循環(huán)游離DNA在輔助生殖技術(shù)中的研究進(jìn)展*

劉小童，周星宇，張笑菲，陳士嶺

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510515)

人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)目前已成為治療不孕癥的主要方法，而獲得良好的助孕結(jié)局則有賴(lài)于精卵配子、胚胎質(zhì)量的檢測(cè)篩選以及胚胎遺傳學(xué)的早期診斷。傳統(tǒng)配子、胚胎質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜，胚胎植入前診斷活檢對(duì)胚胎發(fā)育造成損害亦難以避免。因此尋求新的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)尤為重要。循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)是一種存在于人體血液、尿液、卵泡液等各類(lèi)體液中的細(xì)胞外內(nèi)源性DNA，大多通過(guò)人體組織細(xì)胞的凋亡、壞死等釋放入體液中，病理狀態(tài)下其在體液中含量遠(yuǎn)高于健康人體。cfDNA作為新興的液體活檢標(biāo)志物，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫等疾病的臨床診斷與治療。近年研究則提示，cfDNA在反映卵巢功能、評(píng)估精液質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用，并可作為預(yù)測(cè)體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的早期胚胎質(zhì)量與助孕治療結(jié)局，以及進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的有效標(biāo)志物。本文就cfDNA在輔助生殖技術(shù)中的研究進(jìn)展作一綜述，以期為優(yōu)化輔助生殖技術(shù)、探索兩性不孕癥的早期診斷標(biāo)志物提供新的思路。

1 循環(huán)游離DNA

cfDNA主要類(lèi)型有細(xì)胞核源性DNA(nuclear cfDNA，n-cfDNA)與線粒體來(lái)源DNA(mitochondrial cfDNA,mt-cfDNA)[1]。細(xì)胞因疾病死亡后，其經(jīng)巨噬細(xì)胞吞噬并向體液中釋放攜帶有疾病相關(guān)遺傳突變信息的cfDNA，并主要以DNA結(jié)合蛋白質(zhì)或高度片段化的游離DNA形態(tài)存在。1948年，Mandel和Métais首次報(bào)道外周血中存在cfDNA[2]。此后研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血漿中Y染色體特異序列的陽(yáng)性擴(kuò)增，證實(shí)了母體血漿中存在胎兒來(lái)源的無(wú)細(xì)胞胎兒DNA(cell-free fetal DNA,cf-fDNA)，這使采集母血中的胎兒遺傳物質(zhì)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷成為可能[3]。目前，cfDNA已被證實(shí)在多種腫瘤、免疫等疾病的診斷和臨床分級(jí)中發(fā)揮重要作用，近年研究則提出其在輔助生殖技術(shù)改良與不孕癥診斷方面亦具有重要意義。

2 cfDNA與生殖細(xì)胞

2.1 cfDNA與卵巢生殖細(xì)胞功能 在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞的凋亡及線粒體功能異常將影響卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致卵泡閉鎖，致使卵巢儲(chǔ)備功能減退。在卵巢功能減退患者與高齡患者中，壁層顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增高，且凋亡率與卵巢反應(yīng)性、卵母細(xì)胞數(shù)量、MⅡ卵數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D3優(yōu)胚數(shù)、囊胚形成率和凍胚數(shù)均呈負(fù)相關(guān)[4]。作為細(xì)胞凋亡的重要指示物，卵泡液cfDNA濃度與顆粒細(xì)胞凋亡水平呈顯著正相關(guān)，而高濃度cfDNA亦可促進(jìn)顆粒細(xì)胞內(nèi)ROS升高，并經(jīng)由Fas/FasL通路激活caspase-3等炎癥因子，促進(jìn)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。此外，卵泡液cfDNA濃度亦被證實(shí)與卵母細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)量及發(fā)育能力呈負(fù)相關(guān)[6]。臨床研究指出，卵巢儲(chǔ)備功能低下患者卵泡液cfDNA濃度顯著升高，而接受長(zhǎng)周期大劑量促性激素刺激方案的患者，其cfDNA則顯著高于短刺激低劑量患者[7]。此外，在黃體期取卵獲取的卵泡液短cfDNA片段濃度顯著高于卵泡期，且其完整性與血清及卵泡液雌二醇水平亦呈顯著負(fù)相關(guān)[8]。這提示cfDNA或可作為調(diào)整輔助生殖用藥及方案的觀測(cè)指標(biāo)，以避免獲取產(chǎn)量高但低能的未成熟卵。同時(shí)，由于卵泡液mt-cfDNA濃度變化較總cfDNA更少受促性腺激素用藥類(lèi)型及劑量的干擾，其濃度在輔助生殖過(guò)程中的穩(wěn)定性，展示了其作為相對(duì)可靠的卵母細(xì)胞功能及發(fā)育標(biāo)志物的潛力[6]。此外，近期研究還發(fā)現(xiàn)，血漿mt-cfDNA亦可用于卵巢功能預(yù)測(cè)，其拷貝數(shù)小于105或可作為不育癥的臨界點(diǎn)[8]。然而，研究亦顯示卵泡液cfDNA的濃度及完整性與卵巢反應(yīng)性無(wú)顯著相關(guān)[9]。

多項(xiàng)基于豬卵巢的研究顯示，體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體(oocyte-granulosa cell complexes，OGC)的培養(yǎng)液mt-cfDNA、n-cfDNA含量與OGC顆粒細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)，而與卵母細(xì)胞體外MⅡ級(jí)成熟率呈負(fù)相關(guān)[10]。抑制蛋白酶體后，豬卵巢顆粒細(xì)胞線粒體變性將導(dǎo)致培養(yǎng)液mt-cfDNA釋放減少，抑制自噬則導(dǎo)致mt-cfDNA在細(xì)胞中過(guò)量積累，使其釋放到細(xì)胞外的濃度增加，抑制氧化磷酸化亦通過(guò)破壞卵丘細(xì)胞線粒體功能，導(dǎo)致mt-cfDNA釋放增加[11]。由上可知，顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)液mt-cfDNA的濃度可指示卵巢顆粒細(xì)胞自噬與線粒體功能，這亦為卵巢功能的早期評(píng)估提供了依據(jù)。綜上所述，cfDNA(特別是mt-DNA)可反映卵巢顆粒細(xì)胞功能、凋亡、自噬水平與線粒體功能，亦可作為卵母細(xì)胞質(zhì)量及發(fā)育能力的標(biāo)志物，但其與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

2.2 cfDNA與精子質(zhì)量 cfDNA作為精液的重要成分，其在評(píng)估精子質(zhì)量中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，畸精癥與無(wú)精癥患者精液的平均cfDNA濃度均顯著高于正常精液。低濃度、低活力、形態(tài)差的精液亦常伴有cfDNA水平升高[12]。而精液中的mt-cfDNA水平在少、弱精患者中明顯降低，與精子存活率、活力和形態(tài)亦呈顯著負(fù)相關(guān)，而與精子氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)。精液mt-cfDNA亦會(huì)誘發(fā)精液中氧化應(yīng)激水平的提高，這提示著精液mt-cfDNA濃度或因生精障礙而降低，其濃度升高則可能進(jìn)一步加重?fù)p傷[13]。此外，Javier等[14]研究發(fā)現(xiàn)，男性脊髓損傷患者的精漿cfDNA片段化顯著增高，且長(zhǎng)度為150bp的cfDNA片段可抵抗精液中DNA酶活性而難以被分解。而對(duì)于不穩(wěn)定的低分子cfDNA片段(12kb、1kb)，其濃度與精子的曲線速度、形態(tài)質(zhì)量和獲能指數(shù)呈正相關(guān)，且在精液冷凍過(guò)程占比下降。對(duì)于精液cfDNA進(jìn)行的甲基化分析結(jié)果則證實(shí)，精液cfDNA可反映睪丸組織的表觀遺傳信息，且CCNA1和DMRT1基因甲基化水平與非梗阻無(wú)精子癥患者取精率顯著相關(guān)[15]。上述結(jié)論表明精液cfDNA濃度與其片段長(zhǎng)度可反映精子狀態(tài)和精液質(zhì)量，而其甲基化特征亦可反映睪丸功能并可作為取精率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

此外，Aitken等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將人類(lèi)精子暴露于外源游離DNA可使精子DNA片段化增加，且精子損傷呈劑量依賴(lài)性，其機(jī)制可能與外源cfDNA在人類(lèi)精子中激活與核酸酶介導(dǎo)的DNA片段化相關(guān)的防御反應(yīng)有關(guān)，而上述變化可被DNA酶逆轉(zhuǎn)。這提示外源性cfDNA暴露可誘導(dǎo)精子DNA損傷，而DNA酶或可作為一種逆轉(zhuǎn)精子DNA損傷的治療手段，但人體精液的內(nèi)源cfDNA增多是否導(dǎo)致精子損傷以及DNA酶治療在臨床應(yīng)用的可行性仍待進(jìn)一步研究。

3 cfDNA與植入前胚胎

3.1 cfDNA與胚胎質(zhì)量評(píng)估 對(duì)應(yīng)用IVF-ET助孕治療不孕癥的患者胚胎質(zhì)量進(jìn)行早期評(píng)估，將有利于獲得更優(yōu)的妊娠結(jié)局。胚胎的碎片化多與細(xì)胞凋亡、壞死有關(guān)，而由上述過(guò)程驅(qū)動(dòng)釋放的cfDNA或可作為更好的胚胎質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)。研究顯示，接受IVF與卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)患者中卵泡液cfDNA濃度較高組，其受精卵卵裂率與優(yōu)胚數(shù)較低，胚胎碎片率則較高[6,17]。這表明卵泡液cfDNA可對(duì)體外培養(yǎng)早期胚胎進(jìn)行優(yōu)胚率評(píng)估。另有研究顯示卵泡液mt-cfDNA含量與第3d胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)，且在囊胚形成組中顯著升高[18]。而體外培養(yǎng)第3d胚胎培養(yǎng)液中，mt-cfDNA與n-cfDNA的比值則被證實(shí)與囊胚胚胎滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，TE)分級(jí)、胚胎發(fā)育能力及胚胎植入成功率呈正相關(guān)，且與不同的卵巢刺激方案和胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)關(guān)。其評(píng)估敏感性與特異性分別為95%和65%[19]。囊胚培養(yǎng)第5d的胚胎培養(yǎng)液cfDNA濃度亦與囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)聯(lián)合TE的加權(quán)囊胚形態(tài)評(píng)分以及培養(yǎng)液caspase-3水平呈顯著正相關(guān)[20]。由此可見(jiàn)，cfDNA高濃度常提示低優(yōu)胚率與高胚胎碎片率，而較高的mt-cfDNA/n-cfDNA則提示更高的囊胚形成率、滋養(yǎng)胚層質(zhì)量以及胚胎植入成功率。綜合上述，cfDNA或可成為鑒定具有高發(fā)育潛力的可存活胚胎以及胚胎著床潛力的有力指標(biāo)。

3.2 cfDNA與胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè) 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic screening,PGS)對(duì)提高臨床妊娠率、降低異常妊娠風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。而常用的胚胎活檢難以完全避免對(duì)配子、胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。Chen等[21]通過(guò)對(duì)廢胚胎培養(yǎng)液(Spent Embryo Culture media，SECM)中的cfDNA進(jìn)行全基因組DNA甲基化測(cè)序，證實(shí)了SECM-cfDNA主要來(lái)源于囊胚、卵丘細(xì)胞和極體，這為利用胚胎培養(yǎng)液cfDNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性植入前遺傳學(xué)檢測(cè)提供了理論依據(jù)。目前用于檢測(cè)的cfDNA主要來(lái)自SECM和囊胚腔液(Blastocoelefluid,BF)。研究表明,對(duì)SECM-cfDNA進(jìn)行下一代測(cè)序(“Next-generation” sequencing technology，NGS)的分析結(jié)果對(duì)染色體異常的陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值分別為78.9%和91.3%，且對(duì)染色體異常敏感度和特異度均較高，分別為88.2%和84.0%，這提示SECM-cfDNA可評(píng)估植入前胚胎染色體異常[22]。而對(duì)比傳統(tǒng)的TE活檢，SECM-cfDNA的NGS分析符合率超過(guò)86%，敏感度與特異度則分別為76.5%～91.3%、64.7%～93.3%[23]，且在與TE的倍性符合率及擴(kuò)增成功率上均優(yōu)于BF-cfDNA[24]。

然而，胚胎培養(yǎng)液中存在的極體與卵丘細(xì)胞來(lái)源的母體DNA污染將對(duì)cfDNA的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，嵌合體的存在比例也將降低cfDNA檢測(cè)的可靠性。為了避免上述影響，Huang等[25]在去除卵冠丘細(xì)胞并設(shè)定嵌合體閾值后進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性PGT-A(Noninvasive preimplantation genetic testinguang for aneuploidy,niPGT-a)，結(jié)果顯示其假陰性率為零，且陽(yáng)性率預(yù)測(cè)值與特異度均顯著高于TE活檢的PGT-A。而針對(duì)cfDNA含量及擴(kuò)增效率低的問(wèn)題，Rubio等[26]研究提出收集胚胎培養(yǎng)第6～7d的cfDNA可獲得更高的濃度，且不會(huì)降低符合率，并具有較低的卵丘細(xì)胞污染[21]。此外，通過(guò)減小培養(yǎng)體積、全基因組擴(kuò)增、輔助孵化等手段亦可有效提高cfDNA擴(kuò)增率。上述研究表明cfDNA可作為植入前非侵入式的胚胎整倍體檢測(cè)手段，而通過(guò)延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)時(shí)間至6～7d，調(diào)整嵌合體閾值以及去除卵丘細(xì)胞等方法可獲得更高的準(zhǔn)確率。但目前的檢測(cè)方案尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，仍需擴(kuò)大樣本后進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 cfDNA與助孕結(jié)局 研究發(fā)現(xiàn)，接受IVF助孕的女性血漿及卵泡液cfDNA水平與妊娠率呈負(fù)相關(guān)。卵泡液cfDNA預(yù)測(cè)臨床妊娠的準(zhǔn)確率、特異度則分別可達(dá)73%和88%[7]。近期臨床研究提出，根據(jù)SECM-cfDNA的遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果選擇整倍體胚胎移植，可有效降低IVF助孕的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的流產(chǎn)率，并提高反復(fù)著床失敗患者的臨床妊娠率[27]。行ICSI助孕患者通過(guò)SECM-cfDNA遺傳學(xué)篩選后移植，其生化及臨床妊娠率亦分別提高至72.0%和58.0%[28]。以上研究提示cfDNA在助孕結(jié)局的改善和預(yù)測(cè)方面具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎移植1周后獲得的孕婦血清cfDNA在不同助孕結(jié)局的患者中無(wú)顯著差異。這提示可準(zhǔn)確、有效預(yù)測(cè)助孕結(jié)局的cfDNA提取時(shí)機(jī)仍得進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)及展望

輔助生殖技術(shù)作為目前治療不孕癥的重要有效手段，其成功與否有賴(lài)于對(duì)配子、胚胎質(zhì)量的評(píng)估，以及治療方案的不斷優(yōu)化。cfDNA是一種廣泛存在于人體各類(lèi)體液中的游離核酸，主要通過(guò)細(xì)胞凋亡、壞死后裂解釋放入體液，其含量與遺傳學(xué)特征通常能反映機(jī)體器官組織狀態(tài)與疾病狀況。卵泡液cfDNA可反映卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡、自噬、線粒體功能以及卵母細(xì)胞的發(fā)育水平，并具有成為卵巢刺激周期用藥調(diào)整與檢測(cè)指標(biāo)，以及早期診斷卵巢功能不全的潛能，但與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系尚待進(jìn)一步探索。同時(shí)，精液cfDNA亦可用于評(píng)估精子質(zhì)量，其遺傳學(xué)特征可反映睪丸等器官功能。而DNA酶逆轉(zhuǎn)外源cfDNA對(duì)精子損傷的作用值得進(jìn)一步研究。卵泡液、胚胎培養(yǎng)液中的cfDNA亦可評(píng)估早期胚胎與囊胚質(zhì)量，用于植入前非侵入性胚胎整倍體檢測(cè)，并獲得了較高的TE符合率。針對(duì)SECM-cfDNA檢測(cè)中存在的嵌合體干擾、母體DNA污染及擴(kuò)增率低等問(wèn)題，已有設(shè)置嵌合體閾值、去除卵丘細(xì)胞及延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)時(shí)間等多種方案應(yīng)對(duì)，然而目前尚未提出一套標(biāo)準(zhǔn)操作流程，研究樣本量也需進(jìn)一步擴(kuò)大，以減小誤差。此外，血漿、卵泡液cfDNA亦在助孕結(jié)局的改善與預(yù)測(cè)中發(fā)揮一定的作用，但其提取的時(shí)機(jī)及應(yīng)用仍待進(jìn)一步探索。cfDNA早期檢測(cè)所引發(fā)的胚胎選擇、妊娠決定等臨床決策和倫理問(wèn)題，亦值得進(jìn)一步討論與思考。