紅桿菌NBS58-1產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及其保濕性研究

李春雨，楊棒棒，周 佳，羅 宇，屈建航*

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

多糖（即多聚糖）一般是通過10個以上的單糖由糖苷鍵連接起來而形成的聚合糖高分子碳水化合物[1]，種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。根據(jù)來源不同，多糖分為動物多糖、植物多糖、微生物多糖[2]。微生物多糖是由細菌、真菌、藻類等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的對其本身有保護作用的生物高聚物，相較于動物多糖與植物多糖，微生物多糖獲取成本低，方法簡便，且不受地域、季節(jié)、蟲害、光照等條件限制，同時還具有發(fā)酵條件易調(diào)控、多糖易分離等優(yōu)點[3]。

微生物多糖以胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）為主，微生物胞外多糖具有保濕、乳化[4]、流變[5]、粘合、金屬絡(luò)合[6]等特性以及抗氧化[7]、抗炎癥[8]、抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等生物活性，在食品、生物技術(shù)、化妝品和制藥工業(yè)中具有較大的潛在應(yīng)用價值。其中部分細菌多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在大量親水性羥基，使得多糖具有較強的吸濕保濕活性[11]，在化妝品行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。周璇[12]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌Ⅱ4-01胞外多糖在相對濕度為43%和81%環(huán)境中，純多糖的吸濕能力強于殼聚糖和黃原膠；在干硅膠環(huán)境下，多糖的保濕性要明顯優(yōu)于殼聚糖和黃原膠。楊棒棒等[13]研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌ZX-5胞外多糖在干燥環(huán)境中具有優(yōu)于甘油和殼聚糖的保濕性。

目前產(chǎn)胞外多糖優(yōu)良菌種的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化，仍是微生物胞外多糖研究的關(guān)鍵。張麗等[14]對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，優(yōu)化后齊整小核菌產(chǎn)糖量提高了54.42%。王琪等[15]對篩選的一株產(chǎn)胞外多糖羅漢果內(nèi)生菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后產(chǎn)糖量是優(yōu)化前的1.9倍。

本研究對本實驗室自主分離篩選和鑒定的一株細菌新種紅桿菌（Rufibacter hautae）NBS58-1進行發(fā)酵產(chǎn)糖條件的優(yōu)化，并研究其保濕性，為微生物胞外多糖的菌種資源開發(fā)及其相關(guān)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅桿菌（Rufibacter hautae）NBS58-1：本實驗室自主分離篩選和鑒定[16]。

1.1.2 試劑

葡萄糖、丙酮酸鈉、硝酸鈉、尿素、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、阿拉伯糖、瓊脂粉、無水乙醇、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、酸水解酪蛋白、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基[16]：酵母浸粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.05g/L、丙酮酸鈉0.3g/L，pH 7.0、115 ℃滅菌30 min。固體R2A培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g。

1.2 儀器與設(shè)備

VS-840-2潔凈工作臺、SPX-250B-D培養(yǎng)箱、BSDYX2400立式雙層智能精密搖床：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；TGL-16G高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株NBS58-1生長曲線及其產(chǎn)胞外多糖曲線繪制

R2A固體培養(yǎng)基上挑取NBS58-1新鮮菌種，接種至R2A液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h作為種子液。將種子液以5%（V/V）的接種量接至R2A液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min、裝液量100 mL/250 mL條件下進行發(fā)酵產(chǎn)糖。分別于不同時間（0、15 h、22 h、27 h、39 h、46 h、52 h、58 h、65 h、75 h、87 h）取3 mL發(fā)酵液樣品，測定波長600 nm處的吸光度值，用蒸餾水作為空白對照，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長曲線。

參照竇富超[17]的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別于不同時間（0、15 h、22 h、27 h、39 h、46 h、52 h、58 h、65 h、75 h、87 h）取3 mL發(fā)酵液樣品，采用硫酸苯酚法[18]測定多糖含量，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，胞外多糖產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制菌株產(chǎn)胞外多糖曲線。

1.3.2 單因素試驗

以R2A培養(yǎng)基的成分為基礎(chǔ)，固定R2A培養(yǎng)基起始pH 7，溫度28 ℃，接種量5%。分別考察碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、阿拉伯糖）及碳源添加量（0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、40 g/L），氮源（酵母浸粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸鈉）及氮源添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L），pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），溫度（10 ℃、20 ℃、28 ℃、37 ℃、45 ℃），接種量（3%、5%、8%、10%、15%）對NBS58-1產(chǎn)胞外多糖量的影響。

1.3.3 胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用Design Expert12軟件進行響應(yīng)面設(shè)計，選取3個影響顯著的因素蔗糖添加量（A）、初始pH（B）、溫度（C）設(shè)計3因素3水平的試驗組合，考察因素變化對胞外多糖產(chǎn)量（Y）的影響。

表1 胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for extracellular polysaccharide fermentation condition optimization

1.3.4 胞外多糖保濕性評價

參照WANG Z C等[19]的方法提取純化胞外多糖。參照周璇[12]吸濕保濕試驗方法，并稍作修改。

（1）吸濕性試驗：精密稱取胞外多糖凍干樣品、烘干至質(zhì)量恒定的殼聚糖和透明質(zhì)酸各0.1 g，置于干燥平皿中，將平皿分別放置在裝有適量飽和碳酸鈉溶液（相對濕度43%）和飽和硫酸銨溶液（相對濕度81%）的20 ℃恒溫干燥器中，定時稱量樣品質(zhì)量。每組每個樣品3次平行。樣品吸濕率計算公式如下：

式中：mt為t時間樣品質(zhì)量，g；m0為干燥樣品質(zhì)量，g。

（2）保濕性試驗：精密稱取胞外多糖凍干樣品、烘干至恒重的殼聚糖和透明質(zhì)酸各0.1 g，分別加入3倍體積去離子水，將樣品均勻完全浸潤后，放置于盛有干硅膠的干燥器中（相對濕度0%），定時稱量樣品質(zhì)量。樣品保濕率計算公式如下：

式中：mt為t時間樣品質(zhì)量，g；m0為干燥樣品質(zhì)量，g；m水為加入去離子水質(zhì)量，g。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。單因素試驗采用SPASS 22.0軟件進行顯著性分析，采用Origin 2021b軟件作圖。響應(yīng)面試驗設(shè)計及分析采用DesignExpert 12軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NBS58-1生長曲線及其產(chǎn)胞外多糖曲線

菌株NBS58-1生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線如圖1所示。由圖1可知，菌株NBS58-1在52 h時生長量達到最大，在58 h時EPS產(chǎn)量達到最大。

圖1 菌株NBS58-1生長曲線及產(chǎn)胞外多糖曲線Fig.1 Growth curve and extracellular polysaccharide production curve of strain NBS58-1

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 碳源對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS的影響

由圖2（A）可知，5種不同碳源均能促進菌株NBS58-1產(chǎn)生一定量的胞外多糖，蔗糖作為單一碳源時效果最佳，組間差異顯著（P＜0.05）。由圖2（B）可知，在蔗糖添加量為0.5～15 g/L時，菌株NBS58-1產(chǎn)EPS量不斷增加；在15 g/L時達到最大，為100.77 mg/L；在15～40 g/L時，隨著蔗糖添加量的增大而減小，可能是由于培養(yǎng)基中蔗糖含量過高，導(dǎo)致菌體內(nèi)外滲透壓失衡，其生長受到抑制，從而影響菌株胞外多糖的合成[20]。因此選擇蔗糖添加量為15 g/L。

圖2 碳源種類（A）及蔗糖添加量（B）對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effect of carbon source (A) and sugar addition (B) on extracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

2.2.2 氮源對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS的影響

氮源對微生物的生長至關(guān)重要，而不同的微生物有自身的氮源需求[21]。由圖3（A）可知，不同氮源對NBS58-1產(chǎn)EPS量的影響有顯著差異（P＜0.05），有機氮源明顯優(yōu)于無機氮源，以酵母浸粉作為氮源時，更有利于菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖。由圖3（B）可知，適當(dāng)提高酵母浸粉濃度有利于菌株產(chǎn)糖。當(dāng)酵母浸粉濃度過低時，細胞合成菌株生長繁殖時所需的蛋白質(zhì)、核酸等受到影響，進而影響產(chǎn)糖量[22]；當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度為1 g/L時，產(chǎn)糖量最大，為33.98 mg/L；當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度＞1 g/L時，NBS58-1產(chǎn)EPS開始下降，原因可能是氮源添加量過高，發(fā)酵液粘稠，溶氧量減小，導(dǎo)致菌株產(chǎn)糖的分泌與合成受到影響[23]。因此選擇酵母浸粉添加量為1 g/L。

圖3 氮源種類（A）及酵母浸粉添加量（B）對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effect of nitrogen source (A) and yeast extract addition (B) on extracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

2.2.3 溫度對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS的影響

由圖4可知，當(dāng)其他條件不變時，溫度在10～28 ℃范圍內(nèi)隨著溫度升高，菌株NBS58-1產(chǎn)EPS量隨之增大；在28 ℃時，EPS產(chǎn)量達到最大；28～45 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，NBS58-1產(chǎn)EPS量隨之減小。原因可能溫度過高或過低，都有可能影響酶蛋白的活性及細胞膜的通透性，進而影響菌體的正常生長及產(chǎn)糖[24]。因此選擇溫度為28 ℃。

圖4 溫度對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effect of temperature on extracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

2.2.4 初始pH對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS的影響

由圖5可知，初始pH對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS有顯著影響（P＜0.05）；在pH 6～8范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量先增大后減小，在pH 7時產(chǎn)量最大，因此選擇pH 7。

圖5 初始pH對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effect of initial pH on extracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

2.2.5 接種量對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS的影響

接種量的多少直接影響菌體生長速率，不同菌株的種子液培養(yǎng)方式不同則最適接種量差異較大[25]。由圖6可知，在同一發(fā)酵時間，隨著接種量增加，菌株NBS58-1產(chǎn)EPS先增大后減小，原因可能是在營養(yǎng)成分一定時，接入過多菌種，營養(yǎng)物質(zhì)加速消耗，用于合成EPS的能力不足[26]。在接種量為5%時，EPS產(chǎn)量最大，為44.59 mg/L。因此選擇接種量為5%。

圖6 接種量對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.6 Effect of inoculum on extracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及分析

對蔗糖添加量（A）、初始pH（B）、溫度（C）3個因素選取3個水平進行Box Behnken試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 Box Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box Behnken tests

由表2數(shù)據(jù)可得出各因素對菌株NBS58-1產(chǎn)EPS影響的回歸方程：Y=128.1-18.78A+19.84B-28.59C-2.44AB-14.29AC-15.83BC-53.31A2-20.86B2-33.62C2。由表3可知，模型的F值為62.41，P＜0.01，模型顯著，失擬項P值=0.264 0，P＞0.05，不顯著。決定系數(shù)R2=0.987 7，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.971 9，與決定系數(shù)R2相差＜0.2，信噪比=26.267 4＞4，表明試驗精準(zhǔn)度和準(zhǔn)確度高，該模型可以較好的應(yīng)用于對菌株NBS58-1 EPS產(chǎn)量的理論預(yù)測。一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2以及交互項AC、BC對菌株NBS58-1 EPS產(chǎn)量有極顯著影響（P＜0.01）；交互項AB對菌株NBS58-1 EPS產(chǎn)量影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression model

響應(yīng)面可直觀反映試驗中不同因素以及兩兩因素之間交互作用。響應(yīng)面的坡度越大，則顯示試驗因素對NBS58-1 EPS產(chǎn)量影響越大。等高線的橢圓程度表示兩兩因素之間交互作用對EPS產(chǎn)量影響的顯著性，等高線橢圓程度越大，影響越顯著。圖7結(jié)果表明，碳源添加量的坡度大于初始pH的坡度，表明在碳源添加量與初始pH交互作用中碳源添加量的影響大于初始pH。碳源添加量與溫度的坡度較陡峭且顏色變化快，表明兩者交互作用對菌株NBS58-1 EPS產(chǎn)量影響顯著。初始pH與溫度的等高線圖橢圓程度大，表明二者交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖7 蔗糖添加量、初始pH與溫度間交互作用對菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between sucrose addition,initial pH and temperature onextracellular polysaccharide production by strain NBS58-1

為了驗證模型的準(zhǔn)確性，根據(jù)預(yù)測最優(yōu)條件（pH 7.33、溫度22.88 ℃、蔗糖添加量14.13 g/L、酵母浸粉添加量1 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L）得到預(yù)測EPS產(chǎn)量為140.2 mg/L，為方便實際操作，修改試驗條件為初始pH 7.5、溫度23 ℃、蔗糖添加量14.1 g/L、酵母浸粉添加量1 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L，在此條件下進行驗證，重復(fù)3次，得到EPS產(chǎn)量為138.85 mg/L，與預(yù)測值接近，表明模型模擬可靠，能較好的預(yù)測真實值。

2.4 菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖保濕性評價

2.4.1 吸濕性

透明質(zhì)酸、殼聚糖、菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖在不同相對濕度條件下吸濕能力如圖8所示，在不同相對濕度環(huán)境下，3個樣品的吸濕率都隨時間的增加而增大。在相對濕度43%條件下，40 h時透明質(zhì)酸、EPS、殼聚糖的吸濕率分別為29.15%、20.01%、18.6%；在相對濕度81%條件下，40 h時透明質(zhì)酸、EPS、殼聚糖的吸濕率分別為35.7%、23.15%、20.3%，表明相對濕度越大，樣品在同一時間的吸濕率越高。吸濕能力排序為透明質(zhì)酸＞EPS＞殼聚糖，EPS的吸濕能力雖然比透明質(zhì)酸吸濕能力差，但優(yōu)于殼聚糖的吸濕能力，有一定開發(fā)應(yīng)用潛力。

圖8 透明質(zhì)酸、殼聚糖和菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖吸濕性比較Fig.8 Comparison of moisture absorption of hyaluronic acid,chitosan and extracellular polysaccharide produced by strain NBS58-1

2.4.2 保濕性

菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖的保濕性評價如圖9所示，透明質(zhì)酸、EPS、殼聚糖在干燥環(huán)境下保濕率隨時間的延長而降低，在48 h內(nèi)，EPS的保濕率優(yōu)于透明質(zhì)酸與殼聚糖；在48 h時，EPS保濕率為58%，與透明質(zhì)酸相當(dāng)，且優(yōu)于殼聚糖；48 h后，保濕率透明質(zhì)酸＞EPS＞殼聚糖，表明該胞外多糖具有一定的保濕效果。

圖9 透明質(zhì)酸、殼聚糖和菌株NBS58-1產(chǎn)胞外多糖保濕性比較Fig.9 Comparison of moisture retention of hyaluronic acid,chitosan and extracellular polysaccharide produced by strain NBS58-1

3 結(jié)論

該研究通過單因素試驗、Box-Behnken試驗和響應(yīng)面分析，優(yōu)化了細菌NBS58-1產(chǎn)胞外多糖條件，并研究其產(chǎn)生的胞外多糖的吸濕保濕能力。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵產(chǎn)糖工藝為初始pH 7.5、溫度23 ℃、蔗糖14.1 g/L、酵母浸粉1 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L，在此條件下發(fā)酵58 h，菌株NBS58-1的產(chǎn)EPS量為138.85 mg/L，是優(yōu)化前的3.08倍。保濕性研究結(jié)果表明，在相對濕度0%條件下，48 h內(nèi)該胞外多糖的保濕率優(yōu)于透明質(zhì)酸與殼聚糖。在相對濕度43%和81%條件下，吸濕能力稍低于透明質(zhì)酸，但高于殼聚糖。微生物產(chǎn)胞外多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，后續(xù)將繼續(xù)探究該胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其他功能與活性。