微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀與未來(lái)展望

崔金玉，張愛(ài)娣，欒國(guó)棟，呂雪峰

（1中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2山東能源研究院，山東 青島 266101；3青島新能源山東省實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；4中南林業(yè)科技大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

氣候變化是當(dāng)今人類(lèi)面臨的重大挑戰(zhàn)，應(yīng)對(duì)氣候變化已經(jīng)成為全球共識(shí)。而氣候變化的潛在重要原因之一是碳的過(guò)量排放，其會(huì)導(dǎo)致地球氣候變暖、溫室效應(yīng)以及出現(xiàn)極端惡劣天氣。中國(guó)作為世界人口最多的國(guó)家，也是世界最大的碳排放國(guó)。長(zhǎng)期以來(lái)，中國(guó)積極參與全球治理，將溫室氣體減排任務(wù)納入國(guó)家五年規(guī)劃和2035遠(yuǎn)景目標(biāo)，力爭(zhēng)CO2的排放量于2030年前達(dá)到峰值，努力爭(zhēng)取在2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和［1］。碳達(dá)峰、碳中和既是我國(guó)應(yīng)對(duì)全球變化的莊嚴(yán)承諾，也是我國(guó)實(shí)現(xiàn)社會(huì)綠色、可持續(xù)發(fā)展的必由之路。發(fā)展CO2的高效資源化利用技術(shù)可同時(shí)緩解迫切的環(huán)境和能源壓力，是實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的重要途徑。微藻是一類(lèi)具有單細(xì)胞或簡(jiǎn)單多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的原核或真核生物，原核微藻主要指藍(lán)藻（藍(lán)藻科），真核微藻主要包括綠藻（綠藻科）和硅藻（硅藻科）［2］。微藻作為重要的光合固碳微生物，是生物圈初級(jí)生產(chǎn)力的主要來(lái)源，貢獻(xiàn)了全球范圍內(nèi)50%以上的生物固碳，同時(shí)還參與全球氮、氧、磷等多種物質(zhì)循環(huán)。微藻是研究光合作用機(jī)制的重要模式體系，也是極具潛力的新型微生物光合平臺(tái)。利用微藻光合固碳過(guò)程，將太陽(yáng)能和CO2直接轉(zhuǎn)化為重要生物基產(chǎn)品的模式被稱(chēng)為光驅(qū)固碳合成技術(shù)。微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）微藻擁有高效的光合系統(tǒng)，光合速率高，例如藍(lán)藻光能利用率是陸生植物的數(shù)倍（藍(lán)藻3%～9%，陸生植物0.25%～3%）［3-4］。（2）微藻的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求低，不需要有機(jī)碳源，且其可以利用廢棄的水、氣和邊際土地資源，可以有效降低生產(chǎn)成本并提高過(guò)程綜合收益［5］；同時(shí)，微藻以大氣中的溫室氣體CO2作為碳源，具有顯著的生態(tài)效益；據(jù)估計(jì)，生產(chǎn)1 kg藻類(lèi)生物量需要1.83 kg CO2

［6］，也即意味著微藻培養(yǎng)可以起到固碳減排和綠色合成的效果。（3）微藻生長(zhǎng)比植物快，培養(yǎng)周期短，生長(zhǎng)密度高；同時(shí)，其自身含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和多糖等高附加產(chǎn)值化合物，可作為生產(chǎn)各種生物制品的直接原料［7］。（4）微藻廣泛分布于全球各種生態(tài)環(huán)境中，具有極為豐富的種質(zhì)、遺傳、代謝和生理多樣性，為多樣化的光驅(qū)固碳合成技術(shù)路線開(kāi)發(fā)提供了寶貴的資源基礎(chǔ)；例如，微藻中含有多不飽和脂肪酸、色素、碳水化合物、肽、維生素、多酚、植物甾醇和激素等多種生物活性物質(zhì)，在食品、營(yíng)養(yǎng)品、藥物和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間［8］。綜上所述，微藻生物技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用有望成為“碳達(dá)峰、碳中和”戰(zhàn)略目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的有力手段，為全球的綠色低碳進(jìn)程提供部分可行性解決方案。

微藻的天然光合代謝本質(zhì)上是為了維持生存、促進(jìn)生長(zhǎng)和實(shí)現(xiàn)增值，而光驅(qū)固碳合成技術(shù)的核心目標(biāo)是為了實(shí)現(xiàn)CO2的定向利用，讓更多的碳流流向高附加產(chǎn)值化合物的合成。近20年來(lái)，以合成生物學(xué)為代表的交叉學(xué)科的發(fā)展，使得人工設(shè)計(jì)、合成新型微藻光合細(xì)胞工廠成為現(xiàn)實(shí)，有效促進(jìn)了光合代謝的深度重塑與光合碳流的精確調(diào)控，使CO2在太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)下向各種天然和非天然目標(biāo)產(chǎn)物的定制化轉(zhuǎn)化。針對(duì)特定培養(yǎng)體系和應(yīng)用需求進(jìn)行微藻復(fù)雜細(xì)胞表型的人工設(shè)計(jì)和改造也成為可能。另外，通過(guò)對(duì)光合微藻代謝特性（如固碳放氧）的理解和改造，合成生物學(xué)技術(shù)還極大拓展了微藻的應(yīng)用空間和潛力，使其可以通過(guò)與其他學(xué)科和技術(shù)的融合而執(zhí)行新型的任務(wù)；而新型應(yīng)用場(chǎng)景開(kāi)發(fā)過(guò)程中也存在一定挑戰(zhàn)，微藻的遺傳、生理和代謝特性還需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過(guò)程中特定的體系、條件和環(huán)境進(jìn)行適配性的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。本文將結(jié)合典型案例的介紹，重點(diǎn)對(duì)合成生物技術(shù)、系統(tǒng)生物技術(shù)和人工智能等新科技浪潮的驅(qū)動(dòng)下，微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)在基本開(kāi)發(fā)模式、新穎應(yīng)用場(chǎng)景以及發(fā)展動(dòng)向方面的新變化和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行總結(jié)和展望。

1 微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的基本開(kāi)發(fā)模式

光驅(qū)固碳合成技術(shù)從本質(zhì)上分析是人工對(duì)微藻細(xì)胞光合作用固定CO2過(guò)程的應(yīng)用和改造，在具體過(guò)程上則是通過(guò)設(shè)備、技術(shù)、環(huán)境條件對(duì)光驅(qū)碳流轉(zhuǎn)化路線的引導(dǎo)、強(qiáng)化和重定向。本文從微藻光合代謝活動(dòng)的利用和改造模式上，將光驅(qū)固碳合成技術(shù)的基本開(kāi)發(fā)模式總結(jié)為“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”3種模式（圖1），下面將對(duì)其技術(shù)流程和特點(diǎn)進(jìn)行梳理并介紹相關(guān)研究進(jìn)展、重要突破和代表性應(yīng)用示范。

圖1 微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的開(kāi)發(fā)模式Fig.1 The development models of microalgae photosynthetic biomanufacturing

1.1 “拆盲盒”——挖掘天然微藻種質(zhì)資源

微藻廣泛分布于陸地、海洋、淡水、極地等各種生態(tài)環(huán)境中，需要適應(yīng)鹽、pH、溫度、光照等各種極端環(huán)境條件及其動(dòng)態(tài)變化，與之相對(duì)應(yīng)的則是微藻類(lèi)群極高的生理和代謝多樣性，以及類(lèi)型廣泛的代謝產(chǎn)物（主要包括油脂、多糖、不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、色素類(lèi)以及各種小分子代謝物等）。通過(guò)對(duì)微藻種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛采集和篩選，對(duì)其胞內(nèi)代謝物進(jìn)行分析和鑒定，挖掘高附加產(chǎn)值化合物的微藻光驅(qū)固碳合成路線開(kāi)發(fā)模式，被稱(chēng)為“拆盲盒”，具有技術(shù)門(mén)檻相對(duì)較低、體系成熟度高等特點(diǎn)，迄今為止仍然是微藻生物工程領(lǐng)域的主要研究方向。

針對(duì)天然微藻種質(zhì)資源挖掘和分析等相關(guān)內(nèi)容，此前已有相關(guān)綜述進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)，在此僅做簡(jiǎn)要介紹［8-9］。以微藻油脂合成研究為例，迄今為止研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可用于合成油脂的微藻，具有代表性的包括三角褐指藻（Phaeodactylum）、杜氏藻屬（Dunaliella）和微擬球藻屬（Nannochloropsis）等［10］。在氮限制條件下，上述微藻胞內(nèi)積累大量甘油三酯，其結(jié)構(gòu)與普通蔬菜油甘油三酯的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，具有食用油替代產(chǎn)品的潛力；同時(shí)，微藻油脂還可以通過(guò)酯化轉(zhuǎn)變?yōu)樯锊裼停ㄖ舅峒柞サ龋?，被視為?代可再生燃料的重要產(chǎn)品［11］。近年來(lái)，一類(lèi)新型產(chǎn)油微藻——真眼點(diǎn)藻（Eustigmatos）逐漸引起關(guān)注，其具有生長(zhǎng)速率快、積累高含量微藻油和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等特性，總脂和中性油脂的含量分別達(dá)到干重的63.4%和56.8%，EPA則可占干重的2.4%，在醫(yī)藥健康領(lǐng)域具有可觀的開(kāi)發(fā)潛力［12-14］。油脂類(lèi)產(chǎn)品之外，微藻多糖也因具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗病毒和抗輻射等特性，而被視為具有廣闊的應(yīng)用前景的微藻產(chǎn)品［15］。例如，纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）可積累大量的貯藏多糖β-1，3-葡聚糖，其可占干重的80%以上［16-17］。

基于天然微藻藻株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用嘗試中，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）合成蝦青素的技術(shù)最為成功。雨生紅球藻天然可以進(jìn)行蝦青素的胞內(nèi)合成和積累（最高可達(dá)細(xì)胞生物質(zhì)干重的6%）［18-20］，且其合成的天然蝦青素（左旋3S、3′S構(gòu)象），具有比人工合成蝦青素更高的生物活性［21］。近幾年，雨生紅球藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭十分迅猛，預(yù)計(jì)到2024年全球市場(chǎng)產(chǎn)值將達(dá)到3.5億美元，中國(guó)市場(chǎng)產(chǎn)值達(dá)到2.3億美元；目前國(guó)內(nèi)天然蝦青素生產(chǎn)企業(yè)集中分布于云南省，在健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的大背景下表現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)?！安鹈ず小笔降拈_(kāi)發(fā)策略主要以對(duì)微藻生物資源的挖掘?yàn)榛A(chǔ)，其產(chǎn)品類(lèi)型上也僅限于微藻的天然代謝產(chǎn)物，無(wú)論是產(chǎn)物合成能力還是胞內(nèi)積累容量都受到微藻天然代謝模式的約束，提升空間有限。同時(shí)，所挖掘到的天然微藻資源，在培養(yǎng)、采收、產(chǎn)物提取等環(huán)節(jié)上都存在各種不確定性，同時(shí)在一定程度上限制了技術(shù)成功放大應(yīng)用的潛力。

1.2 “擠海綿”——激活微藻代謝合成潛力

對(duì)天然微藻種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)，除了大規(guī)模新種質(zhì)篩選以挖掘藻株和產(chǎn)品外，柔性的環(huán)境（物理、化學(xué)、生物）條件誘導(dǎo)“激活”也是重要的手段。通過(guò)特殊的培養(yǎng)條件和策略“激活”微藻沉默代謝途徑和功能模塊，結(jié)合組學(xué)分析技術(shù)，探究胞內(nèi)代謝物的變化，實(shí)現(xiàn)環(huán)境響應(yīng)型高附加化合物積累的模式，被稱(chēng)為“擠海綿”。相比簡(jiǎn)單的“拆盲盒”模式，該模式將有效拓展對(duì)微藻代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)和利用。目前廣泛應(yīng)用的“擠海綿”策略包括逆境脅迫、化學(xué)調(diào)節(jié)劑添加以及共培養(yǎng)等手段。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以?xún)?yōu)化微藻和其他微生物細(xì)胞中特定代謝產(chǎn)物含量，已成為廣泛應(yīng)用的生物工程技術(shù)。例如，Yang等［22］在2015年報(bào)道稱(chēng)，小球藻（Chlorella minutissimaUTEX 2341）的培養(yǎng)體系中在添加鎘離子和銅離子后，細(xì)胞油脂含量分別顯著提高了21.07%和93.90%。近年來(lái)，在常規(guī)培養(yǎng)組分和條件之外，進(jìn)一步引入具有特殊生理和代謝活性的代謝調(diào)節(jié)劑，成為調(diào)控微藻代謝合成的新策略，其中植物激素類(lèi)物質(zhì)的使用已表現(xiàn)出可觀的潛力。2020年，Chen等［23］發(fā)現(xiàn)，在綠球藻（Chromochloris zofingiensi）培養(yǎng)體系中添加多種植物激素類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)吲哚丙酸（10 mg/L）可以有效刺激其蝦青素與脂類(lèi)的共合成，總脂占細(xì)胞干重的含量比例達(dá)到64.5%，合成速率達(dá)到445.7 mg/（L·d），與此同時(shí)蝦青素在細(xì)胞干重中的積累量也達(dá)到13.1 mg/g，比對(duì)照菌株提高48.9%，為該藻株中已報(bào)道的最高水平。天然微藻藻株中，蝦青素的合成是作為抵抗高溫、高光等逆境脅迫因素的防御機(jī)制而存在的，植物激素類(lèi)物質(zhì)的加入可以直接或間接（激活第二信使等）對(duì)其調(diào)控和代謝途徑進(jìn)行擾動(dòng)，從而促進(jìn)蝦青素的積累。

藍(lán)藻中相容性物質(zhì)的合成和積累是另一個(gè)典型的逆境脅迫激發(fā)特定產(chǎn)物合成的例子［24］。針對(duì)特定藍(lán)藻藻株，通過(guò)調(diào)節(jié)其培養(yǎng)基中的鹽濃度，即可引發(fā)胞內(nèi)特定類(lèi)型相容性物質(zhì)的積累。而藍(lán)藻相容性物質(zhì)已被證明具有廣泛的用途，例如：海藻糖和甘油葡糖苷可作為食品和化妝品添加劑，具有保濕、抗氧化等功效，可作為商業(yè)蛋白穩(wěn)定劑等［25-27］；甜菜堿具有保濕、清潔、促進(jìn)代謝、抗腫瘤、降血壓、抗消化性潰瘍等作用，在人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、動(dòng)物飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化妝行業(yè)具有廣闊的開(kāi)發(fā)空間［28-29］。近期，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所科研團(tuán)隊(duì)利用螺旋藻這一特點(diǎn)開(kāi)發(fā)了螺旋藻制備甘油葡糖苷技術(shù)，并在國(guó)際上率先實(shí)現(xiàn)螺旋藻合成甘油葡糖苷技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)品商業(yè)化銷(xiāo)售。

在物理和化學(xué)擾動(dòng)之外，在生物學(xué)層面應(yīng)用共培養(yǎng)策略同樣可以對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成過(guò)程產(chǎn)生顯著調(diào)節(jié)效果，利用菌-藻/藻-藻之間的共生關(guān)系來(lái)提高微藻生物質(zhì)和高附加產(chǎn)值化合物的生產(chǎn)正在引起關(guān)注［30］。例如，Wu等［31-32］將萊茵衣藻與慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）或圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)氫氣，氫氣產(chǎn)率分別達(dá)到0.42 μmol/h和0.36 μmol/h，已達(dá)到萊茵衣藻產(chǎn)氫速率的17倍。2021年，Ouyang等［33］研 究 發(fā) 現(xiàn)，纖 細(xì) 裸 藻（Euglena.gracilis）與需鈉弧菌（Vibrio natriegens）的共培養(yǎng)能夠顯著提高纖細(xì)裸藻的干重（15%）、葉綠素（23.75%）和淀粉含量（12%）。另外，在共培養(yǎng)策略中，一些異養(yǎng)菌可以通過(guò)改變光合微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或小分子成分來(lái)間接影響光合微生物的基因表達(dá)［34］。例如，藍(lán)藻進(jìn)行光合作用容易產(chǎn)生活性氧，其在培養(yǎng)基中大量積累會(huì)抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)。Li等［35］在研究聚球藻（Synechococcus elongatesPCC 7942，下 文 簡(jiǎn) 稱(chēng)PCC 7942）和黏紅酵母（Rhodotorula glutinis）組成的人工混菌體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)R.glutinis的存在可有效清除體系內(nèi)的活性氧物質(zhì)從而解除藍(lán)藻的生長(zhǎng)抑制。

1.3 “動(dòng)刀子”——重塑微藻細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)

隨著合成生物學(xué)工具的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，通過(guò)代謝途徑人工設(shè)計(jì)重構(gòu)和微藻天然代謝網(wǎng)絡(luò)修飾，將光合碳流重定向至天然或非天然代謝產(chǎn)物的微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)開(kāi)發(fā)模式引起越來(lái)越多的關(guān)注，這種基于人工設(shè)計(jì)和理性改造的開(kāi)發(fā)模式可稱(chēng)為“動(dòng)刀子”。該模式主要是通過(guò)對(duì)微藻的遺傳背景和代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，進(jìn)而根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑構(gòu)建需求，引入外源基因并對(duì)內(nèi)源途徑進(jìn)行修飾和改造，很明顯該模式具有靶向性強(qiáng)、拓展性好的特點(diǎn)?！皠?dòng)刀子”開(kāi)發(fā)模式在原核藍(lán)藻和真核微藻中都取得了巨大的進(jìn)展。原核藍(lán)藻是地球上最早出現(xiàn)的能夠進(jìn)行放氧型光合作用的微生物［36］，與真核微藻相比，其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于進(jìn)行遺傳操作的優(yōu)勢(shì)［37-38］。因此，合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用首先在藍(lán)藻遺傳 改 造 中 取 得 顯 著 成 效［39］。1999年，Deng和Coleman等［40］首次報(bào)道，在PCC 7942中利用rbcL啟動(dòng)子控制來(lái)源于Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶Ⅱ，成功實(shí)現(xiàn)了乙醇合成，乙醇產(chǎn)量約為5 mmol/L（0.23 g/L），為首次報(bào)道的人工設(shè)計(jì)構(gòu)建合成非天然代謝產(chǎn)物的微藻光合細(xì)胞工廠。以此為基礎(chǔ)，在此后20年間，藍(lán)藻光驅(qū)固碳合成乙醇技術(shù)又取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，通過(guò)系統(tǒng)的酶工程、代謝工程、底盤(pán)工程、過(guò)程工程優(yōu)化，現(xiàn)階段藍(lán)藻細(xì)胞工廠的乙醇產(chǎn)量已達(dá)到5～10 g/L的水平，合成速率也達(dá)到200～300 mg/（L·d）的水平，表現(xiàn)出一定的工程應(yīng)用潛力［41］。美國(guó)藻醇Algenol生物燃料技術(shù)公司曾經(jīng)針對(duì)藍(lán)藻光驅(qū)固碳合成乙醇技術(shù)的發(fā)展和工程應(yīng)用展開(kāi)了全面系統(tǒng)的研究，通過(guò)篩選具有良好逆境適應(yīng)能力（高光、高碳、過(guò)氧化等）的新型藍(lán)藻底盤(pán)，進(jìn)而對(duì)乙醇合成途徑進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，獲得了可以利用海水和工業(yè)廢氣進(jìn)行培養(yǎng)并穩(wěn)定生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)醇藻株，并進(jìn)行了3000組反應(yīng)器規(guī)模的工程應(yīng)用示范，該技術(shù)還于2015年獲得美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)獎(jiǎng)。而整體經(jīng)濟(jì)成本測(cè)算顯示，如果能夠?qū)a(chǎn)醇之后剩余藍(lán)藻生物質(zhì)進(jìn)行精煉制備生物柴油等其他產(chǎn)品，該技術(shù)在整體成本上已經(jīng)具備初步經(jīng)濟(jì)可行性。當(dāng)然，隨著石油價(jià)格近年持續(xù)走低，該技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用尚未取得實(shí)質(zhì)性推動(dòng)，Algenol公司的發(fā)展重點(diǎn)也逐漸轉(zhuǎn)向高值藻類(lèi)營(yíng)養(yǎng)品的開(kāi)發(fā)。除乙醇外，應(yīng)用合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)，藍(lán)藻光合細(xì)胞工廠合成糖、酸、脂、烴、醛、酮和芳香族化合物等數(shù)十種重要產(chǎn)品的技術(shù)路線也已打通。例如，2016年，Gao等［42］通過(guò)改造磷酸甲基赤蘚糖醇代謝途徑，使得工程菌株將約40%的光合固定碳定向到異戊二烯生物合成途徑，異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到1.26 g/L。2020年，Qiao等［25］通過(guò)引入來(lái)自魚(yú)腥藻的海藻糖合成途徑與沉睡搖蚊來(lái)源的海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TRET1，成功構(gòu)建直接固定CO2，高效合成和分泌海藻糖的聚球藻細(xì)胞工廠，胞外海藻糖產(chǎn)量可達(dá)5.7 g/L。

“動(dòng)刀子”模式除了能夠?qū)崿F(xiàn)非天然產(chǎn)物的光驅(qū)固碳合成外，還能夠通過(guò)微藻代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)天然類(lèi)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)和品控。1996年，美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室首次通過(guò)控制脂質(zhì)積累的關(guān)鍵酶（乙酰輔酶A羧化酶）基因的高效表達(dá)，提高小環(huán)藻的脂質(zhì)含量，為高油脂藻種培育開(kāi)辟了一條新技術(shù)途徑［43］。2014年，Hamilton等［44］首次報(bào)道關(guān)于ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成的轉(zhuǎn)基因藻株，在三角褐指藻中通過(guò)異源表達(dá)?；o酶A依賴(lài)型Δ6-去飽和酶和Δ5-延長(zhǎng)酶增加二十二碳六烯酸（DHA）的含量。2017年，Xin等［45］探究了微擬球藻中一系列內(nèi)源Ⅱ型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT2）的分工與合作機(jī)制，通過(guò)人為控制DGAT2A、DGAT2D與DGAT2C三者間轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度，實(shí)現(xiàn)了藻油中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸比重的理性設(shè)計(jì)，從而生產(chǎn)出了飽和度“定制化”的藻油，將微藻細(xì)胞工廠推入“藻油品質(zhì)定制化”時(shí)代。2021年，Jeon等［46］在微擬球藻中通過(guò)過(guò)量表達(dá)內(nèi)源性NADP-依賴(lài)型蘋(píng)果酸酶NsME1提高油脂和脂肪酸甲酯產(chǎn)量，使其產(chǎn)量比對(duì)照菌株分別提高38%和47%。通過(guò)遺傳操作進(jìn)行靶向性代謝調(diào)控和重塑，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)光合碳流的理性重定向，有效增加分配給目標(biāo)產(chǎn)物合成的代謝流；但需要注意的是，該技術(shù)模式目前更多應(yīng)用于遺傳操作體系完善、代謝和生理背景清楚的模式藻株中，而模式藻株因?yàn)樯L(zhǎng)速度、固碳效率、脅迫耐受性等工程性狀的不足，在工程放大過(guò)程中往往會(huì)遇到困難和瓶頸。在未來(lái)，這一問(wèn)題有望通過(guò)兩種策略的應(yīng)用得到解決：①挖掘鑒定具有良好工業(yè)應(yīng)用屬性（生長(zhǎng)速度快、固碳效率高、高溫高光耐受能力強(qiáng)、采收性能好）的非常規(guī)微藻藻株，進(jìn)行底盤(pán)化開(kāi)發(fā)，系統(tǒng)解析其遺傳、代謝和生理背景，開(kāi)發(fā)并完善其遺傳操作體系，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新一代光合細(xì)胞工廠；②針對(duì)各種工業(yè)應(yīng)用場(chǎng)景，系統(tǒng)挖掘、優(yōu)化、設(shè)計(jì)通用型功能元件和模塊，并應(yīng)用于對(duì)已有基于模式底盤(pán)的微藻光合細(xì)胞工廠的改造，針對(duì)性地提升其工業(yè)過(guò)程的適配性，推動(dòng)技術(shù)放大應(yīng)用。

研究人員在利用“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”單種模式開(kāi)發(fā)和挖掘高附加產(chǎn)值化學(xué)品方面做了深入研究。前期研究人員系統(tǒng)總結(jié)了藍(lán)藻固碳合成生物燃料和化學(xué)品產(chǎn)量（0.6 mg/L～5 g/L），大部分產(chǎn)量低于異源模式微生物如大腸桿菌和釀酒酵母［39，47］，產(chǎn)量相對(duì)較高的乙醇，有大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用潛力，但大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中關(guān)于不同來(lái)源CO2、不同環(huán)境對(duì)微藻生長(zhǎng)和代謝的影響，需要在未來(lái)研究中繼續(xù)探索。另外，未來(lái)可以通過(guò)選取抗逆和速生菌株，利用兩種或多種模式互補(bǔ)的策略?xún)?yōu)化異源合成途徑與底盤(pán)適配性，進(jìn)一步提高藻株底盤(pán)性能和產(chǎn)力。例如，將基因工程改造菌株進(jìn)行脅迫條件培養(yǎng)優(yōu)化，提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量。2019年，Liu等［48］在集胞藻（Synechocystissp.PCC 6803，下文簡(jiǎn)稱(chēng)PCC 6803）中表達(dá)雨生紅球藻來(lái)源的β-胡蘿卜素酮酶基因bkt和類(lèi)胡蘿卜素羥化酶基因crtR-B，實(shí)現(xiàn)異源合成蝦青素，產(chǎn)量達(dá)1.12 mg/g±0.01 mg/g，并且通過(guò)缺氮脅迫培養(yǎng)優(yōu)化，蝦青素產(chǎn)量提高達(dá)到4.81 mg/g±0.06 mg/g。在未來(lái)研究中，將3種策略進(jìn)行組合，發(fā)揮協(xié)同作用，有望在新穎化合物的合成及產(chǎn)量?jī)?yōu)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2 微藻光驅(qū)固碳合成過(guò)程的新穎應(yīng)用場(chǎng)景拓展

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展驅(qū)動(dòng)著微藻光合代謝網(wǎng)絡(luò)的深度重塑，也有效擴(kuò)展了基于微藻光驅(qū)固碳合成過(guò)程的技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景。通過(guò)與界面技術(shù)、材料技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)等手段的交叉融合，微藻光驅(qū)固碳合成在進(jìn)行生物基產(chǎn)品合成之外，也在生物醫(yī)學(xué)、生物光伏以及航天和生命維持等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

2.1 微藻光合放氧的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

乏氧是多數(shù)腫瘤的顯著特征，其具有促進(jìn)血管形成、腫瘤擴(kuò)散、維持腫瘤微環(huán)境及引起耐藥性等特 點(diǎn)［49］。光 動(dòng) 力 治 療（photodynamic therapy，PDT）是腫瘤治療的潛在手段之一，其通過(guò)光敏劑和特定波長(zhǎng)的激發(fā)光催化O2生成細(xì)胞毒性活性氧（reactive oxygen species，ROS）來(lái)抑制腫瘤擴(kuò)散［50］，因具有選擇性好、毒性低、創(chuàng)傷和抵抗力小等特點(diǎn)而備受關(guān)注［51］。然而，它的作用受到乏氧的限制，反過(guò)來(lái)又因消耗O2而加劇乏氧。因此，圍繞如何增加光動(dòng)力治療過(guò)程中的氧補(bǔ)充這一問(wèn)題，研究者們開(kāi)發(fā)了各種策略，包括直接遞送O2進(jìn)入腫瘤、酶催化產(chǎn)氧及響應(yīng)型材料原位產(chǎn)氧遞送等［52］。然而，上述緩解乏氧的策略仍面臨氧補(bǔ)充不足、原位產(chǎn)氧的化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜/不可控和潛在的生物安全性問(wèn)題等挑戰(zhàn)，阻礙了相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化。

微藻作為一類(lèi)光合放氧的微生物，可以利用水作為電子供體將CO2還原為有機(jī)物，并不斷釋放氧氣。受此啟發(fā)，近年來(lái)已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)了微藻與不同光敏劑結(jié)合構(gòu)建的遞送系統(tǒng)，可極大改善病灶部位乏氧環(huán)境，在增強(qiáng)PDT治療、抑制腫瘤耐藥性等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［53-60］。2020年，Huo等［54］構(gòu)建了一種光敏劑二氫卟吩e6（Ce6）與PCC 7942的雜化功能系統(tǒng)（CeCyan），可用于在光激發(fā)條件下通過(guò)光合放氧來(lái)增強(qiáng)靶向腫瘤的PDT治療。藍(lán)藻只能吸收420～660 nm范圍內(nèi)的波長(zhǎng)進(jìn)行光合作用，而光敏劑Ce6可以在660 nm下激活，因此，這一光敏細(xì)菌能夠?qū)崿F(xiàn)在單一光源激發(fā)下（660 nm）的光合作用及光敏劑活化，使得敏化后的Ce6能夠迅速與分子氧發(fā)生三線態(tài)湮滅生成單線態(tài)氧物種（1O2），為克服Ⅱ型光敏劑的氧依賴(lài)提供一種基于生物放氧的增效方案［圖2（a）］。另外，Sun等［55］將聚球藻S.elongatusUTEX 2973與可控光敏劑吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）結(jié)合制成可注射型水凝膠以緩解乏氧效應(yīng)。使用640 nm和808 nm激光照射包裝好的水凝膠，藍(lán)藻細(xì)胞將通過(guò)光合作用持續(xù)產(chǎn)生O2并產(chǎn)生大量的ROS，其在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。2021年，Wang等［61］利用海藻酸鈣凝膠包裹小球藻形成“Chlorella-Gel”，進(jìn)而將其與全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）荷載光敏劑Ce6的納米粒（PFC-NPs）構(gòu)成增氧給藥系統(tǒng)。采用原位注射方式將Chlorella-Gel遞送到小鼠腫瘤部位，再將PFC-NPs靜脈注射到小鼠體內(nèi)，小球藻經(jīng)激光照射后進(jìn)行光合作用產(chǎn)生的氧氣被PFC吸收，PFC作為儲(chǔ)氧罐將氧氣存儲(chǔ)起來(lái)，供給光敏劑轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，起到了高效的腫瘤細(xì)胞殺傷效果。目前，微藻遞送系統(tǒng)在臨床應(yīng)用中仍然存在諸多挑戰(zhàn)，如光敏劑不良反應(yīng)、光源波長(zhǎng)穿透能力、微藻存活時(shí)間和生物安全性等問(wèn)題，但微藻遞送系統(tǒng)為改善乏氧PDT治療開(kāi)辟了一條全新的思路，隨著納米醫(yī)學(xué)、合成生物學(xué)和光學(xué)學(xué)科等交叉學(xué)科的發(fā)展與融合，這些問(wèn)題有望逐步得以解決。

圖2 微藻光驅(qū)固碳合成過(guò)程新穎應(yīng)用場(chǎng)景Fig.2 Schematic illustration of new application scenarios of microalgae with desired photosynthesis and biosynthesis properties[(a)The oxygenic photosynthesis and PDT process using CeCyan cells.These photosensitive CeCyan cells serve as the Ce6 carrier,delivering the photosensitizers to the tumor cells for potential photosynthesis-enhanced PDT under laser irradiation[54];(b)The engineered strain UTEX 2973,equipped with the photosynthetic machinery and a D-lactate synthesis pathway.The engineered strain S.oneidensis,equipped with a D-lactate oxida‐tion pathway and the extracellular electron transport machinery,releases electrons from D-lactate and transfers them to the anode for electricity pro‐duction[67];(c)The bioproduction of a Mars-specific rocket propellant,2,3-BDO,from CO2,sunlight and water on Mars.Photosynthetic cyanobacte‐ria convert Martian CO2 into sugars that are upgraded by engineered Escherichia coli into 2,3-BDO[72].]PS I—photosystem I;PS II—photosystem II;ATPase—adenosine triphosphate synthases;CBB cycle—Calvin-Benson-Bassham cycle

微藻光合放氧除了應(yīng)用于腫瘤治療外，在心血管疾病治療、大腦供氧強(qiáng)化和抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等領(lǐng)域也能起到作用。2017年，研究人員將聚球藻注射到活的大鼠的缺血性心肌中，當(dāng)進(jìn)行光照射時(shí)，藍(lán)藻產(chǎn)生氧氣，起到了保護(hù)心肌代謝、增強(qiáng)心輸出量的效果［62］。但是，藍(lán)藻在組織中只能短暫存活，大多數(shù)注射的細(xì)胞在24 h后從組織中清除。因此，在急性心肌梗死后血運(yùn)重建需要暫時(shí)供養(yǎng)的情況下，這種治療才具有一定應(yīng)用潛力。2021年，?zugur等［63］將綠藻（衣藻屬）或PCC 6803注入蝌蚪的心臟，隨著心跳，微藻細(xì)胞緩慢地穿過(guò)血管，最終到達(dá)大腦。通過(guò)監(jiān)測(cè)頭部神經(jīng)活動(dòng)和氧氣水平，發(fā)現(xiàn)在光照條件下所輸入的微藻細(xì)胞可以持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)生O2。在嚴(yán)重缺氧環(huán)境，當(dāng)神經(jīng)元活動(dòng)完全停止時(shí)，光合作用產(chǎn)O2可以激發(fā)神經(jīng)元活動(dòng)的重新啟動(dòng)。上述兩個(gè)應(yīng)用均為直接注射藍(lán)藻，在進(jìn)行光照時(shí)，存在不同波長(zhǎng)對(duì)于皮膚穿透性不同的局限性，有研究者針對(duì)這一局限性，將藍(lán)藻與可控光敏劑結(jié)合，構(gòu)建近紅外光響應(yīng)時(shí)空可控的藍(lán)藻遞送系統(tǒng)，可吸收808 nm近紅外光并轉(zhuǎn)化為藍(lán)藻可吸收的藍(lán)光，能夠深層穿透組織，保證了光合產(chǎn)氧量，抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)，增加抗炎巨噬細(xì)胞數(shù)量，與甲氨蝶呤協(xié)同抗炎，表現(xiàn)出良好的抗類(lèi)風(fēng)濕PDT治療效果［57］。除了這種“天然”光合作用最終產(chǎn)物O2，藍(lán)藻暗反應(yīng)過(guò)程中合成的糖類(lèi)物質(zhì)，也可以供給宿主，成為第2類(lèi)有益的副產(chǎn)品。另外，在不久的未來(lái)，通過(guò)合成生物學(xué)策略，改造藍(lán)藻合成各種可釋放的物質(zhì)，例如可合成促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF生成的物質(zhì)，有望在增強(qiáng)血管通透性等方面發(fā)揮功能。脊椎動(dòng)物和光合微藻嵌合體的產(chǎn)生將促進(jìn)一些光合產(chǎn)氧代謝基本原理的揭示，但更重要的是，其也為生物醫(yī)療領(lǐng)域的開(kāi)辟了新的創(chuàng)新思路和發(fā)展模式。

2.2 基于微藻光驅(qū)固碳合成的新型生物光伏開(kāi)發(fā)策略

發(fā)展和利用可再生能源是人類(lèi)社會(huì)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必由之路。作為地球上最豐富的可再生能源，太陽(yáng)能利用的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究具有重大的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。光伏（photovoltaics，PV）發(fā)電是利用半導(dǎo)體界面的光生伏特效應(yīng)而將光能直接轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔艿囊环N技術(shù)，是太陽(yáng)能利用領(lǐng)域不可忽視的重要方向。但是部分光伏材料含有毒元素，廢棄太陽(yáng)能電池板總量大且難以回收等問(wèn)題引發(fā)了人們對(duì)環(huán)境的擔(dān)憂(yōu)［64］。近幾年，利用光合微藻產(chǎn)生物電的生物光伏（biophotovoltaic，BPV）技術(shù)［65］，因其具有碳中性、良好的環(huán)境相容性和潛在低成本等特點(diǎn)而引起關(guān)注［66］。BPV過(guò)程可以分為產(chǎn)電和放電兩個(gè)階段。在產(chǎn)電階段，太陽(yáng)光子首先被光系統(tǒng)吸收并產(chǎn)生激發(fā)電子儲(chǔ)存在高能中間體或由碳固定合成的有機(jī)化合物中，然后將捕獲的電子從細(xì)胞內(nèi)部輸出到外部電路，從而產(chǎn)生電流，即放電階段［66］。傳統(tǒng)的BPV系統(tǒng)主要將光合細(xì)胞固定在陽(yáng)極上，直接用于細(xì)胞外電子傳遞，輸出功率較低，比半導(dǎo)體光伏技術(shù)低3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。其主要原因是微藻細(xì)胞雖然具有很高的捕光能力，但胞內(nèi)產(chǎn)電和胞外電子傳遞能力極弱［67］。

圍繞以上問(wèn)題，近幾年不同研究者從混合產(chǎn)電微生物菌群，微藻胞內(nèi)電子合成強(qiáng)化和胞外電子傳遞強(qiáng)化等方面展開(kāi)研究。

（1）構(gòu)建雙菌生物光伏系統(tǒng)2019年，Zhu等［68］通過(guò)產(chǎn)D-乳酸的工程藍(lán)藻與高效利用D-乳酸產(chǎn)電的希瓦氏菌混養(yǎng)，搭建了具有可以進(jìn)行定向電子流生成的合成微生物組。在上述雙菌系統(tǒng)中，藍(lán)藻吸收光能并固定CO2來(lái)合成能量載體D-乳酸，希瓦氏菌則氧化D-乳酸產(chǎn)電，由此形成一條從光子到D-乳酸再到電能的定向電子流，完成從光能到化學(xué)能再到電能的能量轉(zhuǎn)化過(guò)程。通過(guò)在遺傳、環(huán)境和裝置層面的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化，雙菌生物光伏系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了高效、穩(wěn)定的功率輸出，其最大功率密度達(dá)到150 mW/m2。采用連續(xù)流加培養(yǎng)方式，該雙菌生物光伏系統(tǒng)可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)40 d以上的功率輸出，且平均功率密度達(dá)到135 mW/m2的較高水平［圖2（b）］。

（2）胞內(nèi)電子合成強(qiáng)化2021年，F(xiàn)iroozabadi等［69］搭建并且優(yōu)化了由PCC 6803喂養(yǎng)的BPV裝置，通過(guò)通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）尋找PCC 6803提高產(chǎn)電量的關(guān)鍵步驟，進(jìn)一步預(yù)測(cè)關(guān)鍵反應(yīng)的調(diào)節(jié)化合物。結(jié)果表明，在PCC 6803的BG-11懸浮液中添加調(diào)節(jié)化合物NH4Cl，使最大功率密度達(dá)到148.27 mW/m2，是未添加對(duì)照組的40.5倍以上。

（3）胞外電子傳遞強(qiáng)化細(xì)胞色素蛋白是電子跨越絕緣細(xì)胞膜的高速通道，連接了胞內(nèi)電子生成系統(tǒng)與胞外電子傳遞系統(tǒng)，同時(shí)也是直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種電子傳遞機(jī)制的交匯點(diǎn)［70］。2016年，Sekar等［71］將Geobacter的外膜色素蛋白OmcS引入PCC 7942，外膜色素蛋白的引入顯著提升了PCC 7942的胞外電子傳遞速率，使得BPV的電子生成能力提升了9倍。

未來(lái)可以進(jìn)一步利用合成生物學(xué)策略?xún)?yōu)化藍(lán)藻及其他微藻的胞內(nèi)代謝提高產(chǎn)電能力；進(jìn)一步設(shè)計(jì)、優(yōu)化微藻的細(xì)胞色素蛋白系統(tǒng)，使得電子流更多流向與電極相關(guān)聯(lián)的色素蛋白；優(yōu)化電解質(zhì)的電子傳遞效率，通過(guò)改善微藻外周的電化學(xué)性能改變電子在外部環(huán)境的傳遞速率，提升微生物燃料電池的功率輸出。

2.3 微藻光驅(qū)固碳合成在航天和生命維持系統(tǒng)中的應(yīng)用

在航空航天和生命維持領(lǐng)域，基于微藻放氧型光合作用開(kāi)發(fā)并應(yīng)用生命維持系統(tǒng)，有著長(zhǎng)期的研究歷史。理論上，微藻可以固定空間工作人員呼出的CO2并供應(yīng)其呼吸所需氧氣；在美國(guó)宇航局（NASA）和歐空局的相關(guān)報(bào)告和展望中，都強(qiáng)調(diào)了未來(lái)空間技術(shù)乃至行星探測(cè)過(guò)程中，微藻將起到不可替代的作用。近期，利用微藻在空間航行和地外行星探索過(guò)程中合成供給航空燃料，成為一種新的微藻航天應(yīng)用場(chǎng)景。NASA“毅力號(hào)”、我國(guó)的“祝融號(hào)”等火星探測(cè)器已經(jīng)成功登陸火星并能執(zhí)行各種預(yù)定任務(wù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)由火星返回地球甚至未來(lái)以火星為基地進(jìn)一步進(jìn)行外太空探索的過(guò)程中，如何有效地生產(chǎn)和供應(yīng)航天燃料將成為新的課題。

從地球發(fā)射離開(kāi)火星的火箭發(fā)動(dòng)機(jī)目前以甲烷和液氧（LOX）為燃料。但是，火星上并不存在這兩種物質(zhì)，這意味著首先需要從地球運(yùn)來(lái)這些燃料，然后再為返回航天器提供動(dòng)力進(jìn)入火星軌道?？紤]到火星和地球之間的引力和大氣差異，為回程運(yùn)送LOX從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上都是難度極大甚至不可行的。因此，研究人員提出利用CO2、水和陽(yáng)光，通過(guò)生物技術(shù)支持的原位資源利用（Bio-ISRU）在火星上合成火箭推進(jìn)劑——2，3-丁二醇（2，3-butanediol，2，3-BDO）［圖2（c）］［72］。藍(lán)藻將火星CO2轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)，這些糖類(lèi)通過(guò)工程改造的大腸桿菌轉(zhuǎn)化成2，3-BDO。Bio-ISRU合成2，3-BDO與傳統(tǒng)的化學(xué)催化合成2，3-BDO策略相比，能量降低32%，需要的有效載荷質(zhì)量高2.8倍，并產(chǎn)生44 t的氧氣用于殖民。通過(guò)模型指導(dǎo)對(duì)生物和材料優(yōu)化后，使Bio-ISRU耗能降低59%，有效載荷質(zhì)量降低13%，同時(shí)還能產(chǎn)生20 t多余氧氣。上述研究為推動(dòng)行星際空間的旅行做出了開(kāi)創(chuàng)性的積極探索，在未來(lái)可以進(jìn)一步探究火星環(huán)境對(duì)藍(lán)藻及大腸桿菌等生理代謝的影響，并通過(guò)合成生物學(xué)等策略?xún)?yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

3 微藻合成生物技術(shù)發(fā)展的新方向展望

如上所述，隨著合成生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)和生物工程的快速發(fā)展，微藻光驅(qū)固碳代謝網(wǎng)絡(luò)和技術(shù)應(yīng)用范圍都得到極大拓展［5，10］。而隨之產(chǎn)生的問(wèn)題是，微藻的遺傳、生理和代謝特性與全新的場(chǎng)景和過(guò)程中往往并不適配，通常需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過(guò)程中特定的工藝和環(huán)境進(jìn)行設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。

3.1 微藻合成生物學(xué)工具箱的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化

高效的合成生物學(xué)工具和策略，在微生物異源合成高附加產(chǎn)值化合物技術(shù)的開(kāi)發(fā)中具有無(wú)法替代的重要性。但是大多數(shù)微藻中合成生物學(xué)工具箱的開(kāi)發(fā)仍明顯滯后于異養(yǎng)模式菌株，對(duì)目標(biāo)蛋白、途徑和功能模塊豐度的動(dòng)態(tài)靶向調(diào)控能力存在很多欠缺。因此，微藻中合成生物學(xué)工具箱的發(fā)展完善對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)發(fā)展有著重要的推動(dòng)意義。目前，在各種生物體系中蓬勃發(fā)展應(yīng)用的CRISPR相關(guān)技術(shù)，在微藻中通常都有著良好的應(yīng)用效果，各類(lèi)微藻藻株中已經(jīng)建立了一系列基因編輯CRISPR（基于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）系統(tǒng)［73-77］。例如，2020年，Choi等［76］在藍(lán)藻中開(kāi)發(fā)了一種dCas12a介導(dǎo)的CRISPR干擾系統(tǒng)（CRISPRi-dCas12a），通過(guò)CRISPR-RNA（crRNA）和19nt同向重復(fù)序列有效阻斷了轉(zhuǎn)錄起始，導(dǎo)致53%～94%的基因抑制。在不降低抑制強(qiáng)度的情況下，也成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)crRNA陣列中多個(gè)基因的抑制［圖3（a）］。此外，2021年，本實(shí)驗(yàn)室的Zhang等［78］在PCC 7942中開(kāi)發(fā)了蛋白可控降解系統(tǒng)，在PCC 7942里用茶堿依賴(lài)型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大腸桿菌來(lái)源的ClpXPEc蛋白降解酶和SspB輔助蛋白，并將ssrADAS蛋白降解標(biāo)簽與GFP融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)含有ssrADAS標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白GFP的有效降解，該系統(tǒng)是藍(lán)藻最早報(bào)道的翻譯后水平的調(diào)控工具之一，具有響應(yīng)快、調(diào)控范圍廣和調(diào)控效果好的優(yōu)點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了OR Gate遺傳回路，實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞內(nèi)GlgC表達(dá)和糖原積累的調(diào)控。在未來(lái)研究中，可以進(jìn)一步評(píng)估在其他物種中建立的多種合成生物學(xué)工具，并將其應(yīng)用于微藻中。

圖3 開(kāi)發(fā)新應(yīng)用場(chǎng)景和規(guī)模化培養(yǎng)中面臨問(wèn)題的策略Fig.3 Strategies for solving emerging problems rising from new application scenarios and larger application scalesPQ—plastoquinone;Cytbf—cytochrome b6f complex;A0—special chlorophyll;A1—vitamin K;4Fe-4S—iron-sulfur centers;Fd—ferredoxin

3.2 開(kāi)發(fā)高效光合平臺(tái)

選擇優(yōu)良底盤(pán)性能的微藻對(duì)光驅(qū)固碳合成技術(shù)的工程化應(yīng)用具有重要作用。而目前廣泛采用的策略包括：

（1）自然界中分離和篩選具有速生和抗逆特性的候選藻株［79］。最近，有兩株新分離的聚球藻，第1個(gè)是聚球藻PCC 11801，具有天然轉(zhuǎn)化能力，生長(zhǎng)速度快，耐高光、高溫、CO2和海鹽濃度的特性［80-81］。第2個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的海洋藍(lán)藻聚球藻PCC 11901，具有自然轉(zhuǎn)化、2 h倍增時(shí)間、在高光和高鹽下生長(zhǎng)的特性，每升累積的干細(xì)胞重約為33 g［82］。最近，從鹽堿湖中分離出的耐鹽固氮菌株念珠藻Desmonostoc，比模式菌株念珠藻PCC 7120生長(zhǎng)速度快2倍［83］。

（2）選取基因型穩(wěn)定的宿主。在大規(guī)模長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，菌株基因組穩(wěn)定性問(wèn)題非常重要。在未來(lái)研究中，首先可以通過(guò)降低宿主自發(fā)突變率、刪除冗余基因，構(gòu)建最小基因組等策略提高宿主基因組穩(wěn)定性。其次，將產(chǎn)物合成途徑與宿主代謝網(wǎng)絡(luò)高度結(jié)合，使得合成的產(chǎn)物有利于菌株的生長(zhǎng)。合成產(chǎn)物工程菌株，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的負(fù)擔(dān)，通過(guò)基因編輯等手段降低產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將有利于降低工程菌株回復(fù)突變［84］。

（3）發(fā)展新型合成生物學(xué)工具和策略，拓寬微藻對(duì)太陽(yáng)光的捕集波段、提高其對(duì)太陽(yáng)光的捕集效率和光能的傳遞效率，相關(guān)內(nèi)容已有綜述論文進(jìn)行了詳細(xì)介紹［79，85-87］，本文不做詳細(xì)展開(kāi)。

針對(duì)自然光合效率低的問(wèn)題，2021年，美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室的研究人員，在PCC 6803構(gòu)建“人工PSⅡ”，從外部直接向光合作用電子轉(zhuǎn)移鏈（photosynthetic electron transfer chain，PETC）供電，再利用藍(lán)藻光系統(tǒng)Ⅰ驅(qū)動(dòng)CO2高效還原［88］。這種結(jié)構(gòu)的陰極在電化學(xué)上與缺乏光系統(tǒng)Ⅱ活性且不能獨(dú)立進(jìn)行光合作用的藍(lán)藻細(xì)胞結(jié)合［圖3（b）］。通過(guò)光系統(tǒng)Ⅰ，陰極照明將電子從外部電路傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的PETC，最終推動(dòng)藍(lán)藻將CO2轉(zhuǎn)化為CO2還原性產(chǎn)物。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了乙烯的光電生產(chǎn)，估算其第8天時(shí)乙烯效價(jià)可達(dá)0.365 mmol/（L·OD730），平均外源電子利用率為74.9%。這種新的光合作用概念，相比于自然光合作用，有望提高生產(chǎn)光驅(qū)固碳合成燃料化學(xué)品能力的理論上限，這無(wú)疑對(duì)于光合生物制造平臺(tái)具有重要意義。這種基于技術(shù)交叉應(yīng)用，跨越式提升微藻底盤(pán)能量利用效率的策略在未來(lái)將起到更重要的作用。

3.3 規(guī)?；囵B(yǎng)過(guò)程中防污染策略開(kāi)發(fā)

嚴(yán)苛的工業(yè)過(guò)程和環(huán)境條件是實(shí)現(xiàn)微藻光驅(qū)固碳技術(shù)規(guī)模化、穩(wěn)定化應(yīng)用的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。要在戶(hù)外大規(guī)模條件實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的微藻光驅(qū)固碳過(guò)程，需多維度和多視角地改造微藻藻株，使其適應(yīng)多樣性逆境條件。前期有相關(guān)綜述系統(tǒng)總結(jié)了優(yōu)化光合微藻在逆境脅迫下的工作穩(wěn)定性，開(kāi)發(fā)能夠適應(yīng)規(guī)?；瘧?yīng)用需求的抗逆型微藻藻株和工程藻株以及優(yōu)化藻株的大規(guī)模收集性能和裂解提取工藝等［85］。雖然以螺旋藻為代表的一些微藻能夠在戶(hù)外高鹽、高堿的嚴(yán)苛培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)，對(duì)周邊環(huán)境微生物的入侵有較好的抵抗能力［89］，但是生物污染仍然是大規(guī)模生產(chǎn)大多數(shù)微藻的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一［90-91］。通過(guò)滅菌或添加抗生素能夠一定程度上降低微藻培養(yǎng)的染菌率，但無(wú)疑將極大增加生產(chǎn)成本和抗生素濫用、污染的風(fēng)險(xiǎn)［92］。近幾年，研究人員提出利用低成本的異型生物質(zhì)（如三聚氰胺）作為大量營(yíng)養(yǎng)素，結(jié)合對(duì)培養(yǎng)藻類(lèi)代謝能力的改造，可以在不添加抗生素情況下就對(duì)工程藻株進(jìn)行選擇壓力篩選。2019年，Sel?o等［93］將三聚氰胺降解途徑引入到聚球藻（Synechococcussp.PCC 7002）中，利用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)提高工程菌對(duì)三聚氰胺的利用率，同時(shí)表達(dá)亞磷酸脫氫酶（PtxD：將亞磷酸轉(zhuǎn)化為磷酸鹽）使得聚球藻PCC 7002具有在亞磷酸鹽上生長(zhǎng)的能力。由于環(huán)境中大多數(shù)微生物不具備利用三聚氰胺和亞磷酸鹽的能力，以此可對(duì)此兩類(lèi)非常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力作為一個(gè)選擇標(biāo)簽用于突變株的篩選［圖3（c）］。在未來(lái)研究中，需進(jìn)一步利用合成生物學(xué)拓展底物的利用范圍，在節(jié)約成本的同時(shí)降低雜菌的污染。

3.4 開(kāi)發(fā)高效的防逃逸技術(shù)提高人工遺傳改造生命體的可控性

盡管合成生物技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用計(jì)劃徹底變革了微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的發(fā)展模式，展現(xiàn)出令人興奮的應(yīng)用前景，但轉(zhuǎn)基因藻株意外釋放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)疑也引發(fā)了嚴(yán)重的生物安全擔(dān)憂(yōu)［94］。例如，許多藍(lán)藻具有自然轉(zhuǎn)化的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻釋放到自然界中，可能會(huì)通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式將重組基因在自然群體間傳播［95-96］。因此，需要開(kāi)發(fā)高效的防逃逸技術(shù)提高人工遺傳改造生命的可控性。目前，防逃逸策略主要有被動(dòng)和主動(dòng)控制兩種［圖3（d）］［92，97］。2018年，Motomura等［98］基于營(yíng)養(yǎng)缺陷被動(dòng)型防逃逸策略，使PCC 7942的生長(zhǎng)和生存依賴(lài)于亞磷酸鹽（H3PO3），降低了其在自然界的生存能力。2019年，Zhou等［99］在PCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中開(kāi)發(fā)了鐵離子誘導(dǎo)毒性蛋白表達(dá)的主動(dòng)控制系統(tǒng)，逃逸測(cè)試結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)3 d的處理細(xì)胞的逃逸率低于檢測(cè)監(jiān)測(cè)最低限10?9。另外，遺傳法則的正交化也是一種可行、高效的防逃逸策略。其主要通過(guò)利用人造的編碼單元和編碼原理（包括非天然核苷酸、非天然氨基酸以及正交化的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程）實(shí)現(xiàn)遺傳中心法則的正交化，構(gòu)建正交化的人工生命體，其必須完全依靠實(shí)驗(yàn)室或者人工制造環(huán)境中的特殊營(yíng)養(yǎng)供給才能維持活性，一旦進(jìn)入自然環(huán)境則無(wú)法繁衍增殖［100］。該策略為開(kāi)發(fā)微藻防逃逸技術(shù)提供了一種潛在的方向。

4 總結(jié)

在全面推動(dòng)“碳達(dá)峰、碳中和”任務(wù)實(shí)施的大背景下，開(kāi)發(fā)高效、低成本綠色環(huán)保的新技術(shù)具有重要的戰(zhàn)略意義。微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)因其具有利用太陽(yáng)能直接將二氧化碳轉(zhuǎn)化為重要生物基產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)而得到廣泛關(guān)注。得益于合成生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，對(duì)微藻天然光合代謝網(wǎng)絡(luò)重塑的深度和廣度都在不斷加強(qiáng)，越來(lái)越多的生物燃料和生物基化學(xué)品的微藻光驅(qū)固碳合成路線都已成功打通。微藻種質(zhì)資源的大規(guī)模挖掘和高通量分選、微藻遺傳和代謝機(jī)制的系統(tǒng)解析與動(dòng)態(tài)模擬以及蓬勃發(fā)展的合成生物技術(shù)，正在全面重塑微藻在生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域的發(fā)展模式和應(yīng)用場(chǎng)景。本文將微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)開(kāi)發(fā)總結(jié)為“拆盲盒”“擠海綿”和“動(dòng)刀子”3種基本模式，并對(duì)其研究進(jìn)展、重要突破和代表性應(yīng)用示范進(jìn)行了介紹。在可見(jiàn)的未來(lái)，針對(duì)持續(xù)增長(zhǎng)的微藻種質(zhì)資源庫(kù)，在全面的“掃描性”種質(zhì)評(píng)價(jià)和基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，結(jié)合環(huán)境擾動(dòng)與人工改造的多維手段，充分激發(fā)微藻光合代謝潛力，深度拓展微藻固碳合成網(wǎng)絡(luò)，必將極大加強(qiáng)對(duì)微藻光合碳流的人工設(shè)計(jì)和駕馭能力。在代謝與合成之外，合成生物學(xué)技術(shù)手段還使得改變微藻細(xì)胞生理和代謝行為的時(shí)空限定成為可能，有望實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間、特定環(huán)境、特定信號(hào)響應(yīng)性的微藻放氧、固碳、產(chǎn)電等設(shè)定活動(dòng)，從而推動(dòng)微藻生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)、生物光伏、航空航天技術(shù)等全新場(chǎng)景和技術(shù)領(lǐng)域的交叉融合。當(dāng)然，隨著微藻生物技術(shù)應(yīng)用深度和廣度的全面拓展，微藻的遺傳、生理和代謝特性還需要針對(duì)工程放大和靶向應(yīng)用過(guò)程中特定的體系、條件和環(huán)境進(jìn)行適配性的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化。目前，大多數(shù)微藻中合成生物學(xué)工具箱的開(kāi)發(fā)仍明顯滯后于異養(yǎng)模式菌株，加強(qiáng)微藻合成生物學(xué)工具箱的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化對(duì)微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)發(fā)展有著重要的推動(dòng)意義。選擇優(yōu)良底盤(pán)性能的微藻對(duì)擴(kuò)大化培養(yǎng)具有重要意義，除了篩選速生和抗逆底盤(pán)菌、增強(qiáng)菌株穩(wěn)定性，還可通過(guò)合成生物學(xué)策略拓寬微藻對(duì)太陽(yáng)光的捕集波段、提高其對(duì)太陽(yáng)光的捕集效率和光能的傳遞效率等。擴(kuò)大化培養(yǎng)過(guò)程中，生物污染仍然是大規(guī)模生產(chǎn)大多數(shù)微藻的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一，拓展底物利用范圍，既可以降低生產(chǎn)成本，也可以抑制雜菌污染。無(wú)論是傳統(tǒng)的遺傳操作還是新興的代謝工程與基因組工程，其潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)都需要引起重視并針對(duì)性地進(jìn)行限制策略的開(kāi)發(fā)，而高效的防逃逸技術(shù)將提高人工遺傳改造生命體的可控性?！半p碳”目標(biāo)引導(dǎo)下社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式轉(zhuǎn)型的大背景為微藻生物技術(shù)和生物工程發(fā)展提供了廣闊的平臺(tái)，而微藻合成生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展無(wú)疑正成為該領(lǐng)域的全新發(fā)展動(dòng)力，隨著越來(lái)越多高效、穩(wěn)定、安全的人工合成微藻光合細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，微藻光驅(qū)固碳合成技術(shù)的發(fā)展將獲得更多的助力，相關(guān)產(chǎn)業(yè)落地應(yīng)用也必將不再遙遠(yuǎn)。