赤霞珠干紅葡萄酒SO2與O2消耗動力學研究

彭 昕，李函倫，李澤涵，楊 凡，艾賽提·阿合旦，楊興元，2*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)微生物學會，新疆 烏魯木齊 830001）

氧氣在釀酒過程中至關重要，在葡萄酒生產(chǎn)過程中使用適宜的氧可以提高葡萄酒的品質(zhì)[1]。眾所周知，溫和的氧化可以改善紅葡萄酒的顏色，由于氧氣與花青素的反應，顏色更加穩(wěn)定，與單寧反應而產(chǎn)生的澀味和苦味軟化，然而氧氣也會產(chǎn)生不良和不可預測的影響[2-3]。在這種情況下，需要研究氧氣消耗對葡萄酒成分的不同影響，以及更好地了解葡萄酒氧化中SO2作用的機制。由于多種原因，如多酚含量較低，以及許多葡萄酒品種香氣的氧敏感性質(zhì)，葡萄酒抗氧化性和SO2的使用和其他抗氧化劑仍然存在一個重要問題。

許多學者認為SO2不直接與O2反應。當氧氣溶解在葡萄酒中時，由銅和鐵等金屬催化的一系列氧化反應會氧化酚類化合物[4-5]。在此過程中，形成高活性物質(zhì)如醌和過氧化氫，SO2是與兩種中間體反應的關鍵組分。如果存在SO2，則與H2O2反應，將其還原成H2O并將其自身氧化成硫酸鹽[6-7]。此外，SO2可以與醌反應，將其還原成兒茶酚或通過親核反應生成兒茶酚磺酸鹽。如果沒有SO2，H2O2會引發(fā)芬頓（Fenton）反應，其中Fe2+在羥基自由基（·OH）中轉(zhuǎn)化H2O2，羥基自由基是最活潑的氧自由基之一，能夠從有機化合物中提取氫原子成為H2O[8-9]。這是乙醇氧化成乙醛的主要原因，乙醛如果積累，將賦予葡萄酒特有的氧化氣味。這些反應是葡萄酒中影響酚類和芳香類化合物的重要途徑。GABRIELE M等[10]通過研究多酚與氧氣的氧化進程發(fā)現(xiàn)，其進程可以被SO2緩解，在微氧處理下的葡萄酒中SO2添加量越大，葡萄酒的微氧效應越緩慢，達到預期效果越久。

本實驗通過研究在5次空氣飽和循環(huán)過程中溶解氧的消耗規(guī)律、SO2的消耗規(guī)律、葡萄酒酚類物質(zhì)的變化，以期建立SO2與O2消耗的偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸模型，通過飽和循環(huán)中檢測SO2與O2的變化快捷的分析葡萄酒中的酚類物質(zhì)含量，深入了解與葡萄酒消耗O2直接或間接相關的不同過程，進而更便捷的分析葡萄酒質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年赤霞珠干紅葡萄酒（A1）、2020年赤霞珠干紅葡萄酒（A2）：新疆吐魯番新葡王葡萄酒有限公司，橡木桶存放于公司地下酒窖。

模擬酒（A3、A4）（酒石酸5 g/L，pH3.2）：挑選成熟度好的葡萄，破碎收集葡萄皮，提取色素，輔以色素浸提液、乙醛、單寧酸、Fe2+、Cu2+[11]。貯存于5 L不銹鋼罐中。

4種酒樣的部分理化指標見表1。

表1 不同酒樣的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of different wine samples

二氯甲烷、甲醇、己烷（均為色譜純）：北京迪科馬科技有限公司；乙醚、丙酮（均為色譜純）：寶雞市國康生物科技有限公司；甲酸、乙醇、乙腈、硫酸（均為色譜純）：上海諾泰化工有限公司。

1.2 儀器與設備

YRE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；AA-3300F原子吸收分光光度儀：上海元析儀器有限公司；TANK PRO微波消解儀：上海新儀微波化學科技有限公司；APUS PLUS高效液相色譜儀：成都珂睿科技有限公司；便攜式溶解氧測定儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；JA1003電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；SDSCY10微型充氧儀：濟南金君電子科技有限公司；722G可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空氣飽和葡萄酒制備

每個樣品取500 mL，在1 L密閉燒瓶中輕輕搖動10 s，之后打開蓋子讓空氣進入，并且搖動2次，然后將空氣飽和的葡萄酒分配在螺旋蓋的60 mL小瓶中，嚴格避免任何頂部空間。當葡萄酒消耗90%的初始氧氣或7 d后，將剩余的葡萄酒從室中取出以進行新的飽和。按照前述方法進行操作，一共累計5次飽和。

1.3.2 空氣飽和循環(huán)中葡萄酒溶解氧的測定

使用便攜式溶解氧分析儀，每天至少監(jiān)測兩次所有小瓶溶解氧（dissolved oxygen，DO）含量。

1.3.3 單體酚含量的測定

單體酚含量的檢測參考文獻[12]的方法；洗脫程序參照韓國民等[13]的方法。

1.3.4 銅、鐵離子含量的測定

葡萄酒中的銅、鐵離子參考黃河柳[14]的方法。

1.3.5 總乙醛的測定

采用氣相色譜法測定總乙醛[15]，通過注射1 L用2-丁醇作為內(nèi)標的葡萄酒樣品。DB-WAX（30 m×0.53 mm×2 μm）毛細管柱，噴射器保持在250 ℃，分流比為1∶4。氫氣（H2）用作載氣，壓力保持在27.5 kPa。升溫程序為初始溫度50 ℃、保持5 min，然后在10 min內(nèi)升至220 ℃?；鹧骐x子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度為250 ℃，補充氣體的檢測器氣體流量為95 kPa，氫氣為35 kPa，空氣為60 kPa。分析一式兩份進行。在含有已知量乙醛的模型酒（5 g/L酒石酸，12%乙醇，1.5%丙烷-1,2-二醇，10 g/L甘油，pH 3.2）中進行外部校準。

1.3.6 葡萄酒基礎理化指標分析

SO2含量根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]規(guī)定的方法檢測，酒精度、總酸、pH、揮發(fā)酸利用葡萄酒全自動分析檢測儀進行檢測。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

使用Unscrambler 9.7進行偏最小二乘（PLS）回歸。相關性研究在Excel 2013中進行，使用Origin 8.5進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣飽和循環(huán)中葡萄酒溶解氧的變化情況

不同酒的耗氧情況見表2。

表2 空氣飽和循環(huán)中葡萄酒溶解氧的變化Table 2 Changes of dissolved oxygen in wine during air saturated cycle

由表2可知，A1葡萄酒的初始耗氧量高于其他組，在25 d內(nèi)耗氧率逐漸下降，其他組與A1耗氧情況相似，分析原因可能是單寧、SO2以及葡萄酒本身具有大量的耗氧物質(zhì)，在第一次氧飽和階段內(nèi)參與氧化反應消耗了大量的氧，隨著反應底物的減少，反應的速率逐漸下降。

以A2葡萄酒為例，消耗的氧氣總量與時間的關系（圖1）可知，氧氣在飽和后的第一天內(nèi)消耗得非常快，而在最后一次飽和中，溶解氧含量先快速下降再緩慢增加。分析原因是產(chǎn)生了芬頓反應，其中乙醇通過自由基作用機理氧化成乙醛。并且最后一次飽和中的游離SO2水平非常低，在這種情況下，當沒有可用于清除H2O2的SO2發(fā)生反應時。羥基自由基將與O2反應，產(chǎn)生作為反應子產(chǎn)物的過氧化氫和氧氣[17]。通過這一現(xiàn)象并應用線性回歸分析，可以估算其耗氧率，即初始速率和平均速率。

圖1 空氣飽和循環(huán)中A2葡萄酒溶解氧的變化Fig.1 Changes of dissolved oxygen in wine A2 during air saturated cycle

2.2 空氣飽和循環(huán)中葡萄酒總SO2的變化情況

葡萄酒在空氣飽和循環(huán)中總SO2含量的變化見圖2。由圖2可知，SO2在幾個飽和循環(huán)期間沿著線性趨勢降低，圖中每個處理組末端斜率較前面幾次飽和變得陡峭，這意味著在最后的飽和中消耗更多的SO2，但A2的總SO2含量在10 d之后變化不明顯。結(jié)合耗氧率分析，其中最后兩次飽和中O2的消耗非常低，但SO2消耗量很大。這表明在所有葡萄酒中SO2以恒定的時間速率消耗，而O2在試驗中以逐漸降低的速率消耗，這表明前期在飽和中氧化的一些化學物質(zhì)在兩周后被SO2還原回來。

圖2 每次空氣飽和循環(huán)結(jié)束時總SO2含量的變化Fig.2 Changes of total SO2 content at the end of each air saturation cycle

2.3 耗氧率對葡萄酒成分的影響

表3總結(jié)了在氧飽和循環(huán)時葡萄酒所進行的化學變化，以及它們與OCR的相關性。正相關系數(shù)屬于在氧化過程中水平降低的物種，表明在較為快速消耗氧氣的葡萄酒中消耗較大。這部分可能與目前用于表征葡萄酒中酚類聚合物部分的分析的局限性有關。由表3可知，具有高初始OCR的葡萄酒具有不同的氧化模式，其特征在于通過解聚釋放的一些亞基而降低，例如表兒茶素和表兒茶素-3-O-沒食子酸酯以及兒茶素。葡萄酒中酚類成分氧化引起的主要變化是酚酸含量的相關增加以及黃烷醇和黃酮醇含量的降低。苯甲酸含量平均增加5.2 mg/L和羥基肉桂酸增加3.713 mg/L，表明當SO2消耗量低時，這些物質(zhì)會優(yōu)先與氧發(fā)生反應。相反，在SO2＜10 mg/L時，山奈酚的減少與O2負相關。初始OCR與表沒食子兒茶素和銅顯著正相關（P＜0.05）。10 d的OCR與銅呈正相關。

表3 氧化期間氧、二氧化硫消耗與各參數(shù)的平均增量之間的相關系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between the average increment of each parameter and O2,SO2 consumption

2.4 葡萄酒溶解氧飽和循環(huán)中O2和SO2消耗相關的PLS模型建立

PLS模型解釋了與葡萄酒的O2和SO2消耗相關的不同動力學參數(shù)，葡萄酒成分主要變化的函數(shù)。

建立具有預測能力的PLS模型，PLS模型解釋了與葡萄酒的O2和SO2消耗相關的不同動力學參數(shù)，葡萄酒成分主要變化的函數(shù)，結(jié)果見表4。所有模型在結(jié)構(gòu)上都非常相似，通過交叉驗證解釋了原始方差的89.7%～95.9%。

表4 O2和SO2消耗相關的偏最小二乘法回歸模型Table 4 Partial least squares regression model for O2 and SO2 consumption

銅和黃酮醇以及羥基肉桂酸是決定初始OCR的關鍵化合物，初始OCR與葡萄酒初始含量的總乙醛、沒食子酸以及單寧中兒茶素的含量呈負相關，較高R2說明在葡萄酒中這些化合物以較慢的速率消耗氧氣。相反，葡萄酒中的表兒茶素-3-O-沒食子酸酯和銅可以更快地消耗氧氣。此模型與SANTOS M C等[19]所建立的模型非常相似，保持負相關的化合物是總乙醛，通過間苯三酚解離的黃烷醇單體（表兒茶素-3-O-沒食子酸）以及單寧的一些衍生物組成亞基。

利用PLS建模將初始OCR與第二次飽和期間觀察到的化學變化聯(lián)系起來。該模型表明，具有高初始OCR的葡萄酒產(chǎn)生較少量的總乙醛，這可能是由于這些葡萄酒含有大量乙醛反應性多酚，因此乙醛將通過反應迅速除去。該模型還表明，含有表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的單寧在具有高初始OCR的葡萄酒中被消耗，而在具有低初始OCR的葡萄酒中略微產(chǎn)生。在低OCR的葡萄酒中，兒茶素、沒食子酸和單寧在快速的降低，這表明它們可能是氧化中消耗的底物，可能是通過與SO2反應，并且這種消耗在低濃度的溶解氧下更強烈。可以從PLS模型中提取的最后一點是，紅葡萄酒中的不同OCR涉及單寧解聚釋放不同，在較低的OCR中，O2的緩慢消耗與兒茶素減少和表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的增加有關，但較高的OCR與表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的變化量顯著性相關（P＜0.01）。

2.5 SO2的消耗量及其與初始化學成分的關系

通過PLS建模進行評估（交叉驗證為94%），該模型的最大系數(shù)是游離SO2，這意味著葡萄酒消耗SO2的第一個明顯必要條件是游離形式。其中總SO2的含量對SO2消耗有影響。可能是與花青素形成絡合物，而紅葡萄酒中游離SO2的活性較小，并且還歸因于它們通過促進結(jié)合SO2解離的縮合反應除去游離乙醛的較高能力。該模型還表明，葡萄酒在氧化過程中消耗SO2的能力與其pH，總酚含量呈正相關。

3 討論

低濃度的SO2不再起任何還原作用，但氧氣仍在快速的被消耗，這表明葡萄酒中仍有其他物質(zhì)可以利用氧，結(jié)合A3初始耗氧率以及初始消耗SO2的由此可推測在并非所有的SO2都作用于溶解氧上，既存在非SO2消耗的氧，在前期的氧化過程中，葡萄酒里面的抗氧化的成分通過氧化還原消耗氧氣，這一部分是在第一飽和期被其他親核性物質(zhì)消耗的[20]。

第一次飽和期間的低SO2消耗表明葡萄酒應含有能夠與SO2競爭主要在O2吸收時形成的Fe（III），醌或氧化過程中產(chǎn)生的H2O2的其他成分[21]。這些成分將在第一次飽和時耗盡，這解釋了為什么在第二次飽和時SO2的消耗增加。由表3可知，SO2消耗量與葡萄酒中游離或總SO2含量之間的相關性比較差，這表明可能還有以下兩種影響SO2消耗量的因素：在消耗SO2之前存在能夠與醌反應的親核物質(zhì)[22]；在消耗SO2之前存在能夠與Fe（III）或H2O2反應的抗氧化劑[23]。

基于表中所示的相關系數(shù)，表沒食子兒茶素在第二次飽和過程中所涉及的反應性多酚，含有較高水平這些化合物的葡萄酒在氧化過程中將消耗較高水平的SO2[24]。相反，富含兒茶素的單寧屬于第四類，因此，這些單寧中最豐富的葡萄酒在氧化過程中幾乎不會消耗SO2。

乙醛所起的明顯作用導致乙醛反應性多酚可能是決定O2消耗動力學的關鍵因素。不同的初始OCR還涉及能夠進行解聚的單寧不同變化：低初始OCR與兒茶素的快速減少和表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的增加有關；較高的OCR與表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的降低以及兒茶素增加有關。

A1中葡萄酒黃烷-3-醇單體的含量高于表兒茶素。磺化黃烷醇的來源來自原花青素的裂解，通過裂解黃烷鍵和SO2對C4陽離子的破壞。由于陳釀葡萄酒中黃烷-3-醇磺酸鹽的含量隨著SO2含量的增加而增加，在陳釀過程中損失的SO2大部分被氧消耗。此外，由于具有較高SO2含量的葡萄酒單寧水平較低，這表明SO2在陳釀過程中改變了單寧特征，這一過程可能影響陳年酒的澀味感，單寧磺化可能導致老化紅葡萄酒中澀味下降[25]。

4 結(jié)論

建立氧化過程中與消耗的O2總量、非SO2消耗的O2參數(shù)相聯(lián)的葡萄酒成分的PLS模型。消耗的總O2模型表明，O2主要投入氧化SO2和生產(chǎn)乙醛和乙酸，這是葡萄酒的主要氧化產(chǎn)物。在沒有伴隨的SO2消耗O2的模型表明，除了氧化乙醇之外，O2還用于黃酮醇的降解和羥基肉桂酸的產(chǎn)生。

建立與初始OCR相關聯(lián)的葡萄酒成分的PLS模型。根據(jù)該模型，初始OCR與總乙醛、沒食子酸中的葡萄酒初始含量以及單寧中兒茶素的含量呈負相關，較高R2說明在葡萄酒中這些化合物的以較慢的速率消耗氧氣。

建立了解釋SO2消耗率的PLS模型。該模型通過交叉驗證解釋了92%的方差，主要變量是游離SO2和總酚含量。既葡萄酒中一般抗氧化劑與氧化底物。因此，該模型表明，雖然大多數(shù)葡萄酒多酚被氧化伴隨著SO2的消耗，但具有清除活性的化合物可能與SO2競爭一些自由基。

通過檢測飽和循環(huán)中SO2與O2的變化而建立相關模型，對預測以及分析葡萄酒中的酚類物質(zhì)含量變化有顯著的作用。