響應(yīng)面法優(yōu)化牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒發(fā)酵工藝

顧曉慧

（威海海洋職業(yè)學(xué)院 食品與藥品系，山東 威海 264300）

牡蠣（Crassostrea gigas）是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類，山東乳山牡蠣全國(guó)盛名。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載牡蠣肉“甘、溫、無(wú)毒。牡蠣熟食、治虛損、調(diào)中、解丹毒、婦人血?dú)?。以姜、醋生食，治丹毒，酒后煩熱，止渴。炙食甚美，令人?xì)肌膚，美顏色”。牡蠣多糖是一種重要的活性物質(zhì)，占牡蠣干質(zhì)量的20%～40%[1]。具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能[2-5]。侯麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣多糖具有保護(hù)小鼠急性酒精肝損傷的作用；CAI B N等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣多糖具有減輕5-氟尿嘧啶引起的腸炎癥和營(yíng)養(yǎng)不良的功能，是制備功能飲品的重要成分。

無(wú)花果（Ficus caricaLinn）富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素及芳香類和類黃酮、香豆素類等活性成分[9]，具有清熱生津、健脾開(kāi)胃、解毒消腫等功效，兼具食用和藥用價(jià)值。其屬于躍變型果實(shí)，含水量和含糖量較高，營(yíng)養(yǎng)成分易損失，易遭受機(jī)械損傷，其采收期短、采后易腐爛，常溫只能保存3～5 d，難以遠(yuǎn)距離運(yùn)輸和長(zhǎng)期貯藏[10-11]。為增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)成熟度較高的無(wú)花果進(jìn)行產(chǎn)地加工十分必要[12]。目前關(guān)于無(wú)花果的研究主要集中在混合果酒發(fā)酵、果醋發(fā)酵等[13-18]，添加牡蠣多糖保健飲品開(kāi)發(fā)相對(duì)較少，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。

無(wú)醇及低醇飲料最大的特點(diǎn)是降低了酒精含量，減少了酒精對(duì)人體的危害，同時(shí)很大程度保持了其原有的色澤及風(fēng)味。根據(jù)《中國(guó)葡萄釀酒技術(shù)規(guī)范》[19]，通常認(rèn)為低醇果酒酒精度在1%vol～7%vol左右，在滿足人們飲用的同時(shí)，消除了酒的某些副作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外低醇果酒的生產(chǎn)及消費(fèi)都呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，具有良好的市場(chǎng)前景。本研究以山東榮成無(wú)花果為原料，制備低醇無(wú)花果酒。采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、酵母菌接種量、牡蠣多糖添加量、發(fā)酵溫度對(duì)其酒精度和感官評(píng)分的影響，并優(yōu)化低醇無(wú)花果酒發(fā)酵工藝。旨在為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)花果：山東榮成；牡蠣多糖：艾特生物科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活＞50 000 U/g）、抗壞血酸、檸檬酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP3102分析天平：奧豪斯儀器有限公司；BCM-1000A生物潔凈臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PAL-109D數(shù)顯酒精濃度計(jì)：杭州齊威科技有限公司；JYZ-C501打漿機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司；PB-10 pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SPX-250BSH-II生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SHA-C大容量恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；HH-S4恒溫水浴鍋：金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；WZS-32手持折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

選用山東榮成完全成熟青皮無(wú)花果，清洗瀝干，無(wú)花果與水按照料水比1∶3（g∶mL）加入飲用水，同時(shí)添加4 g/L抗壞血酸和4 g/L檸檬酸護(hù)色，用打漿機(jī)（已滅菌）進(jìn)行破碎勻漿。加入0.3%（以果質(zhì)量計(jì)）果膠酶，在50 ℃、pH=3.0的條件下酶解2 h，然后置于70 ℃水浴中滅酶5 min。降溫后，用8層紗布進(jìn)行過(guò)濾，得到無(wú)花果果汁。

將無(wú)花果果汁酸度調(diào)節(jié)至pH 3.5，調(diào)節(jié)初始糖度，添加一定量的牡蠣多糖，于（85±2）℃水浴中進(jìn)行滅菌30 min，待冷卻至室溫，加入一定量（0.02%～0.06%）已活化（將相應(yīng)含量酵母加入15倍35 ℃的純水中30 min）的釀酒酵母，在一定溫度條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵。待酒精含量不再升高，發(fā)酵結(jié)束。然后進(jìn)行倒罐、陳釀（4 ℃，30 d）、灌裝后得到牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒成品。

1.3.2 牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以酒精度和感官評(píng)分為指標(biāo)，分別研究了牡蠣多糖添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、初始糖度（15°Bx、16 °Bx、17 °Bx、18 °Bx、19 °Bx）、酵母菌接種量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，選取初始糖度（A）、酵母菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)具有感官評(píng)價(jià)資質(zhì)人員9人，按照國(guó)標(biāo)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]相關(guān)要求，將樣品放置于（20±2）℃環(huán)境中平衡24 h后，采用密碼標(biāo)記后進(jìn)行感官品評(píng)，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

（2）理化指標(biāo)

酒精度測(cè)定：采用酒精計(jì)法；?；撬岬臏y(cè)定：采用氨基酸自動(dòng)分析儀法[20]；pH測(cè)定：pH計(jì)法；初始糖度測(cè)定：折光儀法；Zn含量測(cè)定：參照GB 5009.14—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鋅的測(cè)定》[22]。

（3）微生物指標(biāo)

參照GB4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[23]、GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[24]、GB/T 4789.25—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)酒類檢驗(yàn)》[25]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS 20.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 牡蠣多糖添加量的影響

不同牡蠣多糖添加量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨牡蠣多糖添加量增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)牡蠣多糖添加量為0.1%～0.3%時(shí)，感官評(píng)分隨之增加；當(dāng)牡蠣多糖添加量為0.3%時(shí)，感官評(píng)分最高，為95.25分；當(dāng)牡蠣多糖添加量＞0.3%之后，感官評(píng)分呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。經(jīng)單因素方差分析，牡蠣多糖添加量對(duì)感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01）。牡蠣多糖添加量對(duì)酒精度影響不大，酒精度基本穩(wěn)定在6.7%vol～6.8%vol之間，且經(jīng)單因素方差分析，牡蠣多糖對(duì)酒精度影響不顯著（P＞0.05）。綜合考慮，確定最適牡蠣多糖添加量為0.3%。

圖1 牡蠣多糖添加量對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.1 Effect of oyster polysaccharide addition on alcohol content and sensory score of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

2.1.2 初始糖度的影響

不同初始糖度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨初始糖度在15～17°Bx范圍內(nèi)增加，酒精度和感官評(píng)分隨之呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)初始糖度為17°Bx時(shí)，酒精度和感官評(píng)分最高，分別為7.2%vol、95分；當(dāng)初始糖度＞17°Bx之后，感官評(píng)分和酒精度隨之下降。綜合考慮，確定最適初始糖度為17°Bx。

圖2 初始糖度對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.2 Effect of initial sugar contents on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

2.1.3 酵母菌接種量的影響

不同酵母菌接種量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨酵母菌接種量在0.02%～0.04%范圍內(nèi)的增加，酒精度隨之上升；當(dāng)酵母接種量為0.04%時(shí)，酒精度最高，為6.8%vol；當(dāng)酵母接種量＞0.04%之后，酒精度稍有下降。這說(shuō)明碳源含量一定時(shí)，酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力與酵母菌接種量密切相關(guān)，酵母接種量越大，酒精度越高，但是酵母菌接種量超過(guò)一定量時(shí)，酵母菌接種量增大，酒精度保持穩(wěn)定或略有下降。隨酵母菌接種量在0.02%～0.05%范圍內(nèi)的增加，感官評(píng)分隨之上升；當(dāng)酵母接種量為0.05%時(shí)，感官評(píng)分最高，為94分；當(dāng)酵母接種量＞0.05%之后，感官評(píng)分有所下降。綜合考慮，確定最適酵母菌接種量為0.05%。

圖3 酵母菌接種量對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of low-alcohol oyster polysaccharide fig wine

2.1.4 發(fā)酵溫度的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨發(fā)酵溫度在20～24 ℃范圍內(nèi)升高，酒精度和感官評(píng)分隨之上升；當(dāng)發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，感官評(píng)分和酒精度最高，分別為93分，6.8%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度高于24 ℃之后，感官評(píng)分和酒精度逐漸下降。發(fā)酵溫度升高促進(jìn)酵母菌大量繁殖，因營(yíng)養(yǎng)成分消耗殆盡導(dǎo)致菌體死亡，致使酒體略呈現(xiàn)渾濁和不良滋味。綜合考慮，確定最適發(fā)酵溫度為24 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨發(fā)酵時(shí)間在6～7 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，發(fā)酵時(shí)間在7 d時(shí)，酒精度最高為7.1%vol；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)7 d之后，酒精度趨于穩(wěn)定。感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間在6～8 d范圍內(nèi)延長(zhǎng)而逐漸提高，發(fā)酵時(shí)間在8 d時(shí)，感官評(píng)分最高為94分；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)8 d之后，感官評(píng)分逐漸下降。發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)有利于酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生酒精及風(fēng)味成分，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因酵母菌大量繁殖，產(chǎn)生代謝廢物，出現(xiàn)菌體死亡等現(xiàn)象，且體系中可被酵母菌利用的糖類逐漸減少，出現(xiàn)風(fēng)味變差、酒體渾濁等不良感官現(xiàn)象，這與李夏等[26-27]的研究結(jié)果相似。綜合考慮，確定最適發(fā)酵時(shí)間為8 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分和酒精度的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，選取初始糖度（A）、酵母菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

以酒精度（Y1）為響應(yīng)值，經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合得到方程為：Y1=7.08+0.087A+0.11B+0.037C+0.11D+0.019AB+0.031AC+0.031AD-0.069BC+0.031BD-0.006 25CD-0.13A2-0.15B2-0.22C2-0.13D2。

由表4可知，該模型顯著（P值=0.001 2＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.186 8＞0.05），模型擬合度較好，能較好地反映酒精度與各因素的變化規(guī)律。模型決定系數(shù)R2=0.835 8，校正決定系數(shù)R2adj=0.682 5，變異系數(shù)為3.05%，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)有3.05%的變異性可以用該模型對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、D對(duì)酒精度影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2及D2對(duì)酒精度影響極顯著（P＜0.01），其他因素影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)酒精度影響順序?yàn)榻湍妇臃N量=發(fā)酵時(shí)間＞初始糖度＞發(fā)酵溫度。

以感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合得到方程為：Y2=93.67+0.42A+0.50B-0.50C+0.42D+0.38AB+0.50AC-0.37AD+0.50BC-0.12BD+0.25CD-2.54A2-2.92B2-2.54C2-2.29D2。

由表4可知，該模型顯著（P＜0.000 1＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.381 3＞0.05），模型擬合度較好，能較好地反映感官評(píng)分與各因素的變化規(guī)律。模型決定系數(shù)R2=0.977 7，校正決定系數(shù)R2adj=0.957 0，變異系數(shù)為1.07%，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)有1.07%的變異性可以用該模型對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AC、BC對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2及D2對(duì)酒精度影響極顯著（P＜0.01），其他因素影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)感官評(píng)分影響順序?yàn)榘l(fā)酵溫度=酵母菌接種量＞發(fā)酵時(shí)間=初始糖度。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線見(jiàn)圖6。由圖6可知，交互項(xiàng)AC、BC對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），這與表4結(jié)果一致。

圖6 酵母菌接種量、初始糖度與發(fā)酵溫度間交互作用對(duì)牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between yeast inoculum,initial sugar contents and fermentation temperautre on sensory score of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine

利用Design-Expert V8.0.6軟件，通過(guò)優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度24.9 ℃，發(fā)酵時(shí)間7.1 d，初始糖度17.1°Bx，酵母菌接種量0.05%。在此最佳條件下，酒精度預(yù)測(cè)值為7.102%vol，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為93.74分。結(jié)合實(shí)際操作可行性，將最佳發(fā)酵條件修正為：發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間7 d，初始糖度17°Bx，酵母菌接種量0.05%。按此發(fā)酵工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到平均酒精度實(shí)際值為7.17%vol，感官評(píng)分實(shí)際值為94.2分，與模型預(yù)測(cè)基本一致，表明該模型有效可行。

2.3 牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒品質(zhì)分析

2.3.1 感官指標(biāo)

牡蠣多糖無(wú)花果酒酒體清澈透明、呈橙紅色，果香濃郁，酒香適宜，無(wú)腥味，酒體柔和、口感酸甜，具有無(wú)花果固有的風(fēng)味，典型性良好，感官評(píng)分為94.2分。

2.3.2 理化指標(biāo)

在優(yōu)化條件下，牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒酒精度為7.17%vol，?；撬岷繛?82 mg/L，Zn含量為13.3 mg/L，總酸（以酒石酸計(jì)）含量為5.2 g/L。符合國(guó)標(biāo)GB 2758—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》要求。

2.3.3 微生物指標(biāo)

牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒菌落總數(shù)＜50 CFU/mL，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均未檢出，符合GB 2758—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》要求。

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到牡蠣多糖低醇無(wú)花果酒的最佳發(fā)酵工藝為：原料選用完全成熟的榮成青皮無(wú)花果，經(jīng)清洗、護(hù)色、勻漿、酶解、過(guò)濾等工序得到果汁濾液，調(diào)整pH值為3.50、初始糖度為17°Bx，添加0.3%的牡蠣多糖，滅菌冷卻，添加0.05%已活化的釀酒酵母，于25 ℃條件下發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行倒灌、陳釀、灌裝，最后得到成品。產(chǎn)品經(jīng)過(guò)質(zhì)量評(píng)價(jià)，口感良好、風(fēng)味獨(dú)特，其感官評(píng)分為94.2分，酒精度為7.17%vol，?；撬岷繛?82 mg/L，Zn含量為13.3 mg/L，菌落總數(shù)＜50 CFU/mL，致病菌未檢出，是一款兼具口感與營(yíng)養(yǎng)、安全衛(wèi)生的低醇健康飲品。