代謝組學(xué)在冠心病中醫(yī)證候中的研究進(jìn)展※

張宜帆 周曼麗 羅曉欣 趙彥禛 周霞輝 俞赟豐 簡維雄▲

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atheroscle?rotic heart disease，CHD，簡稱“冠心病”）是冠狀動(dòng)脈阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。根據(jù)《中國心血管病報(bào)告2018》[1]推算，冠心病的現(xiàn)患人數(shù)達(dá)到1100 萬且持續(xù)增長，死亡人數(shù)繼續(xù)保持上升趨勢。中醫(yī)學(xué)在遵循整體觀念和辨證論治兩大原則的前提下，結(jié)合西醫(yī)客觀指標(biāo)對冠心病的發(fā)生、發(fā)展、演變進(jìn)行研究探索，更好地反映了證候的本質(zhì)及演變規(guī)律，這也對疾病診斷及轉(zhuǎn)歸的判斷有重要的指導(dǎo)意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，冠心病的發(fā)生發(fā)展常伴隨某些代謝障礙，這也給冠心病中醫(yī)證候客觀化研究提供了新的研究思路。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)中的重要組成部分，它所強(qiáng)調(diào)的整體性觀察、系統(tǒng)性分析與中醫(yī)辨證中“整體觀念”“因時(shí)制宜”等理念有相通性。因此，代謝組學(xué)在中醫(yī)證候中的應(yīng)用將會(huì)促進(jìn)中醫(yī)學(xué)的現(xiàn)代化發(fā)展。本文對近年來冠心病中醫(yī)證候相關(guān)代謝組學(xué)的研究進(jìn)展綜述如下。

1 代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)（Matebonomics）是繼蛋白組學(xué)和基因組學(xué)之后新近發(fā)展而來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。英國帝國理工學(xué)院的Jeremy Nicholson教授于1999年首次提出了代謝組學(xué)的概念。代謝組學(xué)是對某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科。

代謝組學(xué)的研究對象是分子量小于1000 的小分子代謝產(chǎn)物[2]，通過研究分析檢測尿液、血漿或血清、腦脊液、唾液等生物體液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)液和組織等參與人體生命活動(dòng)的代謝產(chǎn)物[3]，來探究人體所處的健康狀態(tài)以及疾病所處的階段。

目前，代謝組學(xué)的研究方法主要有核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spec?trometry，GC-MS）等技術(shù)[4]。每一種研究技術(shù)都存在一定的優(yōu)、缺點(diǎn)。NMR 技術(shù)無需樣本前處理，可進(jìn)行多參數(shù)監(jiān)測且快速，具有非破壞性，是唯一可以用于活體檢測的技術(shù)[5]。但是，NMR 技術(shù)的靈敏度和檢測技術(shù)范圍相對其它方法還有一定的提升空間[6]。GCMS 技術(shù)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的選擇性，其分離效率高，成本低廉且耐用。但是由于它的分析物只能是具有揮發(fā)性的物質(zhì)，因此對分析物需要復(fù)雜的衍生化前處理[7]。LC-MS 技術(shù)無需復(fù)雜的衍生化前處理，其有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，技術(shù)更完善，處理分析速度更快，應(yīng)用范圍也更廣泛[8]。但LC-MS 技術(shù)仍存在MS 技術(shù)共有的屬于破壞性檢測、不能用于活體檢測等問題。

2 代謝組學(xué)與冠心病的中醫(yī)證候

冠心病在中醫(yī)學(xué)上屬于“胸痹”“真心痛”等范疇。早在漢代，《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》就有“胸痹之病，喘息咳唾，胸背痛，短氣，寸口脈沉而遲，關(guān)上小緊數(shù)”“胸痹不得臥，心痛徹背”等記載[9]。由于人們生活、飲食習(xí)慣的變化，冠心病的發(fā)病率和死亡率越來越高，中醫(yī)治未病思想呼吁學(xué)者們尋找客觀化的生物標(biāo)志物對冠心病不同證型進(jìn)行早診斷、早干預(yù)。近年來越來越多的研究開始涉及代謝組學(xué)的領(lǐng)域，代謝組學(xué)技術(shù)與以往用單一指標(biāo)或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)分析疾病的方法不同[10]，其通過代謝組學(xué)技術(shù)綜合分析患者或動(dòng)物模型的血漿或尿液等多種通路下的代謝產(chǎn)物，有助于發(fā)現(xiàn)不同證型的特殊生物標(biāo)記物，加強(qiáng)對疾病發(fā)展過程中物質(zhì)代謝的了解[11]，促進(jìn)疾病證型診斷的客觀化。Joanne T Brindle等[12]基于氫核磁共振（1H-NMR）技術(shù)正確診斷出冠心病的存在，同時(shí)還判斷出其嚴(yán)重性，因此代謝組學(xué)以其自身的優(yōu)勢將在中醫(yī)證候診斷中的應(yīng)用越來越廣泛。

胸痹病性多屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。本虛多為氣虛、陰虛、陽虛，標(biāo)實(shí)多為氣滯、血瘀、痰濁、寒凝。其主要證型有：心血瘀阻證、痰濁閉阻證、氣滯心胸證、氣陰兩虛證、心腎陰虛證等[9]。

2.1 心血瘀阻證

2.1.1 臨床研究 簡維雄等[13]用質(zhì)譜法分析冠心病心血瘀阻證患者血漿層面代謝途徑，總結(jié)發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證患者血漿代謝產(chǎn)物譜中有花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、檸檬酸、β-羥基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸等物質(zhì)，同時(shí)存在脂質(zhì)代謝、糖代謝紊亂。與此類似，鄭景輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解和糖異生、丙酸代謝、脂肪酸生物合成通路參與心血瘀阻證病變過程。華何與等[15]比較了冠心病心血瘀阻證患者與健康人的血漿代謝組學(xué)變化，分析發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證患者的血漿1H-NMR代謝譜與正常人相比有顯著差異，這些差異主要涉及能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝，值得注意的是，心血瘀阻證患者存在更明顯的脂質(zhì)代謝紊亂。以NMR技術(shù)對冠心病患者和健康人血漿樣本中共有的39種內(nèi)源性代謝物檢測分析[16]，研究發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證的冠心病患者存在異常氨基酸代謝及異常脂質(zhì)代謝，并通過篩選獲得2種可能與冠心病血瘀證相關(guān)的特征性代謝產(chǎn)物：結(jié)氨酸和丙酮。在尿液代謝組學(xué)研究中，通過質(zhì)譜方法，簡維雄等[17]比對心血瘀阻證組和非心血瘀阻證組、健康組3組尿液代謝產(chǎn)物，運(yùn)用GC-MS 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證患者尿液生物代謝產(chǎn)物譜中有葡萄糖、甘油、木糖醇、馬尿酸、油酸酰胺、丙酮等代謝物；同時(shí)發(fā)現(xiàn)心血瘀阻證的患者存在異常脂質(zhì)代謝。在此研究基礎(chǔ)上陳夏等[18]通過檢索MetPA、KEGG、HMDB 等數(shù)據(jù)庫的生物學(xué)信息，探究心血瘀阻證冠心病患者尿液代謝過程，發(fā)現(xiàn)半乳糖代謝、酮體的合成和降解通路參與心血瘀阻證病變過程。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)研究 牟菲等[19]通過GC-MS比較分析假手術(shù)組與冠心病心血瘀阻證大鼠血清內(nèi)源性代謝物差異，發(fā)現(xiàn)了與糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝通路相關(guān)的14 個(gè)潛在的生物標(biāo)志物存在代謝異常，這些標(biāo)志物有蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、棕櫚油酸、十七酸、硬脂酸、花生四烯酸等。與其結(jié)果相似的是，Qi Qiu等[20]研究冠心病血瘀證大鼠模型的血漿代謝產(chǎn)物，用GC-MS技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)L-絲氨酸等氨基酸代謝物以及丙酸、丁酸等脂質(zhì)代謝物水平升高，而檸檬酸、cAMP、丙氨酸、左旋纈氨酸、左旋絲氨酸、十六烷酸和十八烷酸等11 個(gè)潛在的與脂肪酸代謝、能量相關(guān)代謝、氨基酸代謝、糖代謝相關(guān)的生物標(biāo)志物水平降低。對比冠心病血瘀證患者，研究者發(fā)現(xiàn)動(dòng)物模型與臨床患者的代謝組學(xué)指標(biāo)變化呈現(xiàn)相同趨勢。在尿液代謝組學(xué)研究中，通過質(zhì)譜方法，李靜等[21]檢測冠心病血瘀證大鼠模型組尿液代謝物，與假手術(shù)組對比后發(fā)現(xiàn)血瘀證模型組有36 種差異代謝產(chǎn)物表達(dá)水平紊亂，涉及丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸代謝紊亂，磷酸戊糖途徑、糖酵解/糖異生異常等多條糖代謝紊亂以及嘌呤代謝紊亂、脂質(zhì)代謝異常等。在心肌組織代謝組學(xué)研究中，孫安會(huì)等[22]運(yùn)用GC/TOF-MS分析冠心病血瘀證大鼠心肌組織代謝物發(fā)現(xiàn)，冠心病急、慢性血瘀證組大鼠心肌組織代謝譜在能量代謝中重要的糖酵解、脂肪酸代謝和檸檬酸循環(huán)等代謝通路與正常對照組對比存在明顯差異，具體而言氨基酸類（如：甘氨酸）、核苷酸類（如：環(huán)磷酸腺苷）在血瘀證大鼠血漿中均出現(xiàn)上調(diào)，有機(jī)酸類（如：谷氨酸）、糖類（如：果糖、6-磷酸果糖）均出現(xiàn)下調(diào)。這說明血瘀證會(huì)導(dǎo)致能量代謝途徑的異常，影響ATP 的生成，致使心肌細(xì)胞能量供應(yīng)不足。與此類似，夏世靖等[23]在探究不同程度血瘀證組大鼠心肌能量代謝特點(diǎn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，冠心病血瘀證組大鼠均出現(xiàn)與能量代謝相關(guān)的生物標(biāo)志物降低，血瘀證程度與能量代謝障礙程度存在相關(guān)性。

2.2 痰濁閉阻證

2.2.1 臨床研究 朱明丹等[24]收集分析冠心病痰阻心脈證、氣陰兩虛證、氣滯血瘀證患者的血漿樣本，研究發(fā)現(xiàn)痰阻心脈證組的葡萄糖含量比氣滯血瘀組高。程鵬等[25]用GC-MS 技術(shù)探究冠心病痰凝心脈證患者與心氣虛證患者的血清代謝產(chǎn)物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)痰凝心脈證組絲氨酸、2-羥基丙酸顯著高于氣虛證組。劉羽茜等[26]比較了冠心病脾虛痰濁證患者與健康人血清代謝組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)脾虛痰濁證患者亮氨酸、組氨酸、維生素A、植物鞘氨醇、鞘氨醇、左旋肉堿含量大于健康組，說明痰濁證患者的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、維生素代謝、嘌呤代謝存在紊亂。運(yùn)用MS 技術(shù)對比痰濁證和血瘀證患者與健康人血清代謝組學(xué)差異，鹿小燕等[27]研究發(fā)現(xiàn)痰濁證組和血瘀證組在有機(jī)酸（蘋果酸、琥珀酸）、氨基酸類（甘氨酸、丙氨酸）、糖類（果糖、葡萄糖）及脂肪酸（棕櫚烯酸）等代謝產(chǎn)物上存在顯著差異。在血清、尿液等代謝產(chǎn)物的研究中，陳浩等[28]用LC-MS 技術(shù)探究冠心病氣虛血瘀證與氣虛血瘀痰濁證患者差異代謝物，發(fā)現(xiàn)馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯可能為痰濁證的潛在代謝標(biāo)志物。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)研究 張蕾等[29]基于NMR技術(shù)分析冠心病痰濁證大鼠模型血漿代謝變化，發(fā)現(xiàn)模型組較正常組VLDL、VLDL/LDL、HDL/LDL、LDL 均明顯增高，乳酸、醋酸、丙酮、3-HB、甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、葡萄糖等含量上調(diào)，HD、膽堿、磷脂酰膽堿、甘油磷脂酰膽堿、不飽和脂肪酸含量下降。值得注意的是，乳酸、醋酸、丙酮等脂代謝重要的中間產(chǎn)物以及丙氨酸、谷氨酸等氨基酸代謝產(chǎn)物含量變化顯著。

2.3 氣陰兩虛證

2.3.1 臨床研究 基于MS 技術(shù)，朱子勤等[30]對糖尿病冠心病氣陰兩虛證和陽虛證患者血漿分析，發(fā)現(xiàn)這兩種證型患者在氨基酸代謝、嘌呤代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)、線粒體中脂肪酸延長等多個(gè)代謝通路存在差異。與此類似，李宜等[31]通過比較冠心病不同證型患者共有的34 種血清內(nèi)源性代謝物的差異，發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證組患者與能量代謝相關(guān)的丙氨酸、乳酸，糖代謝相關(guān)的葡萄糖、β-葡萄糖及脂類相關(guān)的高密度脂蛋白等含量升高，而纈氨酸、膽堿磷酸、氧化三甲胺含量降低。另一項(xiàng)課題[24]在對冠心病痰阻心脈證、氣滯血瘀證、氣陰兩虛證患者血漿代謝產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證患者血漿樣本中苯丙氨酸、甘氨酸、高絲氨酸、葡萄糖、磷酸肌酸含量較低，這些指標(biāo)異常提示氨基酸代謝及能量代謝可能在冠心病氣陰兩虛證的病理過程中起重要作用。其中能量代謝類似于氣的推動(dòng)作用，能量代謝異常與氣血運(yùn)行不暢相關(guān)，符合冠心病氣陰兩虛證的發(fā)病機(jī)制。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)研究 Bei Yan等[32]建立心血瘀阻證和氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型，基于GC-MS 技術(shù)分析兩種證型大鼠血漿中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證組2-羥基丁酸和2-氨基丁酸顯著升高，而焦谷氨酸、谷氨酸、透明質(zhì)酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和鳥氨酸等顯著降低。同時(shí)，心血瘀阻證與氣陰兩虛證大鼠血漿中纈氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、2，5-二氨基戊內(nèi)酰胺、鳥氨酸、羥脯氨酸、賴氨酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、呋喃半乳糖、肌醇等代謝物指標(biāo)存在顯著差異。

3 小結(jié)與展望

由于代謝組學(xué)研究方法與中醫(yī)證候診斷的相似性，代謝組學(xué)這一新興學(xué)科在中醫(yī)學(xué)中的研究成為當(dāng)代的熱點(diǎn)。代謝組學(xué)檢測分析發(fā)現(xiàn)的疾病發(fā)展過程中代謝產(chǎn)生的特殊內(nèi)源性小分子生物標(biāo)志物也在為中醫(yī)學(xué)證型診斷的現(xiàn)代化發(fā)展提供基礎(chǔ)和研究方向。代謝組學(xué)在冠心病中醫(yī)證候中的研究結(jié)果提示，冠心病患者的血漿、尿液及心肌組織代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化，這些代謝產(chǎn)物主要與氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝、脂肪酸代謝等代謝通路紊亂密切相關(guān)。綜合分析不同證型的代謝組學(xué)變化，可以發(fā)現(xiàn)不同證型患者的代謝指標(biāo)紊亂程度也有所不同，這有助于為冠心病辨證分型及程度判斷提供客觀標(biāo)準(zhǔn)。

然而，代謝組學(xué)在冠心病中醫(yī)證型中的應(yīng)用仍存在一些問題。首先，融合于中國傳統(tǒng)文化中的中醫(yī)學(xué)，有著獨(dú)特的理論體系，中醫(yī)辨證的思路方法要想與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合，通過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對中醫(yī)學(xué)辨證理論加以闡釋實(shí)屬不易。其次，人作為一個(gè)有機(jī)整體，往往呈現(xiàn)復(fù)雜多變性，疾病的不同階段總是多個(gè)中醫(yī)證型的集合體，同時(shí)就某一階段而言，證型也存在標(biāo)本緩急之分，用生物醫(yī)學(xué)指標(biāo)去解釋判定復(fù)雜的中醫(yī)證型仍存在很多困難。因此，如何排除兼證在證型診斷中造成的差異或如何準(zhǔn)確診斷復(fù)雜的中醫(yī)證型還有待進(jìn)一步研究。再者，中醫(yī)辨證與醫(yī)生個(gè)人主觀經(jīng)驗(yàn)相關(guān)，證型的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未完善；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，雖然模型動(dòng)物的證型可控性較臨床患者更高，但是不同造模方式也會(huì)對證型的準(zhǔn)確性造成一定的影響，這也呼吁盡早建立中醫(yī)證型的規(guī)范化診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，作為發(fā)展時(shí)間短的新興組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)技術(shù)尚未完善，代謝物的多樣性也在呼吁不同疾病分類的數(shù)據(jù)庫的建立以利于疾病證型的統(tǒng)計(jì)分析。然而，事物的發(fā)展本就是波浪式前進(jìn)、螺旋式上升的過程，中醫(yī)學(xué)走向現(xiàn)代化已是時(shí)代發(fā)展的潮流趨勢。相信隨著技術(shù)的發(fā)展和研究人員的不斷努力，代謝組學(xué)必將成熟地應(yīng)用于冠心病中醫(yī)證候的規(guī)范化診斷乃至整個(gè)中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的證候診斷中。同時(shí)，代謝組學(xué)也將為中醫(yī)學(xué)“治未病”思想的運(yùn)用提供更加準(zhǔn)確客觀的標(biāo)準(zhǔn)，使中醫(yī)學(xué)為更多的人所接受。