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    從CO2到有機物
    ——碳中和的微藻綠色生物制造

    2022-12-14 03:30:22孫中亮陳輝王強
    合成生物學 2022年5期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)氫丙二醇微藻

    孫中亮,陳輝,王強

    (河南大學省部共建作物逆境適應與改良國家重點實驗室,河南 開封 475004)

    隨著世界經(jīng)濟的發(fā)展和人口的不斷增多,能源(石油、煤炭、天然氣等)需求量大幅增加,導致非可再生資源日益減少。傳統(tǒng)能源燃燒產(chǎn)生的CO2是導致全球溫室效應的主要原因之一,產(chǎn)生的其他污染物如SOx、NOx、粉塵等是造成生態(tài)環(huán)境惡化的主要元兇。2022年4月,國際能源署(International Energy Agency,IEA)發(fā)布Global Energy Review 2021[1],數(shù) 據(jù)表 明,自1990年以來,全球二氧化碳排放持續(xù)增長[圖1(a)],隨著全球經(jīng)濟從新冠疫情中逐漸復蘇,2021年全球CO2排放量達到363億噸,創(chuàng)歷史新高,比2020年增加6%[圖1(b)]。這一方面說明當前溫室氣體減排壓力巨大,另一方面也表明國際社會一致主張強化的氣候變化應對措施尚不夠完善。因此,改進生產(chǎn)方式、開發(fā)清潔的可再生能源、減少碳排放已成為當前產(chǎn)學研界關(guān)注的熱點。

    圖1 1990—2021年間全球CO2排放情況Fig.1 The Global CO2 emissions from 1990 to 2021

    目前,固碳的方法主要有物理封存、化學轉(zhuǎn)化和生物固定[2-4]。生物固定是利用植物的光合作用,將CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物,以有機碳的形式固定在植物體內(nèi)或土壤中,被認為是緩解全球溫室效應最具前景的方法[5-6]。在自然界中,微藻是一類單細胞或簡單多細胞的光合微生物,主要由藍藻、綠藻和硅藻等種類組成,廣泛分布在淡水和海洋系統(tǒng)中。微藻以不到高等植物1%的生物量為地球提供了超過50%的初級生產(chǎn)力和氧氣,是光合效率最高的生物類群[7]。又因為微藻具有利用光能固定CO2并通過各種代謝途徑快速合成蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子和各種次級代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢,而備受關(guān)注[8-10]。

    21世紀初,工程學思想策略與現(xiàn)代生物學、系統(tǒng)科學及合成科學相互融合,發(fā)展成為“合成生物學”,采用自下而上的策略,重編、改造天然的或設計合成新的生物體系,以揭示生物規(guī)律并利用生物規(guī)律合成生物產(chǎn)品[8]。由此開啟了以生物體機能進行大規(guī)模物質(zhì)加工與物質(zhì)轉(zhuǎn)化、為社會發(fā)展提供工業(yè)商品的生物制造新行業(yè)。微藻可以利用太陽能固定CO2并轉(zhuǎn)化為一系列有機物,其作為合成生物物質(zhì)的細胞工廠具有眾多生物學優(yōu)點,例如比植物細胞的結(jié)構(gòu)簡單且基因可操作性強、具有成熟的遺傳操作系統(tǒng)、能夠?qū)崿F(xiàn)基因組大片段敲除和轉(zhuǎn)入并穩(wěn)定遺傳、能夠通過調(diào)整合成路徑抑制與生產(chǎn)無關(guān)的合成途徑等[9,11-13]。此外,微藻還具有生長速率快,環(huán)境適應能力強,能夠直接利用廢水和工業(yè)煙氣等工農(nóng)業(yè)廢棄物,能夠在沿海灘涂、鹽堿地等地培養(yǎng)從而不與農(nóng)作物爭地等諸多工程學優(yōu)勢,是一種經(jīng)濟可行、環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展的生物固碳技術(shù)[10,14-15]。

    當前,能源和大宗化工產(chǎn)品的生產(chǎn)制造主要依賴于石化煉制,面臨著生產(chǎn)安全風險高、環(huán)保壓力大、油氣資源供需矛盾等挑戰(zhàn)。大力發(fā)展基于微藻高效轉(zhuǎn)化CO2生產(chǎn)有機物的生物制造產(chǎn)業(yè),有望解決當前面臨的能源危機和化工產(chǎn)品不可持續(xù)生產(chǎn)的問題,同時達到緩解溫室效應的效果。近年來,微藻作為細胞工廠高效轉(zhuǎn)化CO2生產(chǎn)有機物得到越來越多的關(guān)注。本文將對平臺化合物、生物能源、高附加值化合物3類產(chǎn)品的合成生物學及生物制造的研究進展與技術(shù)進步進行總結(jié)與分析,同時展望其對雙碳背景下合成生物學發(fā)展帶來的契機以及光驅(qū)動有機物生產(chǎn)的前景。

    1 平臺化合物

    平臺化合物是指可作為生產(chǎn)精細和特殊功能化學產(chǎn)品的單體物質(zhì),如丙二醇、異戊二烯、3-羥基丙氨酸等。據(jù)估計,全球每年以石油、煤炭和天然氣為基礎原料生產(chǎn)的平臺化合物約3.3億噸[16]。由于化學合成平臺化合物的方法存在能耗高、步驟繁多以及使用有毒催化劑等問題,再加上石化資源日益減少,人們開始更多關(guān)注可再生的生物合成路徑。2004年,美國能源部(DOE)確定了12種可從生物質(zhì)中獲得的化學單體物質(zhì)作為潛在的平臺化合物[17]。隨著生物合成技術(shù)的成熟,生物基平臺化合物市場在2021—2031年間的復合年增長率預計將達到8%,市場銷售額預計將達到230億美元[18]。微藻可以利用太陽能,在自養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化CO2合成某些平臺化合物,是生物基平臺化合物的重要來源。

    1.1 丙二醇

    丙二醇是生產(chǎn)不飽和聚酯、環(huán)氧樹脂、聚氨酯樹脂等化學品的重要原料,是一類C3平臺化合物,在食品、醫(yī)藥和美妝等領(lǐng)域應用廣泛[19-21]。目前,制備丙二醇的方法主要是催化轉(zhuǎn)化石油行業(yè)衍生物,與化學催化法相比,生物法具有條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點[22]。利用光合作用,藍藻可以直接轉(zhuǎn)化太陽能和CO2合成所需的化合物,同時借助合成生物學技術(shù),對藍藻的合成途徑進行改造,可以實現(xiàn)CO2到丙二醇的合成。Hirokawa等[23]在S.elongatusPCC7942中導入甘油合成及轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-丙二醇的相關(guān)酶,實現(xiàn)了從CO2到1,3-丙二醇的光合生產(chǎn)全過程,結(jié)合培養(yǎng)條件優(yōu)化,經(jīng)過14天1,3-丙二醇的滴度達到288 mg/L。應用化學計量代謝模型預測與計算機模擬等合成生物學技術(shù)策略,該團隊[24-25]對1,3-丙二醇合成途徑進一步改造,篩選獲得的菌株合成1,3-丙二醇的滴度達到了1220 mg/L。為了解決合成途徑中關(guān)鍵作用酶甘油脫水酶的氧敏感不相容的問題,Liu等[26]提出藍藻異形胞自然分化的空間隔離策略,選用兼性厭氧菌(Klebsiella pneumoniae)和嚴格厭氧菌(Clostridium butyricum)基因來源的1,3-丙二醇生產(chǎn)基因與啟動子串聯(lián)排列,組裝成1,3-丙二醇光合生產(chǎn)模塊,通過同源重組整合到魚腥藻PCC7120菌株中,產(chǎn)量提高了1.7倍。

    Li等[27]報道了將甲基乙二醛合酶、甘油脫氫酶和乙醛還原酶導入藍藻S.elongatusPCC7942中以實現(xiàn)1,2-丙二醇生產(chǎn),同時將1,2-丙二醇的合成途徑設計為依賴于NADPH的途徑,減少中間產(chǎn)物羥基丙酮的積累,提高1,2-丙二醇的產(chǎn)量至150 mg/L。研究發(fā)現(xiàn),1,2-丙二醇中約1/4的碳來源于糖原,其余的碳來源于卡爾文循環(huán)中的CO2,David等[28]將mgsA、yqhD、adh導入Synechocystissp.PCC6803以實現(xiàn)1,2-丙二醇的生產(chǎn),通過培養(yǎng)條件優(yōu)化1,2-丙二醇的含量在細胞穩(wěn)定期可達到1 g/L。

    1.2 異戊二烯

    異戊二烯是生產(chǎn)橡膠和膠黏劑的關(guān)鍵中間體,也是化學工業(yè)中常用的單體物質(zhì)。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是從原油冶煉中獲得。2013年Matos等[29]模擬10 t級生產(chǎn)規(guī)模對比了光合自養(yǎng)微藻和發(fā)酵異養(yǎng)細菌兩種可再生的異戊二烯生產(chǎn)方法,指出光合微藻自養(yǎng)直接轉(zhuǎn)化CO2合成異戊二烯的理論潛力更大。

    Gao等[30]在動態(tài)通量分析和代謝流分析的基礎上,對比了甲基赤蘚糖醇磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途徑與甲基戊酸途徑的碳轉(zhuǎn)化率和前體驅(qū)動力,并最終選擇在藍藻細胞中設計MEP途徑以生產(chǎn)異戊二烯,大幅度提升了異戊二烯產(chǎn)量(1.2 g/L)。此后,從減輕異戊二烯合酶與藻膽蛋白的β亞基融合后表達障礙以及改進反應底物二甲烯丙基焦磷酸等方面入手,Chaves等[31]篩選出了最佳的異戊二烯轉(zhuǎn)化體,進一步提高了異戊二烯的產(chǎn)量,達到了12.3 mg/g。Pade等[32]從工程學角度優(yōu)化了重組工程藍藻的培養(yǎng)條件,發(fā)現(xiàn)低濃度的NaCl有助于異戊二烯產(chǎn)量的提高。

    除丙二醇和異戊二烯外,作為能夠?qū)O2轉(zhuǎn)化為有機物的天然宿主,微藻還可進行烯烴、羧酸以及其他醇類如2,3-丁二醇等平臺化合物的生物學合成(表1)。鑒于太陽能和CO2的可再生特性,設計與構(gòu)建藍藻細胞工廠進行平臺化合物質(zhì)的生產(chǎn)被認為是未來具備巨大應用潛力的一種可持續(xù)生產(chǎn)模式。

    表1 藍藻細胞工廠生產(chǎn)平臺化合物Tab.1 Production of platform compound by cyanobacteria cell factory

    2 生物能源

    生物能源可開發(fā)的種類眾多且來源廣泛,在眾多生產(chǎn)生物能源的原料中,微藻由于光合作用效率高、生長速度快、油脂含量高、不占用耕地、可以利用廢水廢氣培養(yǎng)以及可以全年生產(chǎn)等優(yōu)勢,使其成為第三代生物能源的典型代表[43]。微藻生物能源有多種形式,例如固態(tài)的生物炭,液態(tài)的生物柴油、生物原油、生物乙醇,氣態(tài)的生物氫、生物燃氣、合成氣等[10,44-45]。

    2.1 生物柴油

    微藻細胞合成油脂后,經(jīng)分離萃取、甲酯化等步驟,轉(zhuǎn)化成可市售的生物柴油,其中影響其經(jīng)濟性的關(guān)鍵因素是細胞中油脂的含量[46]。微藻產(chǎn)生的油脂含量因藻種不同而存在差異,但是通過不同的途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,可以改變或提高油脂產(chǎn)量,如調(diào)節(jié)營養(yǎng)元素供給和周圍環(huán)境條件(pH、溫度和光照等)[47-48],引入外源植物激素等。然而,利用上述條件誘導培養(yǎng)是耗時的,有時會導致微藻生物量產(chǎn)量降低,且微藻細胞對誘導條件做出響應的機制還不清楚,怎樣平衡生物量生長與油脂含量積累的協(xié)調(diào)關(guān)系仍是未來需要關(guān)注的方向。

    微藻組學與信號傳導技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)生物合成途徑的解析加強了對藻細胞基因調(diào)控、代謝物變化、蛋白質(zhì)活性和相互作用的理解[49],進而推動了利用合成生物學技術(shù)手段提高微藻油脂生產(chǎn)的研究進程,針對基因元件和代謝途徑的改造優(yōu)化已經(jīng)被用于提高微藻油脂的產(chǎn)量(表2),主要策略是通過上調(diào)或下調(diào)藻細胞中編碼特定酶的基因的表達,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因微藻藻株,促進不同藻種中碳水化合物或油脂的積累?;蚬こ?、代謝工程和合成生物學等方法的介入將促進微藻作為一個更加優(yōu)質(zhì)的生物柴油載體的發(fā)展,并促進生物柴油的工業(yè)化和商業(yè)化。

    表2 基因工程和代謝工程方法用于提高微藻油脂產(chǎn)量Tab.2 Genetic engineering and metabolic engineering methods are used to improve the yield of microalgae lipid

    2.2 生物氫

    微藻細胞產(chǎn)氫技術(shù)主要包括發(fā)酵產(chǎn)氫(光發(fā)酵產(chǎn)氫、暗發(fā)酵產(chǎn)氫和光暗聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)氫)和光合作用產(chǎn)氫(直接生物光解產(chǎn)氫和間接生物光解產(chǎn)氫)[59]。不同培養(yǎng)工藝對氫產(chǎn)量有顯著影響。此外,還有一些工程方法可以提高生物產(chǎn)氫效率,如微藻-細菌耦合生物產(chǎn)氫、添加亞硫酸氫鈉、多藻種混合培養(yǎng)、固定化微藻細胞以提高光照利用率和改進光生物反應器等[60-61]。

    利用合成生物學技術(shù),可以通過有針對性地修改或設計相關(guān)的酶來構(gòu)建工程菌株顯著提高藻細胞中氫的產(chǎn)量和產(chǎn)率(表3)。氧氣能抑制氫化酶基因的表達進而限制氫化酶的活性,改變氫化酶的結(jié)構(gòu)可以增加氫化酶對氧的耐受性,研究人員通過突變特定的氨基酸,改變了氫化酶表面的氣體結(jié)合位點,阻止與氧氣結(jié)合從而保護具有催化功能的活性中心[68]。研究人員還設計了一種復合酶,將氫化酶與具有鐵還原功能的蛋白融合在一起,從而將電子從鐵氧還蛋白轉(zhuǎn)移到氫化酶,提高了生物產(chǎn)氫率[69]。此外,抑制RuBisCO以減弱Calvin-Benson循環(huán)也有利于電子向氫化酶轉(zhuǎn)移。RuBisCO由葉綠體基因編碼的大亞基和細胞核基因編碼的小亞基組成,其大亞基突變體和小亞基突變體的生物氫產(chǎn)率均高于野生株在硫缺乏時的產(chǎn)氫效率[70]。高效率獲取光能是光自養(yǎng)條件下生物產(chǎn)氫的第1步,捕光天線尺寸的減小可以減少高光抑制,提高捕光效率和光能利用率,從而增加生物氫產(chǎn)量,生物氫產(chǎn)率可以達到野生株的4~8倍[71]。

    表3 提高微藻產(chǎn)氫率的多種基因工程方法Tab.3 Various genetic engineering methods for improving hydrogen production rate of microalgae

    如前所述,氧氣能抑制氫化酶活性,如果能隔絕氧氣,氫化酶的活性就能得到維持和增強,進而使生物氫產(chǎn)量增加(圖2)。基于合成生物學技術(shù),我們通過在E.coli中異源表達一系列編碼羧酶體外殼蛋白與外殼結(jié)合蛋白的基因,成功獲得結(jié)構(gòu)完整且穩(wěn)定的羧酶體外殼,同時篩選到可介導外源蛋白定位至羧酶體殼內(nèi)的靶向定位肽[72]。隨后運用該靶向定位肽介導氧氣敏感型[FeFe]氫酶及其電子傳遞相關(guān)蛋白定位至羧酶體殼內(nèi),成功構(gòu)建出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且功能完整的納米級產(chǎn)氫羧酶體,并證實羧酶體殼內(nèi)的低氧微環(huán)境可顯著提升氫酶的催化效率。該研究在提供創(chuàng)新型生物制氫方案的同時,為后續(xù)進一步利用微藻構(gòu)建產(chǎn)氫細胞工廠奠定了研究基礎。

    圖2 微藻產(chǎn)氫體系的構(gòu)建Fig.2 Schematic of structure and working mode of the Shell-HydA nanoreactor(Our study provides innovative bio-hydrogen production strategy and new insights into the shelf-assembly of carboxysome and selective permeability of carboxysome shell as well,and paves the way for engineering carboxysome shell-based nanoreactors to recruit specific enzymes for diverse catalytic reactions)

    盡管針對提高微藻生物產(chǎn)氫效率的研究已經(jīng)有很多,但是目前生物氫生產(chǎn)水平仍不足以工業(yè)化和商業(yè)化。如何將生物學方法和工程學手段相結(jié)合,有效提高微藻生物產(chǎn)氫效率,仍需要進一步探索。

    2.3 生物乙醇

    利用微藻制備生物乙醇的方法有兩種:其一是微藻生物質(zhì)提供高含量的碳水化合物,在釀酒酵母的發(fā)酵作用下產(chǎn)生乙醇;其二是微藻細胞直接生產(chǎn)乙醇。在第一類利用微藻生產(chǎn)乙醇的途徑中,獲取高含量碳水化合物的藻株對制備生物乙醇具有重要意義。由于藻細胞中的碳水化合物是乙醇最直接的轉(zhuǎn)化原料,而碳水化合物的積累通常發(fā)生在對細胞生長不利的環(huán)境下,例如缺氮、缺磷、缺硫等,這一定程度上限制了微藻生物量的積累,不利于提高乙醇產(chǎn)率[73]。相比于微藻合成生物學技術(shù)提高碳水化合物(如淀粉)含量用于乙醇發(fā)酵而言,構(gòu)建微藻細胞直接生產(chǎn)乙醇的代謝途徑,是近年來得到廣泛關(guān)注的生物乙醇生產(chǎn)模式[74]。

    Chochois等[75]采用電轉(zhuǎn)化方法在萊茵衣藻中插入外來基因引起突變,建立了大型的突變文庫,以有效篩選到高淀粉含量的藻株,有利于后續(xù)的乙醇發(fā)酵。相比而言,利用微藻細胞直接合成乙醇更具有開發(fā)價值。但是乙醇并不是微藻的天然代謝產(chǎn)物,構(gòu)建能夠合成乙醇的微藻細胞工廠需要導入外源乙醇合成途徑?,F(xiàn)階段,所有開發(fā)的光合細胞工廠中乙醇合成途徑都基于丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的催化作用[74]。丙酮酸脫羧酶以代謝物丙酮酸為底物,催化脫羧反應生成乙醛,乙醇脫氫酶以NADPH或NADH為輔因子,將乙醛還原為乙醇。以藍藻為底盤藻株開發(fā)合成乙醇的細胞工廠時,普遍使用來自運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis中 的PdcZM-AdhIIZM途徑,該途徑也普遍應用于其他微生物乙醇合成細胞工廠的構(gòu)建[76]。Algenol公司通過在藍藻中替換來自棕櫚發(fā)酵細菌Zymobacter palmae的丙酮酸脫羧酶基因pdcZP(一種比運動發(fā)酵單胞菌來源的pdcZM更高效的丙酮酸脫羧酶),實現(xiàn)了乙醇產(chǎn)量10%~20%的提高,進而將slr1192基因替代adhIIZM基因,并采用銅離子誘導型啟動子PziaA驅(qū)動pdczpslr1192的表達,30 d乙醇產(chǎn)量達到7.1 g/L[77]。美國Joule公司在聚球藻PCC7002中引入1個pdcZM基因和2個不同來源的adh基因構(gòu)建細胞工廠,進而又敲除硫辛酸合成途徑,工程藻株13 d乙醇產(chǎn)量為5.62 g/L[78-79]。

    乙醇是最早以合成生物學方法實現(xiàn)光驅(qū)固碳的生物燃料產(chǎn)品,但是基于微藻底盤合成的相關(guān)技術(shù)距離真正的系統(tǒng)化、規(guī)劃化、產(chǎn)業(yè)化應用仍然有相當長的路途。

    3 高附加值化合物

    高附加值化合物通常是指動物、植物或微生物的次級代謝產(chǎn)物,常被用作化妝品、食品添加劑、藥品以及保健品等,具有較高的經(jīng)濟價值。藻類中高附加值化合物主要包括碳水化合物、生物堿、類胡蘿卜素、萜類以及類固醇激素等[80]。隨著合成生物學的發(fā)展,通過引入外源基因等方法重新設計底盤細胞,將上述種類的高附加值化合物的完整合成途徑在合適的底盤細胞中重組,可顯著提高化合物的合成效率。目前在合成生物學領(lǐng)域,一些模式微藻藻種作為底盤細胞具有生長快、基因組和代謝途徑背景清晰、遺傳操作技術(shù)成熟等優(yōu)勢,已經(jīng)被用來合成多種高附加值化合物。表4梳理了近年來微藻底盤細胞合成高附加值產(chǎn)品的發(fā)展狀況。

    表4 微藻底盤細胞中高附加值化合物的生物合成Tab.4 Biosynthesis of high value-added compounds by microalgae chassis cells

    相對于真核藻類,原核藻類生物合成的相關(guān)技術(shù)較為成熟。目前利用不同的藍藻底盤已成功合成蝦青素、對香豆酸、檸檬烯和葉黃素等(表4)。真核藻的合成生物學研究仍處于探索階段,其中萊茵衣藻的研究及應用較為廣泛,是真核微藻合成生物學和基因工程的模式生物。近年來,有研究利用萊茵衣藻表達VP28蛋白,將表達該外源蛋白的藻喂養(yǎng)蝦可顯著控制蝦的白斑?。?5]。將粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)來源的木酮糖還原酶經(jīng)過密碼子優(yōu)化后轉(zhuǎn)入萊茵衣藻細胞,可以獲得0.38 g/L的木糖醇產(chǎn)量[89],異源表達植物廣藿香(Pogostemon cablin)來源的醇合酶(patchoulol synthase,PTS)能在萊茵衣藻中合成倍半萜[90]。此外,也有報道利用合成生物學技術(shù)改造萊茵衣藻的葉綠體系統(tǒng)直接生產(chǎn)霍亂、瘧疾疫苗和免疫毒素等重組蛋白[96-98]。然而,由于缺乏有效的表達元件、低轉(zhuǎn)基因滴度和比較評估的缺失阻礙了萊茵衣藻作為綠色底盤細胞的進一步發(fā)展。有學者系統(tǒng)評估了萊茵衣藻現(xiàn)有表達元件,并結(jié)合啟動子工程,創(chuàng)建了新的合成表達元件,改進了萊茵衣藻作為合成生物學底盤細胞的應用效果[99]。對于其他真核藻類,不同生物技術(shù)的開發(fā)及利用也越來越豐富。例如,在微擬球藻中導入高活力的外源甘油二酯?;蜣D(zhuǎn)移酶(DGAT),使其定位于葉綠體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,提高了對EPA的活力,減少了EPA在氧化途徑中的降解,使得甘油三酯(TAG)中EPA的比重提高5倍,對于以微擬球藻為原料,開發(fā)高品質(zhì)可食用油脂具有重要意義[93]。海洋微藻三角褐指藻也是真核藻類的模式生物,其胞內(nèi)萜類化合物巖藻黃質(zhì)的合成主要通過1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶途徑實現(xiàn),構(gòu)建編碼該酶基因Dxs的表達質(zhì)粒并整合到三角褐指藻基因組中,得到的Dxs轉(zhuǎn)化體的巖藻黃質(zhì)含量是野生型藻株的2.4倍[94]。此外,在杜氏鹽藻和小球藻中也實現(xiàn)了CRISPR技術(shù)的應用,在纖細裸藻中實現(xiàn)了利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化,在小環(huán)藻中實現(xiàn)了內(nèi)含子介導的基因表達增強,這些技術(shù)的開發(fā)均為未來構(gòu)建改造微藻細胞工廠工業(yè)化生產(chǎn)高附加值化合物奠定了基礎[99-101]。

    不論是真核藻類,還是原核藻類作為底盤細胞合成高附加值化合物或其他生物制品,其合理選擇是生物合成路徑構(gòu)建成功的決定因素之一。微藻細胞作為表達的載體,為目的產(chǎn)物的合成提供了初始零件,決定了生物合成采用的底物和代謝通量,而底物和代謝通量決定了目的產(chǎn)物合成的性質(zhì)與產(chǎn)量。因此,根據(jù)實際生物合成途徑選擇合適的底盤微藻細胞,并對參與代謝過程的酶和調(diào)控因子加以優(yōu)化,將大大提高光驅(qū)固碳方法異源表達生物制品的靶向性。

    4 總結(jié)與展望

    微藻作為底盤細胞,能夠通過光合作用直接轉(zhuǎn)化CO2合成蛋白、核酸等生物大分子以及其他各種次級代謝產(chǎn)物,進而通過合成生物學技術(shù)對各種合成途徑進行改造與優(yōu)化,可進一步有目的地生產(chǎn)各種藻源和非藻源的生物制品。相對于異養(yǎng)底盤細胞,微藻光合成生物學的發(fā)展、應用和推廣在完成生物制造的同時還起到固碳減排的效果,因此引起了科研界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。為了有效開發(fā)利用微藻資源,推動微藻合成生物學服務于人類生產(chǎn)、生活,需要從上游細胞工廠構(gòu)建到下游微藻培養(yǎng)工程等多個環(huán)節(jié)逐一梳理存在的關(guān)鍵問題,并有針對性地推動問題的解決。

    首先,構(gòu)建高版本無痕工業(yè)化微藻細胞工廠的前提是精準高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系以及針對微藻基因與基因組的編輯技術(shù)體系的系統(tǒng)建立。建立精準高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系需要通過嘗試不同的轉(zhuǎn)化方法,優(yōu)化培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)化條件,并篩選合適的表達載體和啟動子[102]。此外,如何提高基因編輯技術(shù)的準確率、降低脫靶效應和提高轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性是進行微藻遺傳改造的前提。采用多輪基因編輯方法構(gòu)建特定功能的藻株時,無痕化編輯手段和大片段基因切除技術(shù)也是需要重點關(guān)注的方向。

    其次,代謝流的深刻理解與調(diào)控是高效合成目標產(chǎn)物的基礎。具體地,基于某種目標產(chǎn)物在藻細胞中的代謝途徑,通過關(guān)鍵酶基因或轉(zhuǎn)錄子的控制,改變細胞原有代謝路徑,將光合碳輸出有效分配于指定代謝途徑,從而高效地進行目標蛋白質(zhì)或碳水化合物或脂質(zhì)等物質(zhì)的生物合成。這其中,對生物合成和分解的前體物質(zhì)、關(guān)鍵調(diào)控酶、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物代謝網(wǎng)絡的清晰認識,是建立以微藻為底盤細胞高效合成產(chǎn)品的核心。

    再次,微藻細胞的生物量積累和目標物質(zhì)的產(chǎn)率決定了生產(chǎn)工藝的可行性。造成微藻細胞生物量偏低的原因有很多,包括反應器、光照以及溫度等,而最終生產(chǎn)工藝的效率是以細胞生物量和目標產(chǎn)物的滴度共同衡量的。因此,通過技術(shù)手段對微藻代謝的單個或多個基因進行調(diào)控以提高目標產(chǎn)物的積累往往具有偶然性和較差的魯棒性,這是因為細胞中各種生物質(zhì)的代謝過程具有協(xié)同和競爭的關(guān)系,只有認識微藻生物質(zhì)代謝的路徑、提高微藻生長和產(chǎn)能效率、增強細胞在不利條件下存活能力等方可讓工程化微藻細胞工廠從實驗室走向大規(guī)模生產(chǎn)。

    最后,光合效率的提高是促進微藻合成生物學發(fā)展的根本問題。微藻的光能轉(zhuǎn)化效率最高可達8%~10%,而在實際培養(yǎng)過程中僅為1%~2%[103]。對構(gòu)建微藻細胞工廠而言,設計、組裝并優(yōu)化適配高光效的光合作用功能模塊,有助于解決實際培養(yǎng)中光合效率偏低的問題。此外,通過優(yōu)化反應器結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)過程控制,也可以在一定程度上提高微藻光能轉(zhuǎn)化效率,增加目標產(chǎn)物的產(chǎn)率。例如,在跑道池中增加擾動,可以提高微藻培養(yǎng)液的混合強度,提高光暗循環(huán)頻率,減少光抑制;通過在線監(jiān)測和連續(xù)培養(yǎng)技術(shù),維持營養(yǎng)鹽濃度及藻液濃度相對恒定,可以有效提高微藻光能轉(zhuǎn)化效率,進而提高生物量產(chǎn)率。

    綜上所述,光合作用是地球上幾乎一切生命活動的能量和物質(zhì)來源,而微藻通過光合作用貢獻了超過50%的地球氧氣和初級生產(chǎn)力。采用現(xiàn)代合成生物學技術(shù),對微藻底盤細胞進行理性設計與系統(tǒng)改造,以提高微藻光合作用及其驅(qū)動的物質(zhì)能量代謝效率,最終獲得可生物合成的重要代謝產(chǎn)物的工業(yè)化微藻細胞工廠,服務于未來工程化應用,具有重大意義。

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