響應(yīng)面法優(yōu)化葛根蛋白酶解工藝及其體外抗氧化特性分析

龐會娜，董紅影，肖鳳琴，張紅印，韓榮欣，王海東，嚴(yán)銘銘,2, ，邵 帥,2,

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117；2.吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林長春 130117）

葛根為多年生豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd）.Ohwi或甘葛藤的干燥塊根，習(xí)稱野葛，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]。目前報道的葛根化學(xué)成分主要有異黃酮類、三萜類、皂苷類、生物堿類、香豆素類和多糖類等成分[2-3]，在保護心肌[4]、解酒保肝[5]、降血脂[6]、降血糖[7]和抗氧化等方面具有顯著的藥用價值。此外，葛根中還含有淀粉、膳食纖維、礦物元素等營養(yǎng)成分，以及多種人體必需氨基酸，尤其是人體不能合成的必需氨基酸含量更高[8]。

細(xì)胞的氧化代謝會產(chǎn)生自由基，過量的自由基會使細(xì)胞和組織發(fā)生損傷，還會引起多種疾病如心血管疾病、糖尿病、癌癥等。因此，食源性抗氧化肽作為一類天然抗氧化活性物質(zhì)受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[9]。葛根蛋白作為一種食源性蛋白屬于豆科植物蛋白，具有脂肪少、膽固醇低等優(yōu)點[10]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究認(rèn)為，由于蛋白質(zhì)具有分子量大結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點，當(dāng)攝入人體后難以發(fā)揮其營養(yǎng)價值和生理功能[11]。因此對蛋白進(jìn)行水解，降低蛋白分子量提高其活性成為了研究熱點，蛋白酶解是目前生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物的主要途徑[12]。蛋白質(zhì)通過酶解可以生成多種生物活性肽，能夠很好地改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)及生物活性[13]。通過查閱文獻(xiàn)可知，目前對葛根的研究主要集中在黃酮類成分及葛根蛋白的研究，而未見其對葛根蛋白酶解物的研究。

因此，在本課題組前期對葛根蛋白研究的基礎(chǔ)上，以葛根蛋白為原料，采用單因素實驗，結(jié)合響應(yīng)面分析方法對葛根蛋白酶解物的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，將最佳條件下所得酶解物進(jìn)行抗氧化特性研究，為葛根蛋白的深入開發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根藥材 北京本草方源藥業(yè)集團有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（300 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司。

OSB-2100油浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；PB-10賽多利斯臺式數(shù)顯酸度計 上海諾萱科學(xué)儀器有限公司；5804R低溫離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；DRC-2L冷凍干燥機 北崎國際貿(mào)易有限公司；K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-rad蛋白電泳儀 美國Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根蛋白的制備 取適量葛根藥材，按照料液比1:20（g/mL）的比例加入蒸餾水，攪拌均勻，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0，于45 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h，冷卻至室溫，4000 r/min離心，取上清，用1.0 mol/L的HCl調(diào)pH至3.5，沉淀復(fù)融后透析48 h，冷凍干燥[14]。

1.2.2 最適蛋白酶篩選 稱取5份質(zhì)量相同的葛根蛋白用蒸餾水配制成底物濃度為2%的溶液，按照酶底比為1%的比例，分別加入不同蛋白酶，然后在各自最適溫度和 pH條件下（詳見表1），酶解3 h。酶解后立即于100 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH至中性，于4 ℃下8000 r/min離心15 min，取上清液[15]。以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，同時結(jié)合水解度、SDS-PAGE電泳，篩選出最適合葛根蛋白酶解的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimum enzymatic hydrolysis conditions of five proteases

1.2.3 葛根蛋白酶解工藝的單因素實驗 以DPPH自由基清除率和水解度為評價指標(biāo)，對篩選出的最適蛋白酶進(jìn)行單因素實驗，研究各因素對葛根蛋白酶解過程的影響，固定酶解溫度55 ℃，酶解時間3 h，底物濃度2%，酶底比1%，酶解pH8.5進(jìn)行實驗。各變量因素水平分別設(shè)定為酶解溫度（35、45、55、65、75、85 ℃）、酶底比（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、pH（6.5、7.5、8.5、9.5、10.5）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）、底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%），各組試驗均重復(fù)3次。

1.2.4 葛根蛋白酶解工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素水平表見表2，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，優(yōu)化葛根蛋白最佳酶解工藝，并進(jìn)行試驗驗證。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface test

1.2.5 指標(biāo)測定

1.2.5.1 水解度測定 采用凱氏定氮法來測定葛根蛋白中總氮含量；采用酸度計法來測定酶解液中氨基態(tài)氮的含量，水解度計算公式如下：

式中：DH：水解度（%）；m1：樣品質(zhì)量（g）；m2：樣品總氮質(zhì)量（g）；V1：樣品稀釋液加入甲醛后pH調(diào)至9.2時消耗NaOH的體積（mL）；V2：空白試驗加入甲醛后pH調(diào)至9.2時消耗NaOH的體積（mL）；c：NaOH的濃度（mol/L）；V3：樣品稀釋液的取用量（mL）；V4：樣品稀釋液的定容體積（mL）。

1.2.5.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：分離膠與濃縮膠的濃度分別為12%、5%，Marker上樣量為5 μL，葛根蛋白酶解物樣品上樣量為15 μL。電泳條件：濃縮膠電壓70 mV，時間30 min；分離膠電壓140 mV，時間50 min。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R250染色40 min，脫色，Invitrogen iBright FL 1000掃描成像。

1.2.6 葛根蛋白酶解物的體外抗氧化特性試驗

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改如下：將配制好的葛根酶解物溶液2 mL加入到2 mL 0.004%的DPPH溶液中，渦旋后，放置暗室反應(yīng)30 min，于517 nm處進(jìn)行測定，得到吸光度值A(chǔ)1；以2 mL乙醇代替DPPH溶液作為樣品對照，測定得吸光度值A(chǔ)2；以2 mL蒸餾水代替樣品液作為空白對照，測定得吸光度值A(chǔ)0。以1 mL乙醇+1 mL水作為空白調(diào)零，VC作為陽性對照。按下列公式計算：

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[18]修改如下：用pH7.4 PBS緩沖溶液將0.2 mL ABTS+工作液進(jìn)行稀釋，調(diào)至734 nm處吸光度值為0.7±0.2；取10 μL不同濃度葛根蛋白酶解物樣品溶液與0.2 mL ABTS+工作液進(jìn)行混合，常溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm波長測定吸光度，VC為陽性對照，按下列公式計算：

式中：A1為樣品+ABTS+測得的吸光度值；A0為PBS+ABTS+測得的吸光度值。

1.2.6.3 羥基自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]修改如下：取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，加入0.2 mol/L pH7.4 PBS緩沖溶液2 mL，再分別加入不同濃度葛根蛋白酶解物樣品溶液1 mL，混勻后加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL以及0.025% H2O2溶液1 mL，充分混勻。37 ℃下反應(yīng)30 min，于536 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，用蒸餾水調(diào)0。蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度值A(chǔ)0；蒸餾水代替H2O2溶液，測定吸光度值A(chǔ)2，按下列公式計算：

1.2.6.4 總還原能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[20]修改如下：分別取葛根蛋白酶解物溶液2.5 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1% K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃反應(yīng)20 min后冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心，取上清液、蒸餾水、0.1%FeCl3溶液按1:1:5的比例混勻，靜置，在700 nm處測定吸光度值A(chǔ)1；用蒸餾水代替1% K3Fe（CN）6溶液，測定吸光度值A(chǔ)2。以蒸餾水作為空白調(diào)零，VC作為陽性對照組。按下列公式計算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以X±S表示，采用Origin 9.0和Design-Expert V8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適水解蛋白酶的確定

蛋白酶酶解是目前生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解物的主要途徑。本試驗以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，同時結(jié)合水解度、SDS-PAGE電泳，對4種酶進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖1～圖2。

圖1 不同酶對酶解物水解度及抗氧化性的影響Fig.1 Effects of different enzymes on hydrolysis degree and antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖2 葛根蛋白及其酶解物的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of Pueraria protein and its hydrolysates

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率較其他酶解產(chǎn)物而言較高，且水解度也高，原因可能是堿性蛋白酶酶解更易生成抗氧化活性高、分子量小的多肽[21]；SDS-PAGE電泳圖（圖2）顯示，葛根蛋白的亞基分子質(zhì)量主要集中在70、40、35、25、10 kDa，經(jīng)不同蛋白酶酶解后，高分子量亞基均不同程度的降低，其中堿性蛋白酶酶解物高分子量亞基最少，且低分子量亞基明顯高于其它酶解物，說明堿性蛋白酶酶解效果好于其它幾種蛋白酶。綜合考慮水解度和DPPH自由基清除能力，葛根蛋白制備酶解物的最適宜蛋白酶為堿性蛋白酶，因此選用堿性蛋白酶對葛根蛋白進(jìn)行后續(xù)試驗的酶解研究。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除率的影響 酶解溫度的高低變化是影響酶促反應(yīng)的重要因素之一，由圖3可知，葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。這主要是因為溫度過低，蛋白酶的活性未被完全激活[22]，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時，大部分酶的活性被激活，因此此時葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度達(dá)到最大值。但隨著溫度繼續(xù)升高，活性反而下降，其原因可能是溫度過高酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，使酶活性降低，從而導(dǎo)致酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度下降[23]，所以選擇酶解溫度45、55、65 ℃進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖3 酶解溫度對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging ability of Pueraria protease hydrolysate

2.2.2 酶底比對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除率的影響 由圖4可知，當(dāng)酶底比在0.5%～2%范圍內(nèi)，隨加酶量增加，葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度隨著酶底比的增大呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；當(dāng)酶底比為2%時，DPPH自由基清除能力和水解度均達(dá)到最高值分別為86.1%和24.3%；之后繼續(xù)增加酶底比，兩個指標(biāo)變化不明顯。這可能是因為酶與底物的結(jié)合達(dá)到飽和，使得酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度不再增加趨于平緩[24]。所以選擇酶底比1.5%、2%、2.5%三個水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖4 酶底比對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of enzyme substrate ratio on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging ability of Pueraria protease hydrolysate

2.2.3 酶解pH對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除率的影響 由圖5可知，葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力和水解度隨著pH的增高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH8.5時兩個指標(biāo)達(dá)到最大。推測原因是酶解體系環(huán)境pH過高或過低會造成酶活力降低甚至是失活，導(dǎo)致酶與底物結(jié)合效率減弱，使得酶解效率降低[25]。所以選擇酶解pH7.5、8.5、9.5進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖5 酶解pH對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of enzymatic hydrolysis pH on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging ability of Pueraria protease hydrolysate

2.2.4 酶解時間對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除率的影響 由圖6可知，隨著時間的增長，葛根蛋白酶解物對DPPH自由基清除能力和水解度的影響，隨著時間的增長而上升，最后達(dá)到一定值之后基本保持不變。其原因可能是當(dāng)酶解反應(yīng)剛開始的時候，酶的活性和底物濃度較高，反應(yīng)速度較快，當(dāng)時間到達(dá)3 h時基本達(dá)到最高值，可能是因為隨著酶解時間的增加，底物濃度有所下降，導(dǎo)致水解度增幅減緩[26]，所以選擇3 h作為酶解時間。

圖6 酶解時間對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging ability of Pueraria protease hydrolysate

2.2.5 底物濃度對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除率的影響 由圖7可知，隨著底物濃度的不斷增加，葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除率和DH不斷升高，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^2%時，兩個指標(biāo)均有所下降。這可能是因為底物濃度會影響蛋白酶與底物的結(jié)合，所以當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?%時，增加底物濃度對蛋白酶與底物的結(jié)合具有一定的促進(jìn)作用，從而使得酶解物中的抗氧化活性物質(zhì)隨之增加；當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^2%時，反應(yīng)體系濃度過高，會對蛋白酶的分散性和活性物質(zhì)的釋放造成一定的影響[27]。所以選擇底物濃度2%進(jìn)行酶解。

圖7 底物濃度對葛根蛋白酶解物水解度及DPPH自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging ability of Pueraria protease hydrolysate

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以DPPH自由基清除能力為評價指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，結(jié)果見表3。

通過Design-Expert 8.0軟件對3因素進(jìn)行回歸擬合，根據(jù)表3得到的多元二次回歸方程為Y=86.09+1.55A+5.20B+6.17C+1.57AB-1.00AC+1.85BC-6.24A2-5.80B2-5.93C2。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken test

對葛根蛋白酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，由方差分析結(jié)果可知（表4），該模型P＜0.0001為極顯著，失擬項P＞0.05為不顯著，說明方程具有良好的擬合性，可用該回歸方程進(jìn)行試驗分析。該模型的決定系數(shù)R2＞0.9，表明實測值與預(yù)測值之間具有較好的相關(guān)性；模型調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.9778，能夠說明97.78%的試驗結(jié)果，對實際試驗擬合良好。酶解溫度、酶解pH及酶底比三個因素對響應(yīng)值的影響顯著性可用F值來評價[28]，由表4可知，F(xiàn)（A）=12.74，F(xiàn)（B）=143.77，F(xiàn)（C）=202.87，即各因素對葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力影響順序為酶底比＞pH＞酶解溫度，三個因素對葛根蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力影響均極顯著（P＜0.01）。

表4 二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance results of quadratic regression model

2.3.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析 運用 Design-Expert V8.0.6軟件，分析響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，得到的響應(yīng)面曲面圖，該圖能反映各因素以及因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，試驗結(jié)果見圖8。三維圖譜和等高線圖能夠更加直觀地研究交互因素間的相互作用情況。由圖8a、圖8b可知，等高線的形狀與橢圓形相近，響應(yīng)面陡峭，表明AB（溫度和pH）以及BC（酶底比和pH）的交互作用對DPPH自由基清除能力的影響較大[29]。圖8c的等高線形狀與圓形非常相近，響應(yīng)面也較為平緩，說明AC兩因素之間的交互作用對DPPH自由基的清除作用影響較小。

圖8 響應(yīng)面與等高線分析圖Fig.8 Response surface and contour analysis diagram

2.3.3 驗證試驗 運用 Design-Expert V8.0.6軟件對模型進(jìn)行解析，得到了一組堿性蛋白酶酶解葛根蛋白的最優(yōu)條件為：酶解溫度56.47 ℃、pH9.06、酶底比2.3%。在此條件下制備的葛根蛋白酶解物具有良好的DPPH自由基清除能力，其清除率為89.51%。根據(jù)實際操作條件，將葛根蛋白酶解的最佳條件修正為：酶解溫度55 ℃、pH9、酶底比2%。在該條件下所得到的葛根蛋白酶解物對DPPH自由基清除率為88.14%±0.50%，此時水解度為23.6%，與模型預(yù)測值基本一致。

2.4 葛根蛋白酶解物體外抗氧化試驗結(jié)果

身體代謝的過程中會產(chǎn)生自由基，而過多的自由基會引起氧化應(yīng)激從而造成細(xì)胞和組織的氧化損傷，導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生[30]。DPPH·、·OH等自由基是目前最常用的體外抗氧化評價指標(biāo)[31-33]，自由基清除率越大表明抗氧化能力越強。由圖9可知，葛根蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后能夠提高DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基的清除能力及還原能力，且與蛋白相比酶解物清除DPPH自由基、ABTS+自由基、羥基自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）降低，分別為0.15、0.38、1.41 mg/mL。這是由于酶解過程中生物大分子蛋白被酶解成了一些抗氧化性更好的小分子肽[34-35]。

圖9 葛根蛋白和酶解物對DPPH·、ABTS+·、·OH的清除能力及還原能力Fig.9 Scavenging ability of Pueraria protein and enzymatic hydrolysates to DPPH·, ABTS+·, ·OH and their reducing power

3 結(jié)論

本文以葛根蛋白為原料，以DPPH自由基清除能力、水解度為指標(biāo)，結(jié)合SDS-PAGE電泳結(jié)果篩選5種蛋白酶對葛根蛋白的酶解效果，最終得到堿性蛋白酶為酶解葛根蛋白的最佳酶。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除能力為響應(yīng)值，運用響應(yīng)面分析法對葛根蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳酶解條件：酶解溫度55 ℃、酶解pH9、酶底比2%。在最優(yōu)條件下葛根蛋白酶解物對DPPH自由基、ABTS+自由基、OH自由基的清除能力以及還原能力較蛋白均有所提高。

綜上所述，葛根蛋白在堿性蛋白酶條件下得到的酶解產(chǎn)物，與葛根蛋白相比較，具良好的抗氧化活性，表明葛根蛋白酶解產(chǎn)物可作為一種有效的多肽來源添加到食品中去，發(fā)揮相應(yīng)的營養(yǎng)價值，為日后葛根多肽的研究提供一定的參考。