了氨基酸分析儀測(cè)定酪蛋白胨中17種氨基酸的方法,該方法準(zhǔn)確、靈敏,填補(bǔ)了我國培養(yǎng)基原材料酪蛋白胨中氨基酸數(shù)據(jù)的空白,為研制純化學(xué)培養(yǎng)基以及提升我國培養(yǎng)基質(zhì)控水平提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氨基酸分析儀:S-433D型,德國sykam公司;微波消解儀:ETHOS UP型,德國Milestone公司;萬分之一電子天平:ME204E型,瑞士Mettler Toledo公司;氮吹儀:N-EVAP-45型,美國Organomation公司;超純水機(jī):Milli-Q型,美國Milliproe公司。

17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品,和光純藥工業(yè)株式會(huì)社,日本;甲醇,色譜純,德國CNW公司;乙醇,色譜純,美國MREDA公司;檸檬酸三鈉(二水),優(yōu)級(jí)純,北京化工廠;鹽酸,優(yōu)級(jí)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辛酸,優(yōu)級(jí)純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉,分析純,科茂化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸,分析純,天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;硼酸,分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;苯酚,分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;EDTA,分析純,天津光復(fù)試劑有限公司;茚三酮,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5批酪蛋白胨:錫林浩特市鼎安生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

緩沖A1:檸檬酸三鈉(二水)11.8 g,檸檬酸6.0 g,乙醇70mL,HCl(濃)5.6 mL,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.45,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過濾。

緩沖B1:檸檬酸三鈉(二水)19.6 g,硼酸5.0 g,氫氧化鈉 3.1 g,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至10.85,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過濾。

再生液C1:氫氧化鈉 20.0 g,EDTA 0.2 g,純水定容至1000 mL,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過濾。

衍生試劑D1:20 g 茚三酮晶體,2 g苯酚,600 mL甲醇;緩慢攪拌到所有的茚三酮晶體完全溶解,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過濾,加入400 mL過濾后鉀鈉緩沖液(PH5.51),轉(zhuǎn)移到茚三酮試劑瓶中,氮?dú)鈴牡撞看荡蠹s3至5分鐘,加入VC后氮?dú)庠購牡撞看荡蠹s3至5分鐘。

樣品稀釋液:檸檬酸三鈉(二水)11.8 g,檸檬酸6.0 g,HCI(濃)10.4 mL,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2.20,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過濾。

精確吸取17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液,用超純水稀釋成37.5 μmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)需要再用超純水配成適當(dāng)濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

精密稱取混合混勻的樣品0.2 g(精確至0.0001 g)于消解管中,加入6 mol/L的鹽酸5 mL,密閉。水解功率1000 W,溫度150 ℃,消解40 min,冷卻后,轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻,移取 1.00 mL氮?dú)獯蹈?用5.00 mL稀釋液復(fù)溶,并用稀釋液定容至50 mL 容量瓶中,搖勻、過膜,注入氨基酸分析儀測(cè)定。

1.2.3 儀器工作參數(shù)

色譜柱:LCA K06/Na(4.6 mm×150 mm);衍生泵流速:0.25mL/min;柱溫:58 ℃; 高溫反應(yīng)器溫度:130℃;檢測(cè)波長:440nm(脯氨酸)、570 nm;進(jìn)樣量20 μL,洗脫方式:梯度洗脫,見表1。

圖1 17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

表1 氨基酸分析儀泵參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 微波水解條件的優(yōu)化

微波水解溫度的優(yōu)化:在微波功率1000 W、水解時(shí)間40 min固定不變的情況下,分別考察水解溫度130 ℃、140 ℃、150 ℃、160 ℃、170 ℃、180 ℃對(duì)酪蛋白胨中各種氨基酸含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著測(cè)試溫度從130 ℃升高到180 ℃,氨基酸的總檢出量出現(xiàn)了先升高后下降的趨勢(shì),在150 ℃的時(shí)候,酪蛋白胨中總氨基酸的含量達(dá)到最大值,為845.37 g/kg,隨著溫度的繼續(xù)升高,胱氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸均有不同程度的下降,其他氨基酸逐漸趨于平穩(wěn),因此,我們最終選擇150℃作為水解溫度。

微波水解時(shí)間的優(yōu)化:在微波功率1000 W、水解溫度150 ℃條件下,水解時(shí)間在10～40 min時(shí),酪蛋白胨中氨基酸的總含量迅速升高,40 min時(shí)總氨基酸的含量高于其他各時(shí)間點(diǎn),40～50 min時(shí)趨于穩(wěn)定,沒有明顯增高,所以我們選擇40 min為最佳水解時(shí)間。

2.2 線性范圍、檢出限、定量限和精密度

按照優(yōu)化的方法進(jìn)行測(cè)定,采用外標(biāo)法定量,以氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/mL)、相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸分析,得到17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表2。結(jié)果表明各目標(biāo)物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998。分別以信噪比(S/N)的3倍和10倍進(jìn)樣濃度確定該法的最低檢出限和定量限分別為:0.02～1.22 g/kg、0.07～4.05 g/kg。

表2 17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

同一混合均勻的酪蛋白胨樣品取6份,按照優(yōu)化好的方法進(jìn)行測(cè)定,氨基酸均有檢出,計(jì)算17種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,RSD的范圍為均≤4.5%,表明該方法的精密度良好。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

精密稱取上述蛋白胨樣品6份,分別添加定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述優(yōu)化的條件下進(jìn)行水解,測(cè)定氨基酸的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3,17種氨基酸的平均回收率為80.6%～106.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)≤4.9%。

表3 17種氨基酸的加標(biāo)回收率(n=6)

2.4 樣品的測(cè)定

按照上述建立的17種氨基酸含量的測(cè)定方法對(duì)5個(gè)批次酪蛋白胨進(jìn)行測(cè)定,氨基酸測(cè)定結(jié)果見表4,由測(cè)定結(jié)果可知酪蛋白胨中17種氨基酸均有檢出,其中含量最高的為谷氨酸,在172.36～182.93 g/kg之間,胱氨酸含量最低在1.17～2.86 g/kg之間,其他氨基酸含量在13.56～92.64 g/kg之間。氨基酸的含量約占到酪蛋白胨的77%以上。

表4 酪蛋白胨中17種氨基酸的含量(g/kg)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白胨為研究對(duì)象,通過對(duì)樣品水解條件的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了經(jīng)過微波水解后使用氨基酸分析儀測(cè)定樣品中17種氨基酸含量的方法,該方法前處理所用時(shí)間短、所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,適用于酪蛋白胨中氨基酸含量的測(cè)定,對(duì)于進(jìn)一步研究本品的蛋白質(zhì)和多肽組成具有重要的意義,為提升我國培養(yǎng)基評(píng)價(jià)規(guī)范提供了基礎(chǔ)的保障。