抗銅綠假單胞菌南極微生物的篩選、鑒定及其抑菌譜研究

宋紅麗，楊佳夷，鄭 立，黃楊竹，石悅煒，徐麓凱，金黎明*

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；2.自然資源部第一海洋研究所 自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061）

近年來(lái)，南極地區(qū)微生物學(xué)的研究逐步引起了人們的注意，南極的生態(tài)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，生物的種類(lèi)相對(duì)較少，而微生物因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的適應(yīng)性，成為南極地區(qū)生態(tài)結(jié)構(gòu)和物質(zhì)能量循環(huán)中的重要組成[1-2]。在研究和開(kāi)發(fā)生物活性物質(zhì)方面，極地微生物具有明顯的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)[3-5]。極地微生物為了適應(yīng)極地酷寒、干燥、強(qiáng)輻射的自然環(huán)境，生理特點(diǎn)和代謝機(jī)制會(huì)產(chǎn)生不同于陸地微生物的變化，因此更容易產(chǎn)生新的抗菌活性物質(zhì)[6-8]。如倪孟祥等[9]在南極泥樣品中分離出的一株放線菌——生金鏈霉菌（Streptomyces aure-ofaciens），其代謝產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性好，大部分為極性中等的弱堿性化合物，對(duì)多重耐藥菌有良好的抑制作用，有很好的研發(fā)價(jià)值；TEDESCO P等[10]從南極假單胞菌屬菌株BNT1的代謝產(chǎn)物中分離得到三種鼠李糖脂，對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）＜1 μg/mL。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種典型的條件致病菌，屬革蘭氏陰性桿菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，廣泛分布于土壤、水體和空氣中[11-13]。它是一種重要的食源性致病菌，其產(chǎn)生的毒力因子可引起飲用水的污染和食物中毒，導(dǎo)致感染者產(chǎn)生嘔吐、頭暈、腹瀉等癥狀[14-15]。目前，常用的抗銅綠假單胞菌藥物主要有β-內(nèi)酰胺類(lèi)（如頭孢菌素類(lèi)、青霉素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)等）、氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等，但是由于抗生素的廣泛使用和濫用，銅綠假單胞菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，大大增加了臨床治療的難度[16]。從天然資源中開(kāi)發(fā)新型有效的抗菌化合物已成為研究的趨勢(shì)，近年來(lái)，對(duì)利用中草藥抑制銅綠假單胞菌的研究較多[17-19]，而利用微生物的拮抗作用的研究較少。如陳小春等[20]研究發(fā)現(xiàn)，分離自東太平洋海山區(qū)的太平洋桿菌（Oceanobacillussp.）XC22919發(fā)酵液粗提物可以抑制野生型銅綠假單胞菌PAO1相關(guān)毒素的分泌；ZHOU J W等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜織球殼菌（Plectosphaerella cucumerina）的代謝產(chǎn)物有抑制銅綠假單胞菌的作用。

本研究以銅綠假單胞菌為指示菌，從南極團(tuán)結(jié)湖沉積物中分離、純化、篩選拮抗菌，采用形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)其抑菌廣譜性進(jìn)行研究，為下一步研究其抗菌機(jī)理、活性代謝產(chǎn)物等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

南極團(tuán)結(jié)湖沉積物樣品：自然資源部第一海洋研究所海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，-20 ℃保存。

1.1.2 菌株

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）BNCC 186113、大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）CGMCC 1.1616、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）CICC 21484、屎腸球菌（Enterococcus faecium）BNCC 336951、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）BNCC 194496、白色念珠菌（Candida albicans）CMCC 52201：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH=7.0。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，去離子水1 000 mL。

腦心浸出肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基：牛心浸粉10 g，胰蛋白胨20 g，葡萄糖4 g，NaCL 10 g，瓊脂20 g，磷酸氫二鈉5 g，去離子水1 000 mL。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母粉4 g、牛肉粉5 g、檸檬酸氫三銨2 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、硫酸錳0.05 g、硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

葡萄糖蛋白胨酵母膏（glucose peptone yeast extract，GPY）培養(yǎng)基：酵母膏0.5 g，蛋白胨2 g，瓊脂20 g，葡萄糖10 g，去離子水1 000 mL。

瓊脂培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試劑

胰蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母提取物（生化試劑）、氯化鈉（分析純）、SanPrep柱式脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）膠回收試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂（生化試劑）：賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：日本Airtech公司；VeritiTMDx聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：基因有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 南極微生物的分離及純化

菌株的分離采用稀釋涂布平板法[22]，取南極團(tuán)結(jié)湖沉積物0.5 g于試管中，加入4.5 mL生理鹽水，混勻，靜置2 h，采用生理鹽水按10倍梯度稀釋至10-6，取10-6～10-2的稀釋液各100 μL，涂布于LB瓊脂、BHI瓊脂、MRS瓊脂平板，分別于12 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～6 d后，再用接種針挑取形態(tài)不同的細(xì)菌單菌落接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，分別在12 ℃和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d。

1.3.2 銅綠假單胞菌拮抗菌株的篩選

初篩：采用雙層平板法進(jìn)行初篩。在LB液體培養(yǎng)基中接種銅綠假單胞菌，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。吸取5 μL待測(cè)樣菌液點(diǎn)接于LB瓊脂平板上，分別放到適宜待測(cè)菌種生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)24 h。待LB瓊脂培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時(shí)，加入銅綠假單胞菌懸液，立刻混勻，傾倒在有待測(cè)菌株的培養(yǎng)基中作為雙層平板的上層，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察有無(wú)抑菌圈出現(xiàn)。

復(fù)篩：采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩。吸取100 μL初篩菌的培養(yǎng)液接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮100倍，將濃縮液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾得到粗發(fā)酵液[23]。將銅綠假單胞菌懸液加入到LB瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，待培養(yǎng)基凝固后用打孔器打孔，往孔中加入300 μL初篩得到的南極微生物的粗發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)12 h，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，抑菌圈直徑＞12 mm則有抑菌效果，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 銅綠假單胞菌拮抗菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

將篩選出的銅綠假單胞菌拮抗菌株劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[24]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[25]對(duì)其形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行觀察和測(cè)定，并進(jìn)行初步判定。

（2）分子生物學(xué)鑒定

選取通用引物1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），采用菌落PCR法對(duì)篩選得到的銅綠假單胞菌拮抗菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：細(xì)菌通用引物27F和1492R各2 μL，模板7 μL，2×TaqPlus Master Mix酶25 μL，雙蒸水（ddH2O）14 μL，總體積為25 μL；PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[26]。

1.3.4 抑菌譜研究

參照方法1.3.2采用瓊脂擴(kuò)散法研究其抑菌譜。除了肺炎克雷伯氏菌使用NB瓊脂培養(yǎng)基、鮑曼不動(dòng)桿菌使用BHI瓊脂培養(yǎng)基、屎腸球菌使用MRS瓊脂培養(yǎng)基外，其他幾種待測(cè)致病菌均用LB瓊脂培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極微生物的分離及純化

從南極團(tuán)結(jié)湖沉積物樣品中共分離、純化得到64株菌株。

2.2 銅綠假單胞菌拮抗菌株的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果

通過(guò)初篩，從64株南極微生物中篩選得到8株對(duì)銅綠假單胞菌有明顯抑制性的菌株，編號(hào)分別為T(mén)J25、TJ28、TJ31、TJ34、TJ40、TJ41、TJ59、TJ62，其抑菌效果見(jiàn)圖1。由圖1可知，8種菌株周?chē)加幸志?，說(shuō)明這8株菌都具有拮抗銅綠假單胞菌的能力。

圖1 銅綠假單胞菌拮抗菌株的初篩結(jié)果Fig.1 Preliminarily screening results of Pseudomonas aeruginosa antagonistic strains

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，8株初篩菌株對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑為19.0～22.3 mm，其中菌株NO.TJ31發(fā)酵液的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)（22.3±0.7）mm。WONG C等[27]從極地喬治國(guó)王島土壤樣品中分離得到2 465株細(xì)菌，其中Pedobacter cryoconitisBG5和假單胞菌（Pseudomonas）MTC3有抑制肺炎克雷伯氏菌的作用，抑菌圈直徑分別為15 mm和5 mm；王曉彤等[28]從北冰洋沉積物中分離得到一株拮抗大腸桿菌的菌株105號(hào)，平均抑菌圈直徑為19.3 mm。由此可以看出，本實(shí)驗(yàn)中的菌株NO.TJ31抑制銅綠假單胞菌效果較為明顯。

表1 8株初篩菌株的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameter of 8 preliminarily screened strains

2.3 菌株NO.TJ31的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株NO.TJ31的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株NO.TJ31在LB瓊脂培養(yǎng)基上為黃白色不透明菌落，邊緣有褶皺。菌株NO.TJ31的革蘭氏染色結(jié)果為藍(lán)紫色桿狀菌，說(shuō)明該菌是革蘭氏陽(yáng)性菌。

圖2 菌株NO.TJ31的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain NO.TJ31

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌株NO.TJ31的生理生化特征見(jiàn)表2。由表2可知，菌株NO.TJ31能分解葡萄糖產(chǎn)酸且不產(chǎn)氣，能使明膠液化，能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，檸檬酸鹽試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[24]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[25]，初步判定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株NO.TJ31的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NO.TJ31

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株NO.TJ31的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株NO.TJ31與弗氏甲基桿菌（Methylobacterium frigidaeris）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終鑒定菌株NO.TJ31為弗氏甲基桿菌（Methylobacterium frigidaeris）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株NO.TJ31的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain NO.TJ31 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 菌株NO.TJ31的抑菌譜

測(cè)定菌株NO.TJ31對(duì)8種常見(jiàn)致病菌的抑制能力，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株NO.TJ31抑菌譜的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of antibacterial spectrum of strain NO.TJ31

由表3可知，菌株NO.TJ31對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血弧菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯氏菌均有不同程度的抑制作用，其中，對(duì)肺炎克雷伯氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的抑菌效果更為明顯，抑菌圈直徑分別為（28.1±1.0）mm、（27.6±0.3）mm、（27.4±0.4）mm，說(shuō)明該菌株抑菌譜廣泛。在抗菌方面芽孢桿菌研究較多，如死亡谷芽孢桿菌ZZ185分離自闊葉冬青，對(duì)植物病原菌禾谷鐮刀菌、辣椒疫霉菌等有很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制性[29]；香格里拉土壤來(lái)源的芽孢桿菌NBIF-001對(duì)黃瓜灰霉病有防治作用[30]。

3 結(jié)論

本研究從南極團(tuán)結(jié)湖沉積物中共分離、純化出64株微生物，從中篩選出1株對(duì)銅綠假單胞菌抑菌效果最優(yōu)的菌株NO.TJ31，其抑菌圈直徑達(dá)（22.3±0.7）mm。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析，鑒定其為弗氏甲基桿菌（Methylobacterium frigidaeris）。該菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血弧菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯氏菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑分別為（27.4±0.4）mm、（20.7±0.1）mm、（18.1±0.9）mm、（20.0±1.4）mm、（27.6±0.3）mm、（17.8±0.7）mm、（18.1±1.4）mm、（28.1±1.0）mm，具有較廣的抑菌譜。