“雙碳”背景下聚球藻底盤研究的挑戰(zhàn)與機(jī)遇

陶飛，孫韜，王鈺，魏婷，倪俊，許平

（1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2天津大學(xué)生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072；3中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308；4中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055）

當(dāng)前，極端天氣的出現(xiàn)日益頻繁，氣候變化已經(jīng)從科學(xué)觀測(cè)和理論的層面變成了人們可以切身感受的事實(shí)［1］。造成氣候變化主因的碳排放因此受到了越來(lái)越多的關(guān)注，各國(guó)紛紛制定了自己的減排目標(biāo)。在此背景下，我國(guó)提出了自己的減少碳排放的目標(biāo)，計(jì)劃在2030年左右實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”，在2060年左右實(shí)現(xiàn)“碳中和”［2-3］。實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)需要著重在4個(gè)方面努力；其一是能源生產(chǎn)的脫碳，這個(gè)是指清潔能源的替代，用非化石資源的新能源替代傳統(tǒng)能源；其二是能源消費(fèi)的脫碳，主要是指各領(lǐng)域的電能替代，構(gòu)建以清潔電力為基礎(chǔ)的產(chǎn)業(yè)體系和生產(chǎn)生活方式，擺脫煤、油、氣依賴；其三是非能利用領(lǐng)域的碳減排，是指?jìng)鹘y(tǒng)產(chǎn)業(yè)向低耗能、低排放、高附加值方向加快轉(zhuǎn)型，大幅減少工業(yè)過程中產(chǎn)生的碳排放；其四是自然碳匯和碳捕集，由于受資源、技術(shù)、經(jīng)濟(jì)性等因素影響，到2055年左右，我國(guó)能源生產(chǎn)、消費(fèi)以及工業(yè)非能利用領(lǐng)域還有約14億噸碳排放，需要通過自然碳匯、碳捕集等措施予以解決［4-5］。

藍(lán)細(xì)菌是一種原核的光合微生物，能夠以陽(yáng)光作為能源，以CO2為碳源自養(yǎng)生長(zhǎng)，在自然界中廣泛分布，種類繁多，承載著地球上重要的初級(jí)生產(chǎn)力，在地球碳循環(huán)、地球氧化型大氣的形成等方面起到不可替代的作用［6-7］。它在多個(gè)基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)領(lǐng)域扮演了十分重要的角色，在當(dāng)前快速發(fā)展的合成生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成為第3類最重要 的 微 生 物 底 盤［8］。例 如，魚 腥 藻7120（Anabaenasp.PCC 7120）是研究生物固氮和細(xì)胞分化的模式生物［9-10］；聚球藻和集胞藻經(jīng)常被用于研究光合作用的機(jī)制［11］；淡水聚球藻7942（Synechococcus elongatusPCC 7942）和海水聚球藻7002（Synechococcussp.PCC 7002）等已經(jīng)作為宿主進(jìn)行能源和精細(xì)化合物生產(chǎn)［8，12］；淡水集胞藻6803（Synechocystissp.PCC 6803）用于PHB（聚-β-羥丁酸）等多種化合物的合成［13］。目前使用藍(lán)細(xì)菌作為宿主已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了數(shù)十種化合物的合成，其中能源類化合物如乙醇、丁醇、烷烴、脂肪酸、蔗糖、石竹烯等，大宗化學(xué)品如乳酸、甘油等，精細(xì)化學(xué)品如苯丙烷類化合物等，另外還有淀粉、胞外多糖、蛋白質(zhì)等聚合物［14-15］。

經(jīng)過多年的研究，用藍(lán)細(xì)菌作為底盤構(gòu)建光驅(qū)動(dòng)細(xì)胞工廠，直接轉(zhuǎn)化CO2生產(chǎn)化合物潛能已得到廣泛的認(rèn)可。尤其是聚球藻，由于具備良好的性能和可操作性，已經(jīng)成為藍(lán)細(xì)菌合成生物學(xué)領(lǐng)域的熱門底盤［8，16］。隨著研究的深入，以藍(lán)細(xì)菌為底盤的光驅(qū)動(dòng)合成所面臨的問題也逐漸浮現(xiàn)，這其中最為重要的是效率問題和抗逆問題。首先，相較于異養(yǎng)生物，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度都比較低，以乳酸生產(chǎn)為例，以葡萄糖為碳源的細(xì)菌可以在幾十個(gè)小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)高達(dá)200 g/L的乳酸［17］，而藍(lán)細(xì)菌在2周的生產(chǎn)周期內(nèi)只能生產(chǎn)不到2 g/L的乳酸［18］。這是藍(lán)細(xì)菌合成生物學(xué)一直以來(lái)被人們廣泛詬病的原因，即使考慮到藍(lán)細(xì)菌的培養(yǎng)基成本和碳源成本的優(yōu)勢(shì)，這樣的生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)物濃度仍然是一個(gè)嚴(yán)重的制約因素。另外一個(gè)問題是在藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)業(yè)化中所面臨的污染問題。藍(lán)細(xì)菌的大規(guī)模培養(yǎng)需要用陽(yáng)光作為能源，戶外培養(yǎng)或者特殊的大規(guī)模光反應(yīng)器是一個(gè)必然選擇，再加上培養(yǎng)周期長(zhǎng)，外源雜菌的污染就成為了極大的問題，容易造成培養(yǎng)的失?。?9］。鑒于以上問題，以藍(lán)細(xì)菌作為底盤的生物技術(shù)前景如何，究竟是否值得大力投入研究，一直是被業(yè)界所爭(zhēng)論的話題。尤其是在當(dāng)前“碳達(dá)峰”“碳中和”的“雙碳”政策大背景下，發(fā)展新興的生物技術(shù)已經(jīng)成為了迫切的需求，各種新的低碳生物技術(shù)都方興未艾，可以說(shuō)藍(lán)細(xì)菌生物技術(shù)的發(fā)展又到了一個(gè)新的十字路口［14，20］?；诖?，本文就上述問題展開綜述和討論，以期把上述相關(guān)內(nèi)容梳理出基本脈絡(luò)。

1 光驅(qū)動(dòng)細(xì)胞工廠的理性與愿景

1.1 光合作用是自然選擇的有機(jī)物生產(chǎn)方式

放眼我們所處的宇宙，不難發(fā)現(xiàn)宇宙中能量十分富足但有機(jī)物極其稀缺。宇宙中從質(zhì)量到能量的轉(zhuǎn)化時(shí)時(shí)刻刻都在大規(guī)模地發(fā)生，每個(gè)恒星都可以持續(xù)不斷通過發(fā)光發(fā)熱的方式向外釋放能量，這種基于熱核反應(yīng)的能量也是人類理想的終極能源［21］。相比于物理意義上的能源，有機(jī)物在宇宙中雖然普遍存在，但卻十分稀少，主要是由非生物的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生［22］。人類的一切活動(dòng)都離不開化合物的生產(chǎn)，特別是有機(jī)物的生產(chǎn)，比如食品、纖維、塑料、燃料等，這是由我們的生物本質(zhì)所決定的［23］。如果暫時(shí)拋開當(dāng)下能源挑戰(zhàn)，從人類的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，不難預(yù)見，當(dāng)人類依賴熱核反應(yīng)或者其他方式真正實(shí)現(xiàn)能源自由的那一天到來(lái)時(shí)，物質(zhì)資料的生產(chǎn)，特別是有機(jī)物的生產(chǎn)，仍然會(huì)是人類活動(dòng)的重要方面，甚至于將是僅存的恒久話題。

地球的獨(dú)特性之一在于存在生命可以利用光能生產(chǎn)有機(jī)物，這就是光合作用，它是目前所知利用光能生產(chǎn)有機(jī)物的主要天然實(shí)現(xiàn)方式，也是自然界存在的利用天然能源合成有機(jī)物的最高效的方式［22］。雖然除了光合作用還存在很多的光化學(xué)反應(yīng)、電化學(xué)反應(yīng)等可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單有機(jī)物的合成，但是相比于光合作用，它們的規(guī)模和效率都微不足道［22］。光合作用的誕生對(duì)于地球來(lái)說(shuō)是革命性的，它為地球上豐富有機(jī)物的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，也根本上改變了地球的氧化還原環(huán)境［7］。從這個(gè)意義上說(shuō)，光合作用是被自然界選擇了的利用光能合成有機(jī)物的催化方式，這種方式對(duì)于地球的物理環(huán)境來(lái)說(shuō)具有其優(yōu)越性。當(dāng)然，并不是說(shuō)這種方式是不能超越的，只是說(shuō)在當(dāng)前的約束條件下它具有最大的合理性。事實(shí)上，當(dāng)前的合成生物學(xué)就是期望通過人工的方式對(duì)自然進(jìn)化予以超越［8，24-25］。我們不能否認(rèn)未來(lái)可能存在比光合作用更有效率、更適合的利用能量合成有機(jī)物的方式，但僅就目前而言，光合作用系統(tǒng)仍然是人類最可及的體系。以這個(gè)天然的系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行改造和提升仍然最符合理性。

需要注意到，人類目前所能利用的主要能量來(lái)源從根本上說(shuō)都是太陽(yáng)能。生物質(zhì)是通過植物的光合作用形成的有機(jī)物，可以看作是以生物質(zhì)形式儲(chǔ)存的太陽(yáng)能；化石資源是遠(yuǎn)古生物光合作用形成的有機(jī)碳埋藏到地下形成的，根本上也是太陽(yáng)能［22］。當(dāng)我們以化合物作為最終的目標(biāo)產(chǎn)品時(shí)，不難看出，所有的生產(chǎn)方式從根本上都是利用能量合成有機(jī)物的實(shí)現(xiàn)（圖1）。顯而易見，在能量利用的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)損失一定的能量，因?yàn)闆]有哪個(gè)能量轉(zhuǎn)化步驟的效率是100%。因此，在能量使用中，更少的步驟往往意味著更高的效率。因此可以推斷，在利用太陽(yáng)能來(lái)合成有機(jī)物的過程中，直接用藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)動(dòng)的方式由于需要的步驟最少，在能量總體利用效率方面具有潛在的巨大優(yōu)勢(shì)，即使當(dāng)前這個(gè)優(yōu)勢(shì)還未充分得到體現(xiàn)。另外還需要意識(shí)到，盡管太陽(yáng)輸出到地球的能量總量很大，但是受到氣候條件等因素限制，真正可以被使用的太陽(yáng)能是有限的［26］，對(duì)有限的太陽(yáng)能的利用來(lái)說(shuō)，總體效率的考量十分重要。

圖1 利用太陽(yáng)能合成有機(jī)化合物的幾種不同路徑Fig.1 Different ways for producing chemicals from solar energy

1.2 藍(lán)細(xì)菌與土地氣候的依賴

技術(shù)的實(shí)施依賴于一定的土地和氣候條件，新的能源技術(shù)和綠色生產(chǎn)技術(shù)的實(shí)施也不例外，必須考量的因素就是土地和氣候條件對(duì)能源開發(fā)利用的影響。事實(shí)上，這種影響已經(jīng)造成新能源利用的一些困境，比如風(fēng)電和光伏發(fā)電，受到氣候的影響大，穩(wěn)定性差，并入電網(wǎng)的比例不能超過15%［27-28］。物質(zhì)資料的生產(chǎn)更是如此，例如糧食生產(chǎn)以及生物煉制所需的各種生物質(zhì)資源的生產(chǎn)，都受到土地和氣候條件的制約。開發(fā)新的技術(shù)擺脫這種制約才能利用有限的能源，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)資料生產(chǎn)效率的最大化。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中這一理念已經(jīng)得到了實(shí)踐證實(shí)，比如發(fā)展海水稻、旱地稻可以讓糧食的生產(chǎn)一定程度上減少對(duì)淡水的依賴［29-30］。需要注意的是，大型藻類及植物和藍(lán)細(xì)菌一樣可以進(jìn)行光合作用，對(duì)它們來(lái)說(shuō)，“雙碳”背景同樣也為其合成生物學(xué)發(fā)展提供了寶貴的機(jī)遇。但是，相比較而言，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠擺脫時(shí)空依賴方面可以說(shuō)具有與生俱來(lái)的優(yōu)勢(shì)。首先，藍(lán)細(xì)菌是微生物，可以使用反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)，不受濕度、溫度、鹽度等地理氣候因素限制，規(guī)?？梢匀我夥糯螅嗤耐恋孛娣e上還可以使用立體培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)光能利用的最大化［31］。其次，藍(lán)細(xì)菌本身具有生物多樣性，能夠適應(yīng)不同的棲息地，這種具備不同適應(yīng)性的藍(lán)細(xì)菌可以用于開發(fā)適合不同條件的細(xì)胞工廠［32］。再次，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞本身具有晝夜周期律，這與天然的晝夜規(guī)律、太陽(yáng)能的釋放規(guī)律吻合。藍(lán)細(xì)菌相較于植物和大型藻也具有更高的效率［33］?？傊?，用藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠來(lái)進(jìn)行物質(zhì)的生產(chǎn)，有利于最大程度地?cái)[脫對(duì)氣候和土地的依賴，從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)生產(chǎn)效率的最大化。

1.3 藍(lán)細(xì)菌生物技術(shù)在“碳中和”中的應(yīng)用潛力

1.3.1 能源生產(chǎn)

在我國(guó)的“碳達(dá)峰”和“碳中和”路線中，要實(shí)現(xiàn)的是能源消費(fèi)的電能化，也就是說(shuō)能源產(chǎn)品的最終形式都要盡可能逐漸歸一到電能上去，然后把電能提供給終端的能源使用者［4］。Sawa等［34］利用打印的方法把藍(lán)細(xì)菌鋪在碳納米管表面制作了生物太陽(yáng)能板，可以在光照下實(shí)現(xiàn)連續(xù)產(chǎn)電，這證明了利用藍(lán)細(xì)菌實(shí)現(xiàn)發(fā)電的可能性。這種方法目前看來(lái)還只能為低功耗的場(chǎng)景提供電能，用途有限，但是產(chǎn)電的相關(guān)機(jī)制值得深入研究，尤其是合成生物學(xué)、材料科學(xué)、界面科學(xué)相關(guān)的技術(shù)加持，產(chǎn)電效率將會(huì)進(jìn)一步提高，這種活的光伏發(fā)電裝置，對(duì)于解決光伏發(fā)電中的太陽(yáng)能板污染的相關(guān)問題或許是一種新的選擇［35］。

在電能消費(fèi)領(lǐng)域，電池能量密度是一個(gè)重要的問題，以實(shí)驗(yàn)室性能較好的鋰電池為例，能量密度為600 W·h/kg［36］，而汽油的能量密度可達(dá)12889 W·h/kg。因而對(duì)于能量需求大的應(yīng)用場(chǎng)景，現(xiàn)有技術(shù)條件下實(shí)現(xiàn)電能替代比較困難，例如飛機(jī)、大功率的工程機(jī)械和裝甲車等。在這些場(chǎng)合中使用液體燃料仍然是相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期的合理選擇。在這種應(yīng)用場(chǎng)景下要替換化石燃料，使用生物煉制來(lái)源的可再生液體燃料將是出路之一。以藍(lán)細(xì)菌作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)能源化合物已經(jīng)發(fā)展多年，現(xiàn)在能夠生產(chǎn)乙醇、氫氣等多種能源化合物［12，37］。藍(lán)細(xì)菌可以一步把太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為高能量密度的化合物，在太陽(yáng)能的整體利用效率上比傳統(tǒng)基于生物質(zhì)的生物煉制具有優(yōu)勢(shì)，從這個(gè)意義上說(shuō)，藍(lán)細(xì)菌底盤可以在此方面有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在新能源中風(fēng)能和光伏發(fā)電從能源的豐富程度和技術(shù)成熟度上都接近實(shí)用化。尤其是對(duì)于我國(guó)來(lái)說(shuō)，西部地區(qū)蘊(yùn)藏的風(fēng)能和光能資源是我國(guó)實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的最大底氣［2，4］。但是太陽(yáng)能和風(fēng)能發(fā)電、受到氣候條件的強(qiáng)烈干擾，極不穩(wěn)定，并入電網(wǎng)困難，素有“垃圾電”的稱謂。高效、大容量、低成本的電能儲(chǔ)存技術(shù)是解決這個(gè)問題的關(guān)鍵［27-28］?，F(xiàn)在的電能儲(chǔ)存方法主要是電池、超級(jí)電容器、壓縮空氣、抽水法等，這些方法都面臨能量密度低的問題，難以滿足大規(guī)模儲(chǔ)能的要求［28］。如果能夠把基于藍(lán)細(xì)菌的液體燃料生產(chǎn)和光伏發(fā)電結(jié)合起來(lái)，在太陽(yáng)能盈余的時(shí)候用太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠合成化合物對(duì)太陽(yáng)能儲(chǔ)存，在太陽(yáng)能不足的時(shí)候用儲(chǔ)存的化合物來(lái)發(fā)電，就可以解決太陽(yáng)能發(fā)電的波動(dòng)性問題，這將是一個(gè)值得研究的潛在方案。

1.3.2 非能源化合物制造

在碳排放的構(gòu)成中，除了能源生產(chǎn)之外還有很大一部分來(lái)源于工業(yè)生產(chǎn)過程。目前，我國(guó)每年工業(yè)過程產(chǎn)生的碳排放大約為10億噸左右［3-4］。針對(duì)工業(yè)過程的碳排放，可以從兩個(gè)方面入手：一方面用生物煉制來(lái)源的還原劑替代化石來(lái)源的還原劑，比如在制煉鋼中使用生物煉制的氫氣作為還原劑；另一方面可以利用合成生物學(xué)開發(fā)新型的綠色制造工藝和技術(shù)。生物催化的最大特點(diǎn)就是高選擇性，常溫常壓，碳原子經(jīng)濟(jì)性高，發(fā)展生物催化來(lái)替代原有的化學(xué)催化將幫助多個(gè)領(lǐng)域的減排［38］。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠作為一種綠色生產(chǎn)方式，在很多領(lǐng)域具有替換傳統(tǒng)方式的潛能。首先，藍(lán)細(xì)菌可以用來(lái)生產(chǎn)大宗非能源化合物。例如塑料等聚合物，用量巨大，是最重要的大宗化學(xué)品之一。利用藍(lán)細(xì)菌已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)多種聚合物單體的合成，比如乙烯、1，3-丙二醇、異戊二烯、乳酸、2，3-丁二醇等［14，18，39-41］。有些藍(lán)細(xì)菌菌株可以直接在胞內(nèi)積累天然的聚合物，比如集胞藻6803可以在胞內(nèi)積累PHB顆粒，這是一種天然的可降解塑料，其最高產(chǎn)量現(xiàn)已達(dá)到81%的細(xì)胞干重［13］。其次，藍(lán)細(xì)菌可以用于合成重要的精細(xì)化學(xué)品，這主要包括植物天然產(chǎn)物、藍(lán)細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物、醫(yī)藥中間體等［42-43］。藍(lán)細(xì)菌在食品領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用，可以用于合成蛋白質(zhì)、多糖、功能糖等［44］。

1.3.3 碳捕集和碳匯增強(qiáng)

在實(shí)現(xiàn)對(duì)化石碳資源使用的大幅度削減之后，最終還會(huì)有一部分碳排放無(wú)法避免，要解決這部分碳排放問題就需要進(jìn)行減碳，主要是通過碳捕集和自然碳匯強(qiáng)化［4］。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞可以直接把氣體的CO2固定生成生物質(zhì)或生物基產(chǎn)品，能夠直接一步實(shí)現(xiàn)碳的捕集和固定，并且和特定的化合物生產(chǎn)偶聯(lián)［45］。具體使用上，可以利用藍(lán)細(xì)菌在兩種場(chǎng)景下開展碳捕集。其一，可以在接近碳排放的地點(diǎn)建立藍(lán)細(xì)菌大規(guī)模培養(yǎng)工廠，直接進(jìn)行高濃度CO2的吸收固定，把CO2資源化。例如可以在大型的鋼鐵廠建立藍(lán)細(xì)菌的反應(yīng)器，直接利用工廠排放的高濃度CO2，把碳排放和碳捕集偶聯(lián)起來(lái)，實(shí)現(xiàn)碳的零排放。另外還可以在日光充足的西部地區(qū)建立藍(lán)細(xì)菌反應(yīng)裝置，從空氣中直接捕集CO2合成生物質(zhì)或者特定化合物，直接把富余的太陽(yáng)能用于CO2固定。

在實(shí)現(xiàn)能源生產(chǎn)和大宗化學(xué)品生產(chǎn)的同時(shí)，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠還可實(shí)現(xiàn)碳捕捉和碳匯強(qiáng)化［46］。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)的能源類產(chǎn)品會(huì)經(jīng)過燃燒重新排放碳，細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)過煉制之后可以用作飼料等，最終也會(huì)經(jīng)過動(dòng)物消化等重新形成排放。但是，非能源的產(chǎn)品比如大宗材料單體等，則會(huì)以固定的碳形式存在，從大氣中消除［46-47］。藍(lán)細(xì)菌在自然界中是形成自然碳匯的重要驅(qū)動(dòng)力，也可以通過對(duì)藍(lán)細(xì)菌的干預(yù)增強(qiáng)，提升土壤水體的碳匯形成能力。比如在土壤中接種藍(lán)細(xì)菌可以提高旱地土壤的碳匯形成能力［48］。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞在環(huán)境治理中也有廣泛的應(yīng)用，污染處理過程中也可以形成碳匯，有報(bào)道稱可以在污染治理的同時(shí)實(shí)現(xiàn)能源生產(chǎn)和CO2捕集［49］。

2 聚球藻的代謝潛能

2.1 生長(zhǎng)速度潛能

生長(zhǎng)速度是影響細(xì)胞工廠性能的關(guān)鍵因素之一［50］。相比于真核生物，原核生物作為底盤的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)即在于其生長(zhǎng)速度。以大腸桿菌和酵母菌的對(duì)比為例，一般認(rèn)為大腸桿菌的倍增時(shí)間約為20 min，酵母的倍增時(shí)間約為90 min［51-52］。這種復(fù)制速率差異的原因是系統(tǒng)性的，和細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜度、基因組大小、DNA復(fù)制方式、細(xì)胞周期、胞內(nèi)空間分布等都有密切的關(guān)系。以大腸桿菌DNA復(fù)制方式為例，它的DNA復(fù)制是一種連續(xù)的形成嵌套的復(fù)制結(jié)構(gòu)，這和真核生物的DNA復(fù)制精確地控制在特定時(shí)期內(nèi)有根本的不同［53-54］。顯而易見這種系統(tǒng)原因所造成的速度差異，通過有限的遺傳操作很難逾越，至少以現(xiàn)在對(duì)微生物細(xì)胞的認(rèn)識(shí)水平和技術(shù)手段來(lái)說(shuō)，難以在有意義的時(shí)長(zhǎng)內(nèi)予以實(shí)現(xiàn)。藍(lán)細(xì)菌作為原核生物的一種，同樣擁有原核生物的復(fù)制機(jī)制，現(xiàn)在報(bào)道的藍(lán)細(xì)菌（聚球藻）最快的倍增時(shí)間為1.5 h［55-57］，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到一般異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度。因此僅從生長(zhǎng)速度方面來(lái)說(shuō)，藍(lán)細(xì)菌特別是聚球藻在生長(zhǎng)速率方面還有巨大的潛能有待挖掘。也正是從這個(gè)意義上說(shuō)，相比于真核微藻，藍(lán)細(xì)菌在生長(zhǎng)速度方面擁有更大的可挖掘潛力。

關(guān)于藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的限制因素已有一些很有意義的研究。Jahn等［58］通過藍(lán)細(xì)菌的鳥槍蛋白質(zhì)組研究了模式藍(lán)細(xì)菌對(duì)光合碳源限制的適應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠按照生長(zhǎng)優(yōu)化的策略重組蛋白質(zhì)組，但卻會(huì)偏離這一策略保持蛋白質(zhì)儲(chǔ)備以應(yīng)對(duì)可能的環(huán)境改變，他們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度主要受到光合碳源的限制。Burnap［50］針對(duì)藍(lán)細(xì)菌基于蛋白質(zhì)組約束建立了自養(yǎng)生物優(yōu)化生長(zhǎng)模型，可為自養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)研究提供理論工具。值得注意的是最近的一些關(guān)于快速生長(zhǎng)和大生物量藍(lán)細(xì)菌的研究，已經(jīng)初步揭示了聚球藻所蘊(yùn)含的巨大生長(zhǎng)潛能。比如新發(fā)現(xiàn)的聚球藻2973倍增時(shí)間可達(dá)1.5 h［57］，聚球藻11901倍增時(shí)間為2 h，生物量可達(dá)33 g/L，這種速度已經(jīng)非常接近酵母菌的速度，生物量甚至于不弱于異養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)菌［55-56］。這些研究清楚地表明了藍(lán)細(xì)菌，尤其是聚球藻在生長(zhǎng)方面的巨大潛能。一方面，這些新發(fā)現(xiàn)的菌株可以用于生長(zhǎng)速度決定機(jī)制的機(jī)理研究，為進(jìn)一步挖掘藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)潛能提供基礎(chǔ)。另一方面，這些菌株可以直接作為底盤，建立合成生物學(xué)平臺(tái)，并最終發(fā)展成高效的光驅(qū)動(dòng)細(xì)胞工廠。

2.2 光能利用

太陽(yáng)的輻射能量散布在不同的波段，藍(lán)細(xì)菌和其他的藻類僅能利用部分波段，主要是紅光和藍(lán)光波段。據(jù)測(cè)算，藍(lán)細(xì)菌僅能利用陽(yáng)光能量的3%～9%，相較于太陽(yáng)能電池接近50%的光能利用率，這個(gè)利用率較低［59］。提高光能利用效率的重要手段之一是拓寬藍(lán)細(xì)菌的可利用光譜，這也是藍(lán)細(xì)菌研究的熱點(diǎn)之一。拓寬光譜主要有3個(gè)思路：①尋找不同光譜利用的元件進(jìn)行整合，比如葉綠素F可以幫助實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)紅外波段的利用［60］；②利用納米和生物的結(jié)合，利用納米材料的光電效應(yīng)，在藍(lán)細(xì)菌表面實(shí)現(xiàn)波譜轉(zhuǎn)化或者光電轉(zhuǎn)化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生物利用［61-62］；③利用太陽(yáng)能電池板和LED的高效率，通過光-電-光的轉(zhuǎn)化，把不同波段的太陽(yáng)能變成藍(lán)細(xì)菌可高效利用的650 nm波段，實(shí)現(xiàn)太陽(yáng)能的高效利用［63］。光譜拓寬的研究隱含著一個(gè)重要的問題，那就是“在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中藍(lán)細(xì)菌為什么沒有進(jìn)化出利用所有光譜的利用能力”。到底是藍(lán)細(xì)菌的碳基生命的本質(zhì)的限制，還是地球有限波動(dòng)的物理?xiàng)l件沒有提供足夠的進(jìn)化機(jī)會(huì)？這個(gè)問題目前為止還未得到解決。但無(wú)論如何可以肯定的是，我們離真正的藍(lán)細(xì)菌光能利用效率的邊界還有很長(zhǎng)的距離。這一點(diǎn)無(wú)論是從藍(lán)細(xì)菌的多樣性，還是光合系統(tǒng)本身的可操控空間來(lái)說(shuō)都是如此，即使只對(duì)光利用的系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化也有相當(dāng)大的空間提升光效率［64-66］。利用光-電-光轉(zhuǎn)化的方式提升太陽(yáng)能量利用效率的工程化條件是接近成熟的，它的障礙在于光元器件的整合設(shè)計(jì)、強(qiáng)光脅迫等問題的解決。同時(shí)也需要探討最適光比例、光照方式等以實(shí)現(xiàn)全鏈條的最大效率。

2.3 固碳能力

在已發(fā)現(xiàn)的所有固碳途徑中藍(lán)細(xì)菌的天然固碳途徑并不是最有效的，除了藍(lán)細(xì)菌中的固碳途徑還有5種其他生物的固碳途徑，這為利用合成生物學(xué)手段對(duì)不同途徑的整合與優(yōu)化提供了豐富的素材［67-68］。鑒于此，一方面可以在藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行關(guān)鍵固碳酶的替換，比如可以通過酶的挖掘和人工設(shè)計(jì)獲得高效的固碳酶，然后進(jìn)行替換；另一方面可以在藍(lán)細(xì)菌中引入額外的固碳途徑［69］。隨著代謝網(wǎng)絡(luò)理論的發(fā)展和固碳途徑的認(rèn)識(shí)不斷深入，根據(jù)計(jì)算理論設(shè)計(jì)構(gòu)建人工的固碳途徑也已經(jīng)成為可能，已有一些研究成功設(shè)計(jì)了人工固碳途徑［67-68，70］。碳固定效率提升的另一個(gè)方面是提升CO2的可獲得性。藍(lán)細(xì)菌天然存在碳濃縮機(jī)制，通過對(duì)這些機(jī)制和元件的深入研究，可以最大程度地提升藍(lán)細(xì)菌對(duì)CO2的可獲得性［69］。值得注意的是，碳濃縮機(jī)制僅在CO2濃度低的時(shí)候起到正面的作用，在高濃度CO2的條件下，碳濃縮機(jī)制的缺失或敲低更有利于CO2的利用［71］。敲除碳濃縮機(jī)制的另外一個(gè)好處是降低了工程藍(lán)細(xì)菌在自然環(huán)境中的生存能力，從而可以減少工程藍(lán)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的影響［72］。增強(qiáng)CO2的利用還可以通過培養(yǎng)基的化學(xué)吸收實(shí)現(xiàn)，比如Ataeian等［45］篩選了一個(gè)耐堿的藍(lán)細(xì)菌菌群，可以在pH為11.2的培養(yǎng)條件下快速吸收轉(zhuǎn)化CO2，大大提高了碳的吸收效率。

2.4 藍(lán)細(xì)菌底盤的多樣性

微生物的代謝潛能蘊(yùn)藏在微生物的多樣性之中，多樣性越高，就越有希望找到符合各種各樣不同需求的基因資源，這是開發(fā)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠以滿足“碳達(dá)峰”“碳中和”需求的理性所在［73］。作為藍(lán)細(xì)菌的代表菌株，聚球藻在地球生物圈中豐度和多樣性比較高，是海洋的主要初級(jí)生產(chǎn)力來(lái)源［74-75］。這就使得我們能夠方便地獲得適用于聚球藻的功能基因元件，并且方便地實(shí)現(xiàn)聚球藻細(xì)胞工廠的構(gòu)建。另外，聚球藻的多樣性說(shuō)明這種底盤的強(qiáng)大環(huán)境適應(yīng)能力和生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)能力，這從細(xì)胞工廠的大規(guī)模應(yīng)用來(lái)講是一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)。再次，聚球藻的適應(yīng)能力也決定了未來(lái)在各種不同環(huán)境應(yīng)用的可能性。最后，從科學(xué)上講，這個(gè)方面的研究對(duì)于地球碳循環(huán)的研究來(lái)說(shuō)也具有很高的科學(xué)價(jià)值。另外一點(diǎn)值得關(guān)注的是聚球藻具有非常強(qiáng)的代謝可塑性，對(duì)其進(jìn)行高鹽、高光等馴化可以獲得相應(yīng)的適應(yīng)性突變菌株［76］。鑒于上述特點(diǎn)以及聚球藻的基因操作技術(shù)相對(duì)來(lái)說(shuō)較為成熟，作為宿主構(gòu)建細(xì)胞工廠的研究比其他藍(lán)細(xì)菌種屬都要多。不難看出，綜合來(lái)說(shuō)聚球藻作為底盤進(jìn)行合成生物學(xué)研究科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用潛力都是不容忽視的。

3 聚球藻與基因編輯技術(shù)

3.1 基因編輯

上述分析表明了對(duì)系統(tǒng)化開發(fā)聚球藻底盤的重要價(jià)值。底盤開發(fā)的重要前提是高效可靠的遺傳操作技術(shù)。聚球藻基因組的高效改造和編輯，是重構(gòu)聚球藻代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、提高其代謝潛能的關(guān)鍵使能技術(shù)。傳統(tǒng)的聚球藻基因組編輯方法主要依賴于自殺質(zhì)粒攜帶的同源片段與染色體發(fā)生雙同源重組，并使用抗生素抗性基因等篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，難以實(shí)現(xiàn)無(wú)痕編輯。因此，下一輪編輯時(shí)需要使用新的篩選標(biāo)記，限制了對(duì)聚球藻的系統(tǒng)遺傳改造。此外，由于聚球藻通常具有多拷貝的染色體，因此需要多輪的抗生素篩選分純，才可以得到純種基因型突變體［77-78］。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein）系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種真核和原核生物的基因組編輯［79］。借助CRISPR/Cas系統(tǒng)的精確定位和高效DNA切割能力，可提高外源DNA編輯模板與染色體DNA的同源重組效率，簡(jiǎn)化基因組編輯操作流程，實(shí)現(xiàn)高效無(wú)痕的遺傳改造［圖2（a）］。

2016年，Hu Yu-Chen團(tuán)隊(duì)和Himadri B.Pakrasi團(tuán)隊(duì)分別在兩株模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中開發(fā)了基于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)（表1）。S.elongatusPCC 7942的CRISPR/Cas9基因組編輯基于雙質(zhì)粒系統(tǒng)，由一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Cas9和引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA），另一個(gè)質(zhì)粒提供編輯所需的同源重組片段和敲入的靶基因。Cas9和gRNA的表達(dá)均使用S.pyogenesCRISPR/Cas9系統(tǒng)的天然啟動(dòng)子，在S.elongatusPCC 7942可實(shí)現(xiàn)組成型表達(dá)。作者測(cè)試了敲除glgc的同時(shí)敲入ppc和gltA，從而提高菌株固定CO2合成琥珀酸的能力，對(duì)經(jīng)過3代抗生素篩選的克隆進(jìn)行驗(yàn)證，基因編輯效率達(dá)到100%［80］。S.elongatusUTEX 2973的CRISPR/Cas9工 具 質(zhì) 粒pSL2546改 造 自 鏈 霉 菌（Streptomyces）的CRISPR/Cas9質(zhì)粒pCRISPomyces，由一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Cas9和gRNA，同時(shí)攜帶編輯模板。適用于鏈霉菌的啟動(dòng)子PrpsL（XC）和Pgapdhp（EL）在S.elongatusUTEX 2973也具有功能，分別用于Cas9和gRNA的組成型表達(dá)。作者使用開發(fā)的系統(tǒng)對(duì)nblA進(jìn)行了敲除，不需要對(duì)編輯后的細(xì)胞進(jìn)行多次抗生素篩選傳代，即可實(shí)現(xiàn)100%的編輯效率［82］。

表1 基于CRISPR的聚球藻基因組編輯技術(shù)Tab.1 CRISPR-based genome editing technologies for Synechococcus

在構(gòu)建聚球藻的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)聚球藻的毒性較大，導(dǎo)致工具質(zhì)粒轉(zhuǎn)化困難［84］。分析原因，一方面，Cas9蛋白具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性，在其他微生物中也有體現(xiàn)［85］；另一方面，在聚球藻中Cas9蛋白的表達(dá)通常使用組成型啟動(dòng)子，沒有受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂疲觿×似涠拘?。Himadri B.Pakrasi團(tuán)隊(duì)在多株藍(lán)細(xì)菌中測(cè)試了來(lái)自Francisella novicida的CRISPR/Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞毒性較小，同時(shí)可高效地在模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中實(shí)現(xiàn)基因組編輯［81，83］。該系統(tǒng)由一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Cas12a和gRNA，同時(shí)攜帶編輯模板，IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Plac和組成型啟動(dòng)子PJ23119分別用于Cas12a和gRNA array的表達(dá)調(diào)控。作者測(cè)試了psbA的單點(diǎn)突變、eyfp的敲入和nblA的敲除，通過對(duì)經(jīng)過3～4代抗生素篩選的克隆進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)編輯效率為60%～90%［83］。

3.2 堿基編輯

使用開發(fā)的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，可在聚球藻中實(shí)現(xiàn)無(wú)痕的基因敲除、敲入或者替換。但是，該方法基于質(zhì)粒提供的編輯模板與染色體DNA的同源重組，以及CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)未發(fā)生同源重組細(xì)胞的反向篩選。受限于聚球藻的DNA轉(zhuǎn)化效率和同源重組效率，難以實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)編輯。堿基編輯（base editing）技術(shù)最初由哈佛大學(xué)的David R.Liu團(tuán)隊(duì)和神戶大學(xué)的Akihiko Kondo團(tuán)隊(duì)獨(dú)立開發(fā)，其結(jié)合了CRISPR/Cas系統(tǒng)的定位功能和堿基脫氨酶的脫氨功能，在不產(chǎn)生雙鏈DNA切割，不依賴外源DNA模板的條件下，在染色體特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C→T的堿基轉(zhuǎn)換［86-87］。之后，研究者又陸續(xù)開發(fā)了可實(shí)現(xiàn)A→G轉(zhuǎn)換、C→A和C→G顛換的堿基編輯技術(shù)［88-90］。堿基編輯最初為治療人類遺傳疾病而設(shè)計(jì)，逐步應(yīng)用于微生物的基因組編輯中，目前已在大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等模式微生物中得到應(yīng)用［91］。由于不需要提供外源的DNA模板、不依賴雙鏈DNA斷裂和同源重組修復(fù)，堿基編輯可用于微生物中多靶點(diǎn)的同時(shí)編輯，并可在Biofoundry平臺(tái)實(shí)現(xiàn)全流程的自動(dòng)化編輯［92-93］。此外，堿基編輯可對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)多至10個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控元件的體內(nèi)建庫(kù)和進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，已經(jīng)成為重要的合成生物學(xué)使能技術(shù)［94］。因此，有必要開發(fā)適用于聚球藻等藍(lán)細(xì)菌的堿基編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)的同時(shí)編輯，加速聚球藻的遺傳改造和功能基因組學(xué)研究［圖2（a）］。

圖2 使用CRISPR及衍生技術(shù)進(jìn)行聚球藻基因組編輯Fig.2 Genome editing in Synechococcus using CRISPR and CRISPR-derived technologies

3.3 多基因調(diào)控

CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可用于基因組編輯，經(jīng)過改造還可用于基因表達(dá)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)基因沉默和激活［79］。2016年Hu Yu-Chen團(tuán)隊(duì)首先利用雙鏈DNA切割功能失活的dCas9構(gòu)建了S.elongatusPCC 7942的CRISPR干 擾 系 統(tǒng)（CRISPR interference，CRISPRi），可實(shí)現(xiàn)靶基因表達(dá)水平90%以上的弱化［95］。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)不僅對(duì)聚球藻的細(xì)胞毒性較低，且由于Cas12a同時(shí)具有RNA切割功能，可加工gRNA array形成單個(gè)成熟的gRNA，方便同時(shí)靶向多個(gè)基因。2020年，成均館大學(xué)的Han Min Woo團(tuán)隊(duì)和華盛頓大學(xué)的Himadri B.Pakrasi團(tuán)隊(duì)分別在兩株模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中 利用雙 鏈DNA切割功能失活的dCas12a建立了CRISPRi技術(shù)，通過使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制dCas12a表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了可控、高效的多基因表達(dá)弱化［96-97］。除CRISPRi外，CRISPR激 活（CRISPR activation，CRISPRa）系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于E.coli和產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等細(xì)菌中［98］。但是，目前針對(duì)聚球藻的CRISPRa系統(tǒng)還有待開發(fā)。CRISPRi和CRISPRa技術(shù)具有g(shù)RNA的可追蹤性，通過建立gRNA文庫(kù)，可構(gòu)建全基因組規(guī)模的基因表達(dá)擾動(dòng)文庫(kù)，高通量地進(jìn)行功能基因組學(xué)研究和功能元件挖掘。目前已有針對(duì)集胞藻Synechocystissp.PCC 6803的全基因組規(guī)模CRISPRi文庫(kù)，并用于乳酸耐受和高產(chǎn)相關(guān)基因的挖掘［99］。因此，有必要針對(duì)聚球藻建立全基因組規(guī)模的CRISPRi和CRISPRa文庫(kù)，在全基因組規(guī)模上研究基因型與有益表型的關(guān)聯(lián)性。

4 聚球藻與適應(yīng)性進(jìn)化

4.1 底盤進(jìn)化

實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化是對(duì)聚球藻進(jìn)行定向改造的另一項(xiàng)關(guān)鍵使能技術(shù)，可以直接根據(jù)研究者需要的功能設(shè)計(jì)篩選策略，即使在對(duì)相關(guān)元件的作用機(jī)制還沒有進(jìn)行詳細(xì)解析的情況下，通常也可以通過該方法獲得符合需求的突變體。實(shí)驗(yàn)室中微生物適應(yīng)性進(jìn)化最常用的方法是在一定的篩選壓力下將微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過微生物突變的富集獲得能夠適應(yīng)篩選條件的表型［100］。目前為止以聚球藻為對(duì)象進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化的研究還比較有限，考慮到聚球藻和集胞藻都是研究最多的模式單細(xì)胞微藻，且二者之間有很多相似之處［101］，因此集胞藻的適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)于聚球藻的相關(guān)研究也具有很強(qiáng)的借鑒意義。聚球藻和集胞藻的適應(yīng)性進(jìn)化，主要是為了提高它們的光合效率以及對(duì)于生物合成過程中可能遇到的脅迫條件的耐受能力。

Dann等［102］利用化學(xué)誘變劑甲磺酸甲酯MMS和紫外線誘變相結(jié)合，連續(xù)傳代培養(yǎng)后獲得了能夠耐受超過自然條件下陸上最高太陽(yáng)光光強(qiáng)度［3000 μmol/（m2·s）］的集胞藻PCC 6803，從突變株基因組中檢測(cè)到的突變位點(diǎn)涉及基因表達(dá)、光合作用、細(xì)胞代謝等多種不同功能分類的基因。Yoshikawa等［103］則直接利用集胞藻PCC 6803自然突變的積累，在高光照條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)后也獲得了耐受光強(qiáng)度達(dá)到7000～9000 μmol/（m2·s）的突變株，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致高光耐受的突變主要位于hik26和slr1916兩個(gè)基因上，與前述研究中檢測(cè)到的位點(diǎn)有所不同。

Srivastava等［104］進(jìn)化聚球藻PCC 11801使其對(duì)丁醇和丁二醇的耐受濃度提高到原水平的2倍，其中丁醇耐受株還獲得了對(duì)乙醇的耐受性。進(jìn)化獲得的菌株的突變主要位于脅迫響應(yīng)的翻譯起始因子和細(xì)胞代謝相關(guān)的酶類編碼基因中。在其他種類的藍(lán)細(xì)菌也開展了一些進(jìn)化工作，可在聚球藻的進(jìn)化中借鑒。Wang等［105］進(jìn)化集胞藻PCC 6803使其對(duì)丁醇的耐受濃度提高2.5倍，并利用代謝組學(xué)方法對(duì)進(jìn)化不同階段所產(chǎn)生的突變株進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)如3-磷酸甘油酸、NADPH等不穩(wěn)定代謝物以及甘油、硬脂酸等穩(wěn)定代謝物在進(jìn)化過程中的差異化調(diào)控。Xu等［106］進(jìn)化集胞藻PCC 6803使其對(duì)鎘離子的耐受濃度提高到原來(lái)的2倍，且該突變株對(duì)鋅和鈷等重金屬離子以及高光強(qiáng)的耐受能力也提高了；通過對(duì)基因突變的分析發(fā)現(xiàn)其中編碼正離子或藥物泵出系統(tǒng)的基因slr0454與突變株的鎘離子耐受能力直接相關(guān)。Tillich等［107］進(jìn)化獲得了熱耐受性的集胞藻PCC 6803突變株，并通過突變測(cè)序分析確定了一系列導(dǎo)致突變株產(chǎn)生耐熱表型的基因。Hu等［108］在3%氯化鈉的篩選條件下進(jìn)化了集胞藻PCC 6803對(duì)高鹽濃度的耐受性，并對(duì)突變株進(jìn)行了代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了不同突變株在高鹽脅迫條件下代謝物組成以及基因表達(dá)情況的不同，從側(cè)面反映了產(chǎn)生高鹽耐受表型的不同機(jī)理。Uchiyama等［109］則進(jìn)化了集胞藻對(duì)酸的耐受性，獲得能夠在pH 5.5的條件下生長(zhǎng)的突變株。

4.2 元件進(jìn)化

以上研究中都采用連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式，且大多只依賴于聚球藻等藍(lán)細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中天然的突變積累實(shí)現(xiàn)建庫(kù)，由于藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)周期普遍較長(zhǎng)，使得適應(yīng)性進(jìn)化的過程也十分漫長(zhǎng)，通常需要花費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年時(shí)間。而除了將聚球藻整體作為對(duì)象進(jìn)行定向進(jìn)化改造之外，一些關(guān)鍵元件也可以通過基因操作轉(zhuǎn)移到其他生長(zhǎng)更快且操作更加簡(jiǎn)便的模式微生物體系中進(jìn)行進(jìn)化操作。

已有研究通過在大腸桿菌中部分重建卡爾文循環(huán)，建立了大腸桿菌的生長(zhǎng)與在該循環(huán)中起關(guān)鍵作用的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的催化效率之間的關(guān)聯(lián)。通過這樣的構(gòu)建，可以充分利用大腸桿菌系統(tǒng)基因操作便利的優(yōu)勢(shì)，采用易錯(cuò)PCR的方式對(duì)來(lái)源于聚球藻的RuBisCO進(jìn)行擴(kuò)增快速建立突變庫(kù)，轉(zhuǎn)化后篩選具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的菌株從而獲得催化性能得到改善的突變體［110-111］。除大腸桿菌之外，釀酒酵母中的非飽和脂肪酸缺陷型菌株也可以作為底盤，用于進(jìn)化來(lái)源于聚球藻PCC 6301的脂肪酸去飽和酶［112］。以上研究都是通過一定的方式將待進(jìn)化的藍(lán)細(xì)菌元件的功能與最常用的大腸桿菌或釀酒酵母的生長(zhǎng)建立關(guān)聯(lián)，從而構(gòu)建了簡(jiǎn)便的篩選策略，再利用這兩種模式生物基因操作便捷的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)以藍(lán)細(xì)菌本身為底盤難以達(dá)到的快速進(jìn)化。近年來(lái)在大腸桿菌等模式微生物中的連續(xù)定向進(jìn)化系統(tǒng)已有了快速的發(fā)展。其中，噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（phage-assisted continuous evolution，PACE）通過建立待進(jìn)化生物分子的功能與噬菌體侵染能力之間的關(guān)聯(lián)，并借助連續(xù)培養(yǎng)裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)建庫(kù)和篩選，達(dá)到高效進(jìn)化的目的（圖3）［113-114］。該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于RNA聚合酶、氨酰tRNA合成酶、Cas蛋白、堿基編輯器等重要生物工具酶類，以及抗生素合成通路的進(jìn)化［115-117］。此外，包括基于CRISPR/Cas系統(tǒng)等基因編輯工具進(jìn)行建庫(kù)的方法也在不斷涌現(xiàn)，且借助自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)等工具可以使得適應(yīng)性進(jìn)化操作更加快速高效［118］。利用這些實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和平臺(tái)，有望大大加速聚球藻關(guān)鍵元件的進(jìn)化。通過藍(lán)細(xì)菌元件的分別進(jìn)化和突變體組裝以及重新組裝后的工程菌株的整體適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合的研究方式，可以為菌株的性能改造提供更多途徑，也將為研究者積累豐富的關(guān)于藍(lán)細(xì)菌基因功能及代謝調(diào)控的數(shù)據(jù)。

圖3 噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化（PACE）系統(tǒng)示意圖MP—誘變質(zhì)粒；AP—輔助質(zhì)粒；SP—篩選噬菌體或其注入宿主細(xì)胞的基因組；POI—待進(jìn)化的目標(biāo)蛋白Fig.3 Schematic design of phage-assisted continuous evolution(PACE)MP—mutagenesis plasmid;AP—accessory plasmid;SP—selection phage or its genome inside the infected host cell;POI—protein of interest to be evolved

5 聚球藻的多元抗逆

聚球藻底盤在規(guī)模化培養(yǎng)中，面臨來(lái)自環(huán)境（鹽度、pH、重金屬、溫度及光照等）的多種非生物脅迫，因此，鑒定、解析及構(gòu)建魯棒性底盤，使其具備抗逆性能，尤其是對(duì)多種脅迫的協(xié)同抗逆性對(duì)其規(guī)?；瘧?yīng)用十分必要（圖4）。

圖4 聚球藻在規(guī)模化培養(yǎng)中面臨的脅迫及潛在的解決策略Fig.4 Stress and potential solutions in large-scale culture of Synechococcus sp

5.1 聚球藻逆境脅迫響應(yīng)基因的鑒定

聚球藻PCC 7942作為最為廣泛使用的模式藍(lán)細(xì)菌底盤之一，其完整基因組注釋早在2005年就已完成，已被用于合成正丁醇［119］、異丁醛［120］、乳酸［121］等多種化學(xué)品，關(guān)于聚球藻PCC 7942的抗逆研究也廣泛開展。2014年，Billis等［101］利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)研究了聚球藻PCC 7942分別在無(wú)機(jī)碳減少、鹽度增加、pH增加和光照減少的脅迫條件下24 h后細(xì)胞的基因表達(dá)響應(yīng)。作者通過分析揭示了參與眾多脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因并預(yù)測(cè)了未知功能蛋白與生化途徑之間的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步改造底盤對(duì)脅迫的抗逆能力提供了重要靶點(diǎn)［101］。2017年，Kobayashi等［122］研究了聚球 藻PCC 7942中雙組分系統(tǒng)RpaB和Rre1在熱激脅迫中的響應(yīng)，通過免疫共沉淀和高密度微陣列分析等鑒定出Rre1的一系列結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)Hik34-Rre1是聚球藻PCC 7942中激活熱激響應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)模塊。在此基礎(chǔ)上，Yasuda等［123］又證實(shí)了RpaB可能廣泛參與從暗到光以及光強(qiáng)上升條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)于宿主的高光響應(yīng)同樣具有重要作用，這表明雙組分系統(tǒng)在多元抗逆中均有參與，可能成為未來(lái)工程改造的靶點(diǎn)。之前的研究都集中在單一脅迫，而在規(guī)?；瘧?yīng)用過程中，通常面臨多種脅迫，因此鑒定多元逆境響應(yīng)的元件更加重要。2020年，Guyet等［124］以海洋聚球藻WH 7803為對(duì)象，研究了其對(duì)光照、溫度及紫外脅迫中兩兩組合脅迫下（低光低溫、低光紫外、低光高溫、高光紫外、高光低溫、高光高溫）的響應(yīng)機(jī)制；研究發(fā)現(xiàn)，單一脅迫均對(duì)光系統(tǒng)造成損傷而紫外脅迫造成的損傷尤為嚴(yán)重；通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，鑒定到了一系列在組合脅迫下特異響應(yīng)的基因，例如低溫紫外和低溫高光脅迫誘導(dǎo)下的DNA結(jié)合蛋白編碼基因dpsA、多種組合脅迫下編碼通用脅迫響應(yīng)蛋白的基因uspG等，這些基因的鑒定為未來(lái)構(gòu)建多元抗逆底盤打下了基礎(chǔ)。

5.2 新型聚球藻底盤的鑒定及解析

近年來(lái)，隨著研究的深入，不斷有更優(yōu)越的聚球藻底盤被鑒定，一方面這些菌株作為新型底盤可能更具優(yōu)勢(shì)，另一方面對(duì)這些底盤的解析可發(fā)掘高效元件用于理性改造其他聚球藻底盤。聚球藻UTEX 2973是2015年被報(bào)道的1種具備快速生長(zhǎng)能力且耐受高溫（42℃）高光［2000 μmol/（m2·s）］的藍(lán)細(xì)菌底盤，其與聚球藻PCC 7942基因組相似度高達(dá)98%以上［56］；聚球藻UTEX 2973倍增時(shí)間最短可達(dá)1.5 h，因此有可能成為更有應(yīng)用前景的藍(lán)細(xì)菌底盤［125］。前期工作通過光合參數(shù)測(cè)定、代謝流模型及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等解析了聚球藻UTEX 2973與聚球藻PCC 7942間的差異，發(fā)現(xiàn)聚球藻UTEX 2973中光合系統(tǒng)I含量增加了1.6倍，細(xì)胞色素b6f含量增加了1.5倍，質(zhì)體藍(lán)素含量增加了2.4倍，使得菌株具備更強(qiáng)的光合及固碳能力［57，125-126］。聚球藻UTEX 2973雖然與聚球藻PCC 7942高度同源，但喪失了天然吸收外源DNA的能力從而限制了基因操作的便捷性。此后，與上述兩底盤基因組相似度達(dá)83%的另一底盤——聚球藻PCC 11801被鑒定和解析。聚球藻PCC 11801可耐受超過38℃的溫度及超過400 μmol/（m2·s）的光照；在1%CO2、1000 μmol/（m2·s）條件下倍增時(shí)間可達(dá)2.8 h，更重要的是，其關(guān)鍵中間代謝物水平較高且在高CO2和高溫條件下生長(zhǎng)速度更快，因此有可能成為戶外培養(yǎng)和最終應(yīng)用于生物煉制的有吸引力的底盤［127］。對(duì)于藍(lán)細(xì)菌的規(guī)?；囵B(yǎng)將耗費(fèi)大量的水資源，采用海水培養(yǎng)將節(jié)約淡水資源，因此發(fā)掘優(yōu)勢(shì)海洋藍(lán)細(xì)菌底盤十分必要。聚球藻PCC 11901是2020年被報(bào)道的1株新型海洋藍(lán)細(xì)菌底盤，其在41°C、500 μmol/（m2·s）及1% CO2條件下倍增時(shí)間為2 h，并且干重高達(dá)33 g/L，同樣有望成為新興的藍(lán)細(xì)菌底盤［55］。目前圍繞聚球藻PCC 11801及聚球藻PCC 11901的解析工作開展較少，未來(lái)對(duì)其代謝模式及基因組的發(fā)掘工作將有助于發(fā)掘耐受高溫、高光及高鹽等的模塊用于改造其他聚球藻底盤。

5.3 聚球藻底盤抗逆能力的定向改造

聚球藻UTEX 2973已具備高溫高光的耐受能力，但其耐鹽性能相對(duì)較低。為了提高底盤的耐鹽能力，Cui等先后在聚球藻UTEX 2973中通過引入外源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及滲透相溶性物質(zhì)的策略進(jìn)行探索：通過分別表達(dá)21個(gè)外源Na+/H+相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并在鹽脅迫下進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3個(gè)Mrp逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可顯著提高宿主的耐鹽性，其中聚球藻PCC 7002來(lái)源的Mrp蛋白可使聚球藻UTEX 2973抗鹽性提高57.7%［128］；通過在聚球藻UTEX 2973中引入滲透相溶性物質(zhì)甘油葡萄糖苷的合成途徑，底盤抗鹽性能提升了62%［129］。這些工作為提供更具環(huán)境魯棒性的聚球藻底盤打下基礎(chǔ)?？紤]到聚球藻UTEX 2973與聚球藻PCC 7942間的高度同源性，利用前者優(yōu)勢(shì)模塊對(duì)后者進(jìn)行改造引起廣泛關(guān)注。在解析聚球藻UTEX 2973基因組差異的基礎(chǔ)上，Lou等［130］率先在聚球藻PCC 7942中引入聚球藻UTEX 2973中的差異基因并成功鑒定到后者中的ATP合酶亞基（AtpA）的突變是造成二者對(duì)高光高溫耐受能力差異的最主要因素，通過在聚球藻PCC 7942中引入突變后的atpA可顯著提升其高溫高光耐受能力。隨后Ungerer等［81］利用基因編輯的策略逐步在聚球藻PCC 7942中引入其與聚球藻UTEX 2973的差異基因，最終獲得3個(gè)造成二者表型差異的基因。單基因或少數(shù)基因難以實(shí)現(xiàn)菌株的全局性變化，而適應(yīng)性進(jìn)化通過不斷增加篩選壓力，可富集有利突變，實(shí)現(xiàn)基因組的全局調(diào)整從而使得底盤抗逆能力得到穩(wěn)定提升。在近期的工作中，Srivastava等［104］通過100代的連續(xù)進(jìn)化，將聚球藻PCC 11801對(duì)正丁醇、2，3-丁二醇及乙醇的耐受能力分別提升至5 g/L、30 g/L及32 g/L，并發(fā)現(xiàn)了若干關(guān)鍵突變基因例如編碼翻譯起始因子編碼蛋白rpoB及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因等，這些基因未來(lái)也可用于其他聚球藻底盤的抗逆改造。

目前，具備多元抗逆能力的聚球藻底盤仍舊較少，如何鑒定、解析及構(gòu)建多元抗逆魯棒性底盤，可從以下幾個(gè)方面思考（圖4）：

（1）新型底盤的發(fā)掘及解析聚球藻PCC7942、聚球藻PCC7002和集胞藻PCC6803作為經(jīng)典的藍(lán)細(xì)菌菌種被廣泛用于合成生物學(xué)研究，然而作為工業(yè)底盤進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用仍有所欠缺，目前對(duì)于天然的新型藍(lán)細(xì)菌菌株的鑒定已發(fā)掘了包括聚球藻UTEX 2973、聚球藻PCC 11801及聚球藻PCC 11901等更具優(yōu)勢(shì)的底盤，有望促進(jìn)藍(lán)細(xì)菌的規(guī)?；瘧?yīng)用，未來(lái)，鑒定更多的底盤并對(duì)其進(jìn)行機(jī)理解析將有助于對(duì)傳統(tǒng)底盤的改造，同時(shí)開發(fā)配套的遺傳工作工具也將助力新型底盤的開發(fā)和使用。

（2）多維定向進(jìn)化定向進(jìn)化雖然需要較長(zhǎng)時(shí)間，卻是獲得魯棒性底盤的最有效方式之一，目前針對(duì)聚球藻的定向進(jìn)化工作相對(duì)較少，未來(lái)可首先圍繞不同脅迫對(duì)聚球藻進(jìn)行定向進(jìn)化獲得耐受性底盤，隨后在獲得單一脅迫耐受底盤的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行多維進(jìn)化從而獲得多元抗逆底盤。

（3）理性設(shè)計(jì)現(xiàn)有的系統(tǒng)生物學(xué)工作已發(fā)掘了諸多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，如何把這些關(guān)鍵基因有機(jī)整合對(duì)聚球藻底盤進(jìn)行理性設(shè)計(jì)十分關(guān)鍵，在未來(lái)需要結(jié)合生物信息學(xué)理性分析代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)鍵基因的整合從而助力多元抗逆底盤的構(gòu)建。

6 聚球藻細(xì)胞工廠

自1979年聚球藻被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其生理、生化系統(tǒng)發(fā)育及分子生態(tài)學(xué)等方面取得了一系列重要進(jìn)展。隨著我國(guó)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的加速推進(jìn)和CO2減排的迫切需求，綠色生物制造產(chǎn)業(yè)正在全面拓展與提升。其中將聚球藻開發(fā)成為高效光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠，使其利用光能將CO2直接轉(zhuǎn)化為生物基化學(xué)品，在綠色生產(chǎn)的同時(shí)助力碳中和目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，成為極具前景的研究方向。

6.1 大宗化學(xué)品

2，3-丁二醇是極具應(yīng)用潛力的平臺(tái)化合物，從丙酮酸開始，2，3-丁二醇可以通過乙酰乳酸合成酶，乙酰乳酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的催化合成來(lái)實(shí)現(xiàn)。乙酰乳酸合成酶催化兩個(gè)丙酮酸分子縮合成一個(gè)乙酰乳酸，然后乙酰乳酸脫羧酶使其脫羧生成乙酰丙酮，最后一步用乙醇脫氫酶將乙酰丙酮還原為2，3-丁二醇。Oliver等［131］在聚球藻PCC 7942中進(jìn)行了生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，20 d后2，3-丁二醇的產(chǎn)量達(dá)2.38 g/L。Li等［132］以聚球藻PCC 7942為底盤構(gòu)建異丁醇產(chǎn)生菌株，通過敲除糖原合成途徑中的葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，使52%的碳流量被重定向到異丁醇生物合成途徑，產(chǎn)量達(dá)550 mg/L。Lan等［133］在聚球藻PCC 7942中構(gòu)建產(chǎn)3-聚羥基丁酸的兩種途徑，一種是丙二酰輔酶A依賴途徑，3-聚羥基丁酸的產(chǎn)量最高達(dá)665 mg/L，另一種β-丙氨酸依賴途徑產(chǎn)量稍低，為186 mg/L。

乳酸是一種手性α-羥基酸，有兩種異構(gòu)體D型和L型，被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、化工、紡織、食品等行業(yè)。最近一種極具應(yīng)用前景的多聚形式——聚乳酸有望成為生物基塑料的生物可降解替代品，它的一步法合成是利用脫氫酶將細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸異構(gòu)體。Li等［18］將來(lái)自保加利亞桿菌ATCC11842的D-乳酸脫氫酶進(jìn)行突變，輔助因子由NADH逆轉(zhuǎn)為NADPH，將該工程酶引入聚球藻PCC 7942中，構(gòu)建了從CO2生成D-乳酸的高效光驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，將乳酸的產(chǎn)量提高了3.6倍以上。Wang等［41］以聚球藻PCC 7942為底盤過表達(dá)甘油-3-磷酸酶構(gòu)建基因工程菌YW1，甘油產(chǎn)量達(dá)1.17 g/L，實(shí)現(xiàn)了利用CO2直接進(jìn)行C3平臺(tái)化學(xué)品的光合生產(chǎn)，并且在YW1菌株中擴(kuò)展外源途徑，進(jìn)一步引導(dǎo)碳通量產(chǎn)生二羥基丙酮和3-羥基丙酸兩種平臺(tái)化學(xué)品，證明了由藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生的甘油可以作為發(fā)酵原料。Roh等［134］在快速生長(zhǎng)的聚球藻UTEX 2973中引入來(lái)源于羅爾斯通氏菌H16（Cupriavidus necatorH16）的phaCAB基因構(gòu)建產(chǎn)β-聚羥基丁酸生產(chǎn)菌株，工程菌的產(chǎn)量達(dá)420 mg/L。

6.2 高值化合物

藍(lán)細(xì)菌由于可以解決生物法制備天然產(chǎn)物所面臨的植物酶源適配性、還原力的供應(yīng)和昂貴底物的依賴等問題，因此成為植物天然產(chǎn)物生產(chǎn)的理想平臺(tái)，已經(jīng)被用來(lái)生產(chǎn)萜類和苯丙烷類等天然產(chǎn)物（表2）。Ni等［42］在光合微生物聚球藻PCC 7942中構(gòu)建了1個(gè)光自養(yǎng)合成平臺(tái)，直接將溫室氣體CO2轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇、柚皮素、雙去甲氧基姜黃素、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸。這6種天然高值產(chǎn)物可以進(jìn)一步衍生出其他珍貴的極具價(jià)值的天然產(chǎn)物。該團(tuán)隊(duì)［43］還通過引入2-苯乙醇途徑和1個(gè)人工的解反饋抑制模塊，創(chuàng)建了1個(gè)代謝陷阱，將30%以上的碳源重定向到低流量的莽草酸途徑，從而直接利用CO2高效合成芳香類天然產(chǎn)物。

表2 聚球藻細(xì)胞為底盤生產(chǎn)的產(chǎn)品Tab.2 Chemical production using Synechococcus strain as chassis

異戊二烯是重要的化工原料，可通過形成聚合體合成橡膠、塑料及萜類化合物［135］。Gao等［39］將不同來(lái)源的異戊二烯合酶引入聚球藻PCC 7942，發(fā)現(xiàn)藍(lán)桉樹（Eucalyptus globulus）來(lái)源的ispS比其他來(lái)源的基因在藍(lán)細(xì)菌中可溶性表達(dá)更好；隨后，他們利用動(dòng)態(tài)代謝流分析揭示MEP途徑的瓶頸，構(gòu)建了異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）和IspS融合酶并高表達(dá)了1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因（dxs）和4-羥基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶基因（ispG），重組菌株可以在21 h內(nèi)光合生產(chǎn)1.26 g/L異戊二烯。

Davies等［136］在聚球藻PCC 7002中表達(dá)了留蘭香（Mentha spicata）的檸檬烯合酶基因或者巨冷杉（Abies grandis）的α-紅沒藥烯合酶基因（bis），分別可以得到4 mg/L檸檬烯和0.6 mg/L紅沒藥烯。Takahama等［137］在聚球藻PCC 7942表達(dá)了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）中的乙烯形成酶基因（efe），光合合成了約512 μg/（L·OD·h）的乙烯。Jacobsen等［138］在聚球藻PCC 7002中表達(dá)了大腸桿菌的磷酸甘露醇脫氫酶基因（mtlD）和艾美球蟲（Eimeria tenella）的甘露醇磷酸酶基因（mlp），每天可以光合生產(chǎn)0.15 g/L甘露醇。將糖原合成途徑失活后，甘露醇的產(chǎn)量可以提高3.2倍。

6.3 光驅(qū)動(dòng)細(xì)胞工廠新策略

微生物共生在多種生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是當(dāng)前正在興起的一種新的新的合成生物學(xué)策略，在化學(xué)品的生物生產(chǎn)效率提升方面有獨(dú)特的潛力。Smith等［139］研究了光合自養(yǎng)的聚球藻PCC 7942與重氮營(yíng)養(yǎng)型固氮菌共培養(yǎng)情況，提出了交互取食（cross-feeding）模型。他們用固氮菌和聚球藻構(gòu)建了一種新的共培養(yǎng)微生物體系，可在無(wú)固定碳與固定氮的條件下生長(zhǎng)。這個(gè)共培養(yǎng)體系在無(wú)聚球藻條件下不能生長(zhǎng)，兩種菌也無(wú)法獨(dú)自在沒有固定的碳或氮的情況下生長(zhǎng)。這個(gè)新體系具備直接利用空氣、水、磷酸鹽、微量金屬和陽(yáng)光生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品的潛力，如生產(chǎn)聚羥基丁酸（PHB）和海藻酸鹽。Weiss等［140］利用上述產(chǎn)蔗糖藍(lán)細(xì)菌與異養(yǎng)鹽單胞菌（Halomonas bolviensis）共培養(yǎng)，催化低價(jià)值碳水化合物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高價(jià)值化合物。他們實(shí)現(xiàn)了一種生物塑料前體PHB的合成。他們同時(shí)證明海藻酸鹽包裹聚球藻可提高蔗糖外排量，并增強(qiáng)共培養(yǎng)穩(wěn)定性，最終PHB累積量可達(dá)細(xì)胞干重的31%，產(chǎn)率可達(dá)28.3 mg/（L·d）。這種共培養(yǎng)方法達(dá)到或超過了那些傳統(tǒng)工程藍(lán)細(xì)菌單一培養(yǎng)技術(shù)。更重要的是，這種方法能夠抵抗外來(lái)微生物的污染，在不用抗生素或其他化學(xué)選擇壓力情況下，可連續(xù)生產(chǎn)超過5個(gè)月。

納米技術(shù)與合成生物學(xué)的結(jié)合是光驅(qū)動(dòng)細(xì)胞工廠發(fā)展的一種新策略。這個(gè)方法能夠通過納米顆粒的加入改變藍(lán)細(xì)菌NADPH的供給，從而改善細(xì)胞工廠的性能。Velmurugan等［141］研究了金屬氧化物對(duì)集胞藻產(chǎn)乙醇的影響，發(fā)現(xiàn)金屬氧化物有可能在電子供體存在下產(chǎn)生NADPH，從而改善藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量。這種乙醇合成的增強(qiáng)可以歸因于乙醇合成途徑中NADPH可獲得性增加以及相關(guān)碳代謝途徑的重新定向。工程菌株在最優(yōu)光照強(qiáng)度和添加NADP與MgO條件下，可在25 d內(nèi)積累乙醇5100 mg/L，比對(duì)照高2倍。該研究表明了用金屬氧化物介導(dǎo)的藍(lán)細(xì)菌胞外NADPH再生并增加細(xì)胞工廠產(chǎn)量的可行性。

7 總結(jié)

在“碳達(dá)峰”“碳中和”的“雙碳”目標(biāo)的導(dǎo)引下，開發(fā)高效、低成本綠色環(huán)保的新技術(shù)是至關(guān)重要的保障。藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠由于自身特點(diǎn)在生產(chǎn)能源、制造非能大宗化學(xué)品、消除碳排放方面都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。在當(dāng)前的“雙碳”背景下，藍(lán)細(xì)菌合成生物學(xué)面臨著新的機(jī)遇，正在迎來(lái)新一輪的發(fā)展浪潮。聚球藻作為藍(lán)細(xì)菌底盤典型代表，在多樣性、適應(yīng)性、生長(zhǎng)代謝潛能、基因操作技術(shù)成熟度等方面都有很大的潛在優(yōu)勢(shì)。聚球藻底盤開發(fā)的挑戰(zhàn)在于其生產(chǎn)強(qiáng)度和抗逆能力不能滿足應(yīng)用的需求。在聚球藻的底盤化開發(fā)中，應(yīng)該瞄準(zhǔn)效率和抗逆的核心問題，在光能捕捉、碳固定、生長(zhǎng)速率、抗逆、進(jìn)化、高效使能技術(shù)等方面重點(diǎn)攻關(guān)尋求突破，以充分挖掘釋放聚球藻的代謝潛能。