響應(yīng)面優(yōu)化提取胡蘿卜葉原花青素的工藝研究

黃聰亮，李淑云，陳建福

胡蘿卜為二年生草本植物，以肉質(zhì)根為蔬菜，在我國(guó)多地均有種植。胡蘿卜肉質(zhì)根采收后的其葉未被充分綜合利用或直接拋棄，這樣既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。研究證實(shí)，胡蘿卜葉富含維生素、原花青素、黃酮和多酚等多種成分，具有一定的功效[1]。原花青素是一類(lèi)花青素類(lèi)物質(zhì)的聚合物，廣泛存在各種植物的種子、葉子、果實(shí)、花和皮、殼等處，具有清除自由基、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、保護(hù)生殖功能、調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝等生理活性[2]。提取原花青素的方法主要有溶劑法、超聲輔助法、超臨界提法、雙水相萃取法、酶法等方法，均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[3]，其中超聲波輔助法由于其操作簡(jiǎn)單、低溫高效和安全性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用[4]。本文以胡蘿卜葉為原料，采用超聲波輔助對(duì)其中原花青素的提取工藝進(jìn)行研究，考察工藝因素(超聲時(shí)間、乙醇濃度、液料比和超聲溫度)對(duì)胡蘿卜葉原花青素提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，為胡蘿卜葉的開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

胡蘿卜葉，采購(gòu)于漳州市赤湖蔬菜基地；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于南京都萊生物技術(shù)有限公司；香草醛(香蘭素，分析純)購(gòu)于西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、甲醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； UV-200型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用香草醛-鹽酸法，繪制得到原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.199 7X+0.002 9(R2=0.999 2)；其中Y表示吸光度，X表示原花青素質(zhì)量濃度。

1.2.2 原花青素的超聲波輔助提取工藝 將胡蘿卜葉浸泡在水槽中，沉淀泥沙，再用清水淋洗2-3次，攤開(kāi)瀝水，于50 ℃干燥箱烘干，粉碎過(guò)篩后備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g的胡蘿卜葉粉末，裝入100 mL圓底燒瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，加入乙醇溶液后，在固定功率100 W的超聲波清洗器中提取，提取完畢抽濾，冷卻，吸取1 mL濾液至10 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，作為樣液備用。樣液代替原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定吸光度，將標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的原花青素濃度代入下列式子，計(jì)算得到胡蘿卜葉原花青素的提取率。

式中：X為樣液中原花青素質(zhì)量濃度,mg/mL；V為樣液定容后體積,mL；K為稀釋倍數(shù)；m為胡蘿卜葉質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)工藝因素(超聲時(shí)間、乙醇濃度、液料比和超聲溫度)對(duì)胡蘿卜葉原花青素提取率的影響，固定液料比25 mL/g，乙醇濃度85%和超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間為20、25、30、35、40、45 min，固定超聲時(shí)間35 min，液料比25 mL/g和超聲溫度60 ℃,乙醇濃度為70、75、80、85、90、95%，固定超聲時(shí)間35 min，乙醇濃度85%和超聲溫度60 ℃,液料比為10、15、20、25、30、35 mL/g，固定超聲時(shí)間35 min，液料比25 mL/g和乙醇濃度80%，超聲溫度50、55、60、65、70、75 ℃。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面因素及水平

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，以獲得最優(yōu)提取工藝條件[5]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用Excel軟件和Design-Expert.V.8.0.6.1軟件，分別對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，單因素變化趨勢(shì)圖、建立線性回歸方程、判斷模型顯著性。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 不同因素對(duì)胡蘿卜葉原花青素提取率的影響

不同因素對(duì)胡蘿卜葉原花青素提取率的影響見(jiàn)圖1。從圖1(1)可看出，提取率隨超聲時(shí)間的增加而急劇上升， 35 min達(dá)到最高，但時(shí)間繼續(xù)推移，提取率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。其原因可能是到達(dá)一定時(shí)間后，溫度持續(xù)上升加快分子間運(yùn)動(dòng)，原花青素便緩慢溶解出來(lái)；而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)高溫度破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，還夾帶著其他雜質(zhì)溶出，原花青素提取率就降低[6]。因此，確定35 min為最優(yōu)的超聲時(shí)間。從圖1(2)可看出，提取率隨乙醇濃度的增加而急劇上升，乙醇濃度為85%達(dá)到最高，但乙醇濃度繼續(xù)增大，提取率反而逐漸下降。其原因可能是過(guò)高的乙醇濃度，使某些醇溶性、脂溶性雜質(zhì)溶出量增加，與原花青素產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)溶出，導(dǎo)致提取率的下降[7]。因此，確定85%為最優(yōu)乙醇濃度。從圖1(3)可看出，提取率隨液料比的增加而急劇上升，但液料比到達(dá)25 mL/g后提取率增加不明顯。其原因可能是乙醇量到達(dá)一定數(shù)量時(shí)，反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；少量的溶劑容易飽和溶液，無(wú)法完全提取有效成分，而過(guò)量的溶劑既浪費(fèi)溶劑又增加雜質(zhì)的含量，綜合考慮確定20 mL/g為最優(yōu)的液料比。從圖1(4)可看出，提取率隨超聲溫度的增加而上升， 60 ℃達(dá)到最高，但溫度持續(xù)升高，提取率迅速下降。其原因可能是溫度持續(xù)升高，原花青素的熱不穩(wěn)定性破壞其結(jié)構(gòu)，損失有效的活性成分，降低提取率。因此，確定60 ℃為最優(yōu)的超聲溫度。

圖1 不同因素對(duì)胡蘿卜葉原花青素提取率的影響

2.2 胡蘿卜葉原花青素提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立與顯著性分析 按照1.2.4設(shè)計(jì)表進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，共得29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為中心點(diǎn)，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到超聲波輔助提取胡蘿卜葉原花青素的多元二次線性回歸方程為：

Y=53.59+0.31A-0.043B+5.71C+1.66D+0.29AB+1.04AC-0.40AD-1.56BC+1.43BD-0.13CD-3.60A2-4.39B2-4.60C2-6.05D2

式中：Y為胡蘿卜葉原花青素提取率的預(yù)測(cè)值；A、B、C、D分別代表超聲時(shí)間、乙醇濃度、液料比和超聲溫度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示，該模型F值=1459.12且P<0.0001，表明該模型極顯著；失擬P=0.1203 (>0.05)，差異不顯著。模型的確定系數(shù)R2=0.9993，調(diào)整系數(shù)R2=0.9986，說(shuō)明建立的模型能夠解釋99.86%響應(yīng)值的變化，且有99.93%來(lái)源于所選變量。除了一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AB影響顯著和一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)CD影響不顯著之外，一次項(xiàng)C、D，交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均影響極顯著，表明各因素與響應(yīng)值之間不僅僅是線性關(guān)系。觀察方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以看出，影響提取率的因素主次順序依次為液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間、乙醇濃度。

2.2.2 等高線圖及響應(yīng)曲面圖分析 使用Design-Expert. V8.0.6.1軟件繪制得到的等高線圖和響應(yīng)曲面見(jiàn)圖2。

圖2 等高線圖及響應(yīng)曲面圖

圖2(1)反映了當(dāng)液料比為25 mL/g和超聲溫度為60 ℃時(shí)，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)或乙醇濃度的增大，原花青素提取率呈拋物線軌跡先增大后減小。等高線的形狀趨于橢圓，響應(yīng)面坡度較陡，表明超聲時(shí)間和乙醇濃度兩因素交互作用較為明顯。在曲面圖中乙醇濃度的變化幅度平緩且在等高線圖中軸向等高線較稀疏，說(shuō)明原花青素提取率受超聲時(shí)間的敏感程度更大。圖2(2)反映了當(dāng)乙醇濃度為85%和超聲溫度為60 ℃時(shí)，隨著超聲時(shí)間或者液料比的增加，原花青素提取呈現(xiàn)先增加而后下降的趨勢(shì)。等高線密集且呈現(xiàn)橢圓，響應(yīng)面坡度陡峭，表明超聲時(shí)間和液料比兩因素交互強(qiáng)度大。曲面圖里中液料比的變化坡度大，等高線圖中超聲時(shí)間的軸向等高線相對(duì)稀疏，說(shuō)明原花青素提取率對(duì)液料比的敏感程度較大。圖2(3)反映了當(dāng)乙醇濃度為85%和液料比為25 mL/g時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)或者超聲溫度的適度提高，原花青素提取率出現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律。等高線較密集且呈現(xiàn)橢圓，響應(yīng)面坡度較陡，表明超聲時(shí)間和超聲溫度兩因素交互強(qiáng)度大。超聲溫度在曲面圖里中變化坡度大，在等高線圖中軸向等高線密集，說(shuō)明超聲溫度對(duì)原花青素提取率的敏感度較大。圖2(4)反映了當(dāng)超聲時(shí)間為35 min和超聲溫度為60 ℃時(shí)，一定范圍內(nèi)原花青素提取率隨液料比或者乙醇濃度的提高而增大，加大劑量后，提取率稍有減小。等高線密集且呈現(xiàn)橢圓，響應(yīng)面坡度陡峭，表明乙醇濃度和液料比兩因素交互強(qiáng)度大。在曲面圖里中，乙醇濃度的變化平緩，說(shuō)明液料比對(duì)原花青素提取率的影響更大。圖2(5)反映了當(dāng)超聲時(shí)間為35 min和液料比為25 mL/g時(shí)，固定乙醇濃度(或較低溫度下)時(shí)，原花青素提取率隨著溫度的升高(或乙醇濃度的增大)先增大而后明顯減小。等高線呈現(xiàn)橢圓，響應(yīng)面坡度陡峭，表明乙醇濃度和液料比兩因素交互強(qiáng)度大。超聲溫度的曲面坡度較陡且軸向等高線密集，說(shuō)明超聲溫度對(duì)原花青素提取率的敏感度更大。圖2(6)反映了當(dāng)超聲時(shí)間為35 min和乙醇濃度為85%時(shí)，當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，隨著液料比的增大，提取率先增大后減??；當(dāng)液料比較高時(shí)，適當(dāng)提高溫度可以使提取效果有效增強(qiáng)。等高線的形狀偏向圓形，響應(yīng)面坡度小，表明液料比和超聲溫度兩因素交互作用弱。超聲溫度的變化曲線明顯較陡，且等高線圖中軸向等高線較密，說(shuō)明超聲溫度對(duì)原花青素提取率的影響比液料比的影響更顯著。

2.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證

響應(yīng)面優(yōu)化提取胡蘿卜葉原花青素的最優(yōu)工藝條件為：超聲時(shí)間35.63 min、乙醇濃度84.52%、液料比20.25 mL/g、超聲溫度60.57 ℃，此條件下原花青素提取率預(yù)測(cè)值為55.56 mg/g。為符合實(shí)際操作，特將最優(yōu)提取條件微調(diào)為：36 min的超聲時(shí)間、85%的乙醇濃度、20 mL/g的液料比、61 ℃的超聲溫度，進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所測(cè)得提取率的平均值為54.75 mg/g，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差只有1.46%，驗(yàn)證該方法預(yù)測(cè)胡蘿卜葉中原花青素的實(shí)際提取率的可靠性，具有實(shí)際應(yīng)用性。

3 結(jié) 論

單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化胡蘿卜葉原花青素提取工藝，得到液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度、乙醇濃度和液料比、乙醇濃度和超聲溫度以及二次項(xiàng)均表現(xiàn)為極顯著，超聲時(shí)間、超聲時(shí)間和乙醇濃度對(duì)提取率的影響也達(dá)到顯著水平，乙醇濃度、液料比和超聲溫度對(duì)原花青素提取率的影響不顯著，且因素間的主次關(guān)系依次為液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間、乙醇濃度。同時(shí)，胡蘿卜葉原花青素最優(yōu)提取工藝條件為：超聲時(shí)間35.63 min、乙醇濃度84.52%、液料比20.25 mL/g、超聲溫度60.57 ℃，理論提取率為55.56 mg/g。實(shí)際微調(diào)工藝條件：超聲時(shí)間36 min、乙醇濃度85%、液料比20 mL/g和超聲溫度61 ℃，實(shí)際提取率為54.75 mg/g，與理論值相對(duì)誤差為1.46%，驗(yàn)證了最優(yōu)提取工藝的有效性，為胡蘿卜葉原花青素資源利用與研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳建福, 胡澤杰, 潘詩(shī)玲, 等. 超聲波輔助雙水相提取胡蘿卜葉總黃酮的工藝研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2018,39(1): 82-77.

[2] 謝明勇, 殷軍藝, 聶少平. 胡蘿卜多糖結(jié)構(gòu)與功能及其在食品加工過(guò)程中的變化[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 16(4):1-9.

[3] 張星和, 楊曉娜. 原花青素提取方法進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè), 2014,8(30):154-155.

[4] Vilkhu K, Mawson R, Simons L, et al. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry-A review[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008, 9(2):161-169.

[5] 陳建福, 鐘艷琴, 曾小芳,等. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取胡蘿卜葉總黃酮的工藝研究. 中國(guó)食品添加劑, 2017, 28(10): 66-72.

[6] 張曉娟, 李艷, 張玉濤. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取葡萄皮中原花青素工藝[J]. 糧食與油脂, 2017, 30(11):96-100.

[7] 蘭佳佳, 楊希娟, 黨斌,等. 蠶豆皮中原花青素的提取工藝優(yōu)化及品種間含量差異與抗氧化活性評(píng)價(jià)[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2017, 31(11):2164-2174.