基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討薏苡附子敗醬散治療結(jié)直腸癌的分子機制研究

呂欣妮 尹佳鈺 錢麗君 金夢潔 方志軍

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210028

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最多見的消化道癌癥，具有高患病率、高病死率的特點[1]。當(dāng)前針對CRC 的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療手段所帶來的副作用嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，若耽誤治療進(jìn)程會縮短生存周期[2]。中醫(yī)藥診治CRC 的優(yōu)勢不容小覷，其治療機制具備靶點多位、療效顯著等特征[3]。薏苡附子敗醬散作為腸道疾病經(jīng)典驗方，始載于《金匱要略》：“腸癰……薏苡附子敗醬散主之”[4]。現(xiàn)代亦有多項研究表明本方治療CRC 在增效減毒、抑制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移方面效果顯著[5]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方式對本方潛在活性化合物多成分、多靶點的作用機制進(jìn)行初步探索，為其深入研究及廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 薏苡附子敗醬散相關(guān)靶點選擇

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）獲得3 味中藥化學(xué)活性成分，依據(jù)口服利用度≥30%和類藥性≥0.18 兩個屬性值篩選獲取其蛋白靶點并統(tǒng)一于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）規(guī)范。

1.2 CRC相關(guān)靶點篩選

以“colorectal cancer”為主題詞，于GeneCards數(shù)據(jù)庫中挖掘CRC 有關(guān)靶點，再根據(jù)Score 值的大小篩選核心靶點。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

用Venny 2.1 軟件得到藥物疾病交集靶點，將交集靶點粘貼至String 11.0，生物種類選人類，設(shè)置中等置信度（≥0.9），其余參數(shù)不變，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果以TSV 格式上傳至可視化軟件行拓?fù)浞治觯瑩?jù)靶點的度值篩選核心基因，度值大小與其在PPI 中的重要程度呈正比[6]。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能分析和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

把本方治療CRC 靶點輸入Metascape 在線平臺，設(shè)定P< 0.01，進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路富集分析，并將所得信息可視化。

1.5 藥物成分-CRC靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的建立

借助CytoScape 3.9.0 建立藥物成分-CRC 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并分析有效成分及靶點的介度、連接度和緊密度等，根據(jù)數(shù)值確定核心靶點以及關(guān)鍵生物學(xué)通路。

2 結(jié)果

2.1 薏苡附子敗醬散的活性成分

薏苡仁化學(xué)成分38種、附子65種、敗醬草52種，篩選后得薏苡仁6 種、附子10 種、敗醬草11 種活性成分，見表1。薏苡仁成分對應(yīng)靶點40個、附子282個、敗醬草323 個，歸并去重后共獲得靶點367 個。

表1 薏苡附子敗醬散的活性成分

2.2 CRC相關(guān)靶點的獲取

于GeneCards 獲取CRC 相關(guān)靶點10 746 個。為獲得相關(guān)度更高的靶點，求三次中位數(shù)，設(shè)Score>11.05 篩選得到1347 個CRC 疾病有關(guān)靶點。

2.3 交集靶點的獲取及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過韋恩圖獲取151 個共同靶點基因作為本方抗CRC 的藥效靶點，見圖1。將交集靶點導(dǎo)入String 11.0 建造PPI，見圖2。將PPI 文件做可視化處理，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)有151 個節(jié)點和6788 條邊。拓?fù)浞治龊髶?jù)度值由大到小前五位分別為腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、MYC 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）作為本方治療CRC 的核心靶點。

2.4 靶點功能與通路的富集分析

將151 個交集靶點輸入Metascape 平臺做GO功能分析和KEGG 通路富集分析。其中生物過程有1238 條，主要與細(xì)胞對無機物的反應(yīng)、蛋白磷酸化、對氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡信號通路等相關(guān)。細(xì)胞組分有445 條，主要包括膜筏、激素受體復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)合物、染色體區(qū)。分子功能有783 條，涉及蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、酪氨酸激酶結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。KEGG通路分析結(jié)果呈現(xiàn)總牽涉通路268 條，主要富集在癌癥通路、乙型肝炎、PI3K-Akt、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號通路等。選取P值前20 位關(guān)聯(lián)性較大的通路借助微生信數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站將結(jié)果可視化。見圖4～5。

2.5 藥物成分-CRC靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的創(chuàng)建

創(chuàng)建藥物成分-CRC 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖6。把KEGG 富集分析前20 條通路和對應(yīng)的蛋白靶點上傳并分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。顯示槲皮素連接度、介度和緊密度均最高，可預(yù)測槲皮素是本方治療CRC 的首要成分，其次為木犀草素、惰堿、山奈酚，均能與多個靶點交互作用，推測上述組分可能是本方治療CRC 的主要活性組分，見表2。

表2 薏苡附子敗醬散主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

3 討論

本研究結(jié)合CRC 的古今病因辨證，預(yù)測本方可能對CRC 起著一定的治療作用，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探析具體治療機制。首先篩出本方治療CRC 的活性成分為槲皮素、木犀草素、惰堿、山柰酚等。CRC 的相關(guān)基礎(chǔ)研究表明，槲皮素可利用其對IL-6/STAT3 信號通路的調(diào)節(jié)，阻礙腫瘤細(xì)胞的增生和繁殖[7]。木犀草素能借助ATAD2 蛋白信號傳導(dǎo)使MMP-2、MMP-9等促癌靶點的表達(dá)下調(diào)，同時抑制腸癌HT-29 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]，惰堿及苯甲酰基萘均屬于附子生物堿類，通過干預(yù)MTAP、ABCB1 基因，調(diào)控AKT1、EGFR 蛋白表達(dá)，參與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、雌激素信號通路、中心碳代謝等途徑來實現(xiàn)抗腫瘤[9]。山柰酚可上調(diào)p53 蛋白表達(dá)量并增強磷酸化程度，使Bcl-2 和Bax 蛋白含量發(fā)生變化、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，最終借助線粒體途徑、死亡受體途徑抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[10-11]。故推測本方關(guān)鍵依靠槲皮素、木犀草素、惰堿、山柰酚等治療CRC。

數(shù)據(jù)分析顯示，本方治療CRC 的靶點首要聚集在TP53，而AKT1 也是緊要靶點之一。TP53 為抑癌基因之一，有實驗發(fā)現(xiàn)CRC 細(xì)胞的外泌體蛋白可抑制CRC 細(xì)胞的凋亡，而TP53 基因敲除的樣本外泌體蛋白的組成發(fā)生改變，主要集中在泛素化、糖酵解通路中，達(dá)到改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境抗腫瘤的目標(biāo)[12]。多項研究表明AKT1 在CRC 中高表達(dá)，通過代謝信號通路，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的反應(yīng)及其活化表型，促進(jìn)CRC 細(xì)胞的增殖[13]。本方治療CRC 的通路主要有癌癥的途徑、乙型肝炎、PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路等?；谖墨I(xiàn)搜索顯示，PI3K-Akt 信號通路在CRC 方面研究廣泛，且其在KEGG 分析結(jié)果中排序靠前，推測其與本方治療CRC 的作用機制相關(guān)。有研究表示該信號通路能通過改變通路下游P 糖蛋白表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞周期、促使腫瘤血管的生成等多種生物過程來推進(jìn)CRC的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[14]，同時增加化療耐藥性[15]。故推測本方可能通過抑制PI3K-Akt 信號通路從而阻止CRC 的進(jìn)展。

研究最終體現(xiàn)了本方多通路、多靶點結(jié)合作用的特質(zhì)。為臨證運用其治療CRC 提供了科學(xué)依據(jù)，也為發(fā)掘它的潛在作用機制奠定了基礎(chǔ)。然而囿于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論的局限性，需要生物學(xué)實驗及其他實踐結(jié)果進(jìn)一步驗證本研究結(jié)果。