活血生骨湯治療激素性股骨頭壞死的分子機(jī)制研究

李 楠 董汝軍

山東省聊城市中醫(yī)醫(yī)院骨科，山東聊城 252000

大劑量長期或短期沖擊應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物引起股骨頭周圍靜脈回流不暢、動(dòng)脈血供不足是激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）的主要發(fā)病原因[1-2]。隨著糖皮質(zhì)激素類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，SONFH的發(fā)病率逐年攀升，已經(jīng)成為臨床最常見的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死類型[3]。SONFH 病程發(fā)展迅速，并且伴隨著嚴(yán)重的髖關(guān)節(jié)疼痛和疾病后期股骨頭塌陷造成的髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。因此，SONFH 的發(fā)病機(jī)制與治療方式已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域?qū)W者的研究熱點(diǎn)。

隨著對SONSH 研究的不斷加深，中醫(yī)藥防治SONFH 取得的療效受到廣泛關(guān)注。SONFH 的中醫(yī)病機(jī)為腎虛血瘀、骨枯髓消，根據(jù)辨證論治的中醫(yī)理論特點(diǎn)，臨床多采用補(bǔ)腎活血、生骨祛瘀類藥物相互配伍。活血生骨湯（專利申請者：李楠，專利題名：活血生骨湯，國別：中華人民共和國，專利號(hào)：ZL201410684814.1，授權(quán)公告號(hào)：CN 104474128 B，專利發(fā)布日期：2018年8月14日）是本課題組前期研究中已獲得國家專利的治療SONFH 的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由當(dāng)歸、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹參、茯苓、枸杞子、紅花、木香、鹿角膠、淫羊藿、羌活、獨(dú)活、白芷、伸筋草、骨碎補(bǔ)、杜仲、甘草等藥物組成，其中丹參活血祛瘀，主治氣滯血瘀之征，淫羊藿補(bǔ)腎壯陽，二者合用，起到活血祛瘀、補(bǔ)腎壯骨之功效。紅花、當(dāng)歸、川芎、鹿角膠、杜仲、枸杞、牛膝發(fā)揮活血通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎的功效。骨碎補(bǔ)、赤芍、茯苓散瘀消腫、緩急止痛，獨(dú)活、羌活、防己、白芷可祛風(fēng)止痛，木香行氣止痛，伸筋草祛風(fēng)濕、舒筋活絡(luò)，諸藥合用可改善局部疼痛、活動(dòng)受限等癥狀，共奏補(bǔ)腎活血、生骨祛瘀之功效。為了進(jìn)一步闡釋活血生骨湯治療SONFH 具體的藥理學(xué)作用與分子機(jī)制，本研究基于生物信息學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，整合篩選高通量數(shù)據(jù)，并采用分子對接技術(shù)驗(yàn)證潛在有效成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性，探討活血生骨湯治療SONFH 的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 獲取與篩選藥物成分

借助BATMAN-TCM 藥物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫[4]（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），以“當(dāng)歸、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹參、茯苓、枸杞子、紅花、木香、鹿角膠、淫羊藿、羌活、獨(dú)活、白芷、伸筋草、骨碎補(bǔ)、杜仲、甘草”作為檢索詞，檢索活血生骨湯的有效活性成分及相關(guān)潛在靶點(diǎn)。參數(shù)設(shè)置“藥物-靶點(diǎn)”相似性模型分?jǐn)?shù)Score cutoff ≥20，AdjP-value ≤0.05，分析篩選獲得活血生骨湯的有效活性成分及相關(guān)潛在靶點(diǎn)。

1.2 獲取疾病差異基因

利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO），檢索詞“steroid-induced osteonecrosis of the femoral head”，篩選并下載SONFH 相關(guān)芯片GSE123568 原始數(shù)據(jù)。使用R 語言Affy 軟件包及l(fā)imma 軟件包進(jìn)行強(qiáng)制歸一化處理，并篩選差異表達(dá)基因，設(shè)置差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）為|log2FC|≥1，P值<0.01，采用heatmap 軟件包繪制聚類圖。

1.3 構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并分析

借助STRING 數(shù)據(jù)庫（http: /string-db.org/），構(gòu)建本研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最大置信數(shù)值（highest confidence）設(shè)置為0.7。獲得的數(shù)據(jù)映射處理后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用Cytoscape 軟件完成PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)度值（degree，DC）確定網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。

1.4 KEGG與GO功能富集分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫[5]（http: //metascape.org/）完成關(guān)鍵靶點(diǎn)的批量基因分析，進(jìn)行基因本體論（gene ontolog，GO）生物學(xué)過程功能富集分析及京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析。通過參考錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）與P值過濾富集結(jié)果，輸出結(jié)果的氣泡圖。

1.5 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，選擇度值（DC）的前10 位作為核心靶點(diǎn)，通過計(jì)算結(jié)合能量、明確結(jié)合鍵位的方式，確定相關(guān)藥物潛在有效成分的結(jié)合活性。

通過PDB 數(shù)據(jù)庫[6]（http: //www.rcsb.org/）獲得靶點(diǎn)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)文件，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，選擇解析度較小的蛋白結(jié)構(gòu)文件。通過Pymol 軟件完成修飾操作后導(dǎo)入Auto dock 軟件，經(jīng)過計(jì)算電荷數(shù)等一系列操作后，后以pdbqt 格式導(dǎo)出。最終借助Autodock Vina 軟件完成分子對接的計(jì)算過程，獲得結(jié)合能數(shù)值。根據(jù)結(jié)合能數(shù)值確定最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象。利用PyMOL 軟件及PLIP 數(shù)據(jù)庫[7]（https: //plip.biotec.tu-dresden.de/）可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 活血生骨湯的潛在活性成分與靶點(diǎn)預(yù)測

通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索及條件篩選后，共獲得活血生骨湯組方中潛在有效成分561 個(gè)，數(shù)據(jù)庫預(yù)測潛在有效成分作用靶點(diǎn)1263 個(gè)。

2.2 SONFH的差異基因

通過GEO 數(shù)據(jù)庫獲得芯片GSE123568 數(shù)據(jù)。芯片共納入了30 個(gè)SONFH 患者樣本及10 個(gè)空白對照樣本。借助R 語言分析工具共獲得717 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因數(shù)為431 個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為286 個(gè)。聚類圖結(jié)果見圖1。

2.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將2.1 與2.2 所獲得的靶點(diǎn)映射處理，共獲得74 個(gè)共有靶點(diǎn)，結(jié)果見圖2。利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建活血生骨湯治療SONFH 的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)50 個(gè)，蛋白互作關(guān)系88 條，其中，度值由高到低排序前十位的靶點(diǎn)分別為MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2，將其定義為此PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖3。

2.4 富集分析結(jié)果

本研究通過Metascape 數(shù)據(jù)庫完成上述PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的富集分析。GO 功能生物學(xué)進(jìn)程分析結(jié)果顯示，相關(guān)靶點(diǎn)在氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞的分化與遷移、細(xì)胞對激素的刺激反應(yīng)、藥物代謝、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)的調(diào)節(jié)等生物學(xué)進(jìn)程上顯著富集。KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，活血生骨湯治療SONFH 的可能關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于催產(chǎn)素信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路及TNF 信號(hào)通路等信號(hào)通路，富集分析結(jié)果見圖4。

2.5 分子對接結(jié)果

選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中前5 位關(guān)鍵靶點(diǎn)完成分子對接驗(yàn)證。分子對接技術(shù)中，大分子與小分子配體的結(jié)合能越低，則其互相產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合相互作用的可能性越大。本研究分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)與潛在活性成分的結(jié)合能均<-5 kCal/mol，產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合相互作用的可能較大。見表1，對接可視化結(jié)果見圖5。

表1 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接結(jié)果

3 討論

隨著糖皮質(zhì)激素類藥物廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療，糖皮質(zhì)激素引發(fā)的繼發(fā)性疾病開始受到關(guān)注。其中，SONFH 已經(jīng)成為股骨頭壞死臨床最為常見的類型，發(fā)病率居非創(chuàng)傷性股骨頭壞死首位。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國SONFH 發(fā)病率占24.1%[8]?；趪鴥?nèi)外股骨頭壞死領(lǐng)域研究的不斷深入，對于SONFH 的致病原因已經(jīng)較為明確，但其病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)階段較為公認(rèn)的血管活性因子異常表達(dá)學(xué)說認(rèn)為，由于糖皮質(zhì)激素的過量使用，造成了股骨頭周圍微環(huán)境中調(diào)控血管生成的活性細(xì)胞因子水平異常，股骨頭部位的血管生成過程受阻，影響了股骨頭周圍供血不良和微循環(huán)降低，缺氧缺血的環(huán)境導(dǎo)致骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡破壞，最終引起股骨頭壞死[9]。

中醫(yī)學(xué)一般將股骨頭壞死歸類于“骨痹”“骨蝕”等范疇，主要是由于腎陽衰微，無以濡養(yǎng)筋骨，骨枯髓消導(dǎo)致的股骨頭病理改變。本研究采用的臨床驗(yàn)方“活血生骨湯”具有補(bǔ)腎活血、生骨祛瘀的功效，臨床用藥基于中醫(yī)辨證論治充分考量患者個(gè)性病情加減化裁，取得了良好的治療效果。由于中藥成分過于復(fù)雜且難以完成定量定性的相關(guān)研究，中藥復(fù)方對于相應(yīng)疾病治療過程的作用機(jī)制并不十分明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)與分子對接的技術(shù)，進(jìn)一步分析了中藥復(fù)方活血生骨湯治療SONFH 的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)與作用通路及其分子作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，活血生骨湯通過白樺脂醇、丹參素和18β-甘草次酸等多種潛在化學(xué)成分，可能作用于MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等蛋白靶點(diǎn)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞的分化與遷移、細(xì)胞對激素的刺激反應(yīng)、藥物代謝、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)和MAPK 級聯(lián)等生物學(xué)進(jìn)程，影響催產(chǎn)素信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等多條通路調(diào)控共同發(fā)揮治療SONFH 的藥理作用。

根據(jù)BATMAN 數(shù)據(jù)庫獲取的成分靶點(diǎn)關(guān)系篩選結(jié)果，關(guān)鍵靶點(diǎn)與白樺脂醇、丹參素、18β-甘草次酸和去氫丹參新酮等成分關(guān)聯(lián)度較高。白樺脂醇廣泛存在于中藥植物類藥物中，具有降脂、抗炎、抗心肌缺血等多種藥理作用[10-11]。白樺脂醇可以明顯抑制血管中的IL-6、TNF-α 等炎癥因子表達(dá)從而改善高脂血癥模型小鼠動(dòng)脈血管的病理學(xué)改變[12]，該過程或與改善脂代謝與血管內(nèi)皮功能失衡及抑制IKKβ/NF-κB 信號(hào)通路減少癥反應(yīng)的級聯(lián)放大有關(guān)。丹參素是中藥丹參的主要水溶性成分，藥物動(dòng)力學(xué)研究已得到證明[13-16]。其保護(hù)心肌細(xì)胞、抗炎、抗血栓形成等作用已得到了廣泛的臨床應(yīng)用。補(bǔ)腎活血湯的多種成分均具有血管新生、抗炎、抗血栓形成和骨組織代謝等作用，其或通過這些成分發(fā)揮對于SONFH 的治療作用。

PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等在網(wǎng)絡(luò)中度值較高且明顯差異表達(dá)，是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MAPK1 作為MAP 激酶信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分，參與到MAPK/ERK級聯(lián)中介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架形成等多種生物學(xué)功能。NOTCH1 存在著對骨吸收的抑制作用，而NOTCH2 在介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成與骨吸收作用方面發(fā)揮作用[17-18]。NOTCH1 在成骨細(xì)胞中的激活會(huì)導(dǎo)致骨形成過程受損。與NOTCH1 作用相反，NOTCH2 通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞核因子激活加速骨細(xì)胞生成。PTGS2 在炎癥反應(yīng)中具有特殊作用，PTSG1 與PTGS2 是諸多非甾體抗炎藥物的靶標(biāo)[19-21]。LRRK2 與帕金森病具有非常密切的關(guān)系[22]，其病理性突變可增加激酶活性，從而加速細(xì)胞的死亡過程。

GO 生物學(xué)功能分析結(jié)果反映了治療過程與氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞的分化與遷移、細(xì)胞對激素的刺激反應(yīng)、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)和MAPK 級聯(lián)等生物學(xué)進(jìn)程具有較高的相關(guān)性。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果中，催產(chǎn)素信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、鈣信號(hào)通路等信號(hào)通路在活血生骨湯SONFH 的治療過程中明顯富集。VEGF 是VEGF 信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，在調(diào)控血管通透性與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝等方面具有重要作用，其作為促血管形成細(xì)胞因子，在骨組織分化、骨基質(zhì)形成與細(xì)胞因子的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[23]。Notch 信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物組織的發(fā)育和維持中起到了傳遞相關(guān)信息的作用。在骨組織中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化與正常功能表達(dá)都需要Notch 信號(hào)通路參與[24]。在骨組織的發(fā)育過程中，細(xì)胞在體內(nèi)受到多個(gè)信號(hào)通路的共同作用，如Notch 信號(hào)通路與Wnt 信號(hào)通路在骨細(xì)胞中存在關(guān)聯(lián)機(jī)制，Wnt 信號(hào)通過誘導(dǎo)Notch 信號(hào)，在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分化與內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了重要的相互作用。還有研究表明，在前體脂肪細(xì)胞分化與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中，Notch 信號(hào)通路也發(fā)揮了重要作用[25]。Notch 信號(hào)通路對骨量動(dòng)態(tài)平衡的維持過程呈雙向調(diào)節(jié)。因此，深入研究Notch 信號(hào)通路在骨代謝方面的具體作用機(jī)制，對于SONFH 發(fā)病機(jī)制的探索和新的治療思路的提出具有重要意義。破骨細(xì)胞分化主要受到RANKL 和免疫受體激活的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，有研究表明，破骨細(xì)胞與免疫系統(tǒng)中的大多數(shù)細(xì)胞相互作用，在某些自身免疫性疾病中，T 細(xì)胞與破骨細(xì)胞均可被異常激活[26-27]。

分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)與其反向?qū)ふ业幕瘜W(xué)有效成分的對接結(jié)合能量均<-5 kCal/mol，這表示潛在活性藥物小分子與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合活性較好。

結(jié)合本研究結(jié)果，獲得了活血生骨湯治療SONFH 的潛在有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)GO 生物學(xué)功能富集分析與KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果，進(jìn)一步討論了活血生骨湯治療SONFH 可能存在的多種生物學(xué)進(jìn)程與相關(guān)的信號(hào)通路。并通過分子對接技術(shù)驗(yàn)證了潛在活性成分與SONFH 關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合效果，明確了SONFH 治療過程可能的作用機(jī)制。綜上，研究基于生物信息學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對活血生骨湯組方治療SONFH 的作用機(jī)制進(jìn)行了探索，但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察研究特定靶點(diǎn)與單體成分在病理過程中的作用。