BCL-2 家族及BH3 模擬物在結(jié)直腸癌治療中的研究進(jìn)展

姬宇瀟，姚偉龍，陳淑珍，張澍田

結(jié)直腸癌是在結(jié)直腸組織中形成的一種惡性腫瘤，目前是全世界第三常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。目前，手術(shù)和化療是結(jié)直腸癌的兩種主要治療方案，治療方案的選擇取決于腫瘤分期和瘤體具體位置以及患者的個(gè)體特征[2]。據(jù)報(bào)道幾乎所有接受化療的結(jié)直腸癌患者都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，這限制了抗癌藥物的治療效果，最終導(dǎo)致化療失敗[3]。目前有大量臨床前研究表明，BH3 模擬物可誘導(dǎo)凋亡并使耐藥的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感，但目前尚無臨床研究證實(shí)，需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文對(duì) B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族及其同源結(jié)構(gòu)域 BH3 的模擬物在結(jié)直腸癌治療應(yīng)用中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 BCL-2 家族與結(jié)直腸癌

1.1 BCL-2 家族與細(xì)胞凋亡

在細(xì)胞凋亡過程中，BCL-2 家族成員起著至關(guān)重要的作用，它們具有較高的同源性，含有 BH1、BH2、BH3、BH4 等保守結(jié)構(gòu)域，通過其功能及包含結(jié)構(gòu)域的不同一般將其分為三個(gè)亞家族。第一個(gè)是多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白，包括 BCL-2、BCL-XL、BCL-W、A1、BCL-B 和髓細(xì)胞白血病-1 蛋白（myeloidcell lekemia-1，MCL-1）[4]，它包含所有的 4 個(gè) BCL-2 同源結(jié)構(gòu)域，并通過拮抗其他兩個(gè)促凋亡亞家族的成員促進(jìn)細(xì)胞存活。第二個(gè)亞家族是多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白家族，共有 3 個(gè) BH 結(jié)構(gòu)域（BH1～3），包括 BCL-2 拮抗殺傷蛋白（BCL-2 antagonist killer 1，BAK）、BCL-2 相關(guān) X 蛋白（BCL-2 associated X protein，BAX）以及 BCL-2 卵巢殺傷蛋白（BCL-2 ovarian killer，BOK），這些蛋白聚合后可以形成孔道，通過誘導(dǎo)線粒體外膜通透性升高進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。第三個(gè)亞家族是唯 BH3 促凋亡蛋白，僅具有單一的 BH3 結(jié)構(gòu)域，包括BCL-2 相關(guān)死亡促進(jìn)蛋白（BCL-2 associated death promoter，BAD）、BH3 交互結(jié)構(gòu)域蛋白（BH3-interacting domain，BID）、BH3 交互殺傷蛋白（BH3-interacting killer，BIK）、BCL-2 交互調(diào)節(jié)蛋白（BCL-2 interacting mediator，BIM）、BCL-2 修飾因子（BCL-2 modifying factor，BMF）、自殺蛋白（Harikari，HRK）、佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸誘導(dǎo)蛋白 1（phorbol-12-myriatate-13-acetate-induced protein 1，PMAIP1/NOXA）、p53 上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)蛋白（p53 upregulated modulatar of apoptosis，PUMA）[5]。在健康細(xì)胞中，多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白可以與被部分激活的 BAX 和 BAK 結(jié)合，通過抑制 BAX/BAK 聚合起到抗凋亡的作用，唯 BH3蛋白可以通過結(jié)合抗凋亡的 BCL-2 蛋白，從而游離出BAX/BAK，或通過直接激活這些凋亡效應(yīng)器來啟動(dòng)凋亡[6]。決定細(xì)胞是傾向于生存還是死亡的最重要因素正是這些促凋亡和抗凋亡蛋白的相對(duì)濃度以及不同家族成員之間的親和力，各種 BCL-2 家族蛋白彼此結(jié)合的特異性不同，形成了復(fù)雜但有序的激活網(wǎng)絡(luò)，決定著細(xì)胞的命運(yùn)。

1.2 BCL-2 家族與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展

在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在基因的變異及表觀遺傳學(xué)的異常。根據(jù)以往研究我們得知，BCL-2 家族蛋白隨著結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展可發(fā)生差異性的表達(dá)，這在一定程度上提供了治療的新思路。

1.2.1 正常組織和腺瘤組織中 BCL-2 家族蛋白表達(dá) 在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中，細(xì)胞凋亡逐漸受到抑制。正常組織和腺瘤組織中 BCL-2 家族蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)（IHC）分析表明，在轉(zhuǎn)化過程中，BCL-2 家族各成員的表達(dá)水平存在差異性變化。IHC 數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸腺瘤的抗凋亡蛋白 BCL-XL 水平升高，而 BCL-W 幾乎檢測(cè)不到，BCL-2和 MCL-1 染色在不同的研究中顯示出不一致的結(jié)果，雖然一些研究發(fā)現(xiàn)腺瘤中 BCL-2 蛋白水平升高，但也有報(bào)告表明，與正常組織相比，BCL-2 蛋白表達(dá)降低或無變化[7]。

1.2.2 結(jié)直腸癌組織中 BCL-2 家族蛋白表達(dá) 目前有相關(guān)研究表明，BCL-2 在結(jié)直腸癌細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜均有表達(dá)，其在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽性率高于正常結(jié)直腸組織及癌旁組織，表達(dá)水平與腫瘤直徑及 TNM 分期有關(guān)，TNM 分期越高，BCL-2 表達(dá)水平越高[8]，但 BCL-2 表達(dá)水平與預(yù)后有無關(guān)聯(lián)，目前尚無定論。研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1 在正常腸道上皮組織中水平很低，但在結(jié)直腸癌組織中水平升高[9]，同時(shí)，MCL-1 的蛋白水平同結(jié)直腸癌的分級(jí)及惡性程度相關(guān)，分級(jí)越高、惡性程度越高的結(jié)直腸癌組織中 MCL-1 水平越高[10]。BCL-XL 在 38%～52% 的結(jié)直腸癌中高表達(dá)[11]，研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中 BCL-XL 的蛋白水平是顯著上調(diào)的，這提示我們?cè)诮Y(jié)直腸癌中 BCL-XL 的作用非常重要[10]。癌癥患者樣本中的 BCL-2 表達(dá)也與癌癥進(jìn)展相關(guān)，這其中包括結(jié)直腸癌中的肝轉(zhuǎn)移[12]。其次，癌癥患者樣本中 BCL-XL 的上調(diào)已被報(bào)道與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。

2 BH3 模擬物與結(jié)直腸癌

2.1 BH3 模擬物的靶向治療

結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程對(duì) BCL-2 家族的依賴性提供了一個(gè)治療的機(jī)會(huì)窗口，我們可以據(jù)此特異性地靶向相關(guān)癌細(xì)胞的凋亡。目前，被稱為 BH3 模擬物的高度特異性小分子抑制劑已被開發(fā)出來，通過模擬唯 BH3 蛋白的作用起到抑制腫瘤組織生長的作用[7]。

2.1.1 BH3 模擬物與抗腫瘤 BH3 模擬物即唯 BH3 域蛋白小分子模擬物，能夠直接結(jié)合 BCL-2 抗凋亡蛋白并拮抗其抗凋亡功能，促使與其結(jié)合的促凋亡蛋白 BAX/BAK的釋放，或唯 BH3 蛋白的釋放，最終激活 BAX/BAK 蛋白，從而特異、廣譜、高效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。目前多應(yīng)用于白血病等血液系統(tǒng)疾病，小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤亦可見相關(guān)臨床應(yīng)用。根據(jù)其靶點(diǎn)不同可大致分為泛靶點(diǎn)抑制劑、雙靶點(diǎn)抑制劑、單靶點(diǎn)抑制劑。部分 BH3 模擬物實(shí)體瘤相關(guān)臨床試驗(yàn)見表 1。

表1 BH3 模擬物臨床試驗(yàn)

2.1.2 BH3 模擬物結(jié)直腸癌臨床前作用機(jī)制研究 在結(jié)直腸癌領(lǐng)域 BH3 模擬物的相關(guān)研究主要包含特定模擬物分子作用機(jī)制以及細(xì)胞、動(dòng)物水平臨床前實(shí)驗(yàn)，尚無臨床試驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)。研究表明多靶點(diǎn)抑制劑 obatoclax（GX15-070）可能通過誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞 HCT 116 中的β-連環(huán)蛋白失穩(wěn)或下調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞 Dexter-1 中的淋巴增強(qiáng)因子 1（lymphoid enhancer factor 1，LEF1）來抑制WNT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)從而使 survivin 下調(diào)促發(fā)凋亡機(jī)制[14]。BCL-2/BCL-XL 雙靶點(diǎn)抑制劑 BM-1197 的功效也在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，它增加了細(xì)胞周期亞 G1期的細(xì)胞比例，進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡，并增加了細(xì)胞核小體間的DNA 斷裂[15]。TW-37 是一種新開發(fā)的小分子 BCL-2 抑制劑，其靶向多個(gè)抗凋亡 BCL-2 蛋白成員，在目前的研究中，僅使用納摩爾濃度的 TW-37 便可抑制 HCT-116 細(xì)胞和原代人結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活和增殖。同時(shí)，TW-37 誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞 caspase-3/9 活化和凋亡，在小鼠體內(nèi)，靜脈注射TW-37 可抑制小鼠 HCT-116 腫瘤生長[16]，這表明，TW-37靶向 BCL-2 家族蛋白可能是抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的一種良好策略。亦有研究表明多靶點(diǎn)抑制劑 navitoclax 在結(jié)直腸癌治療中與雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物 1/2（target of rapamycin complex 1/2，TORC1/2）抑制劑起到協(xié)同作用[17]。

2.1.3 BH3 模擬物結(jié)直腸癌治療可行性 雖然目前還沒有專門的臨床試驗(yàn)測(cè)試 BH3 模擬物的療效，但有證據(jù)表明這些抑制劑在結(jié)直腸癌治療中使用的可行性，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的所有階段都可以觀察到抗凋亡蛋白的去調(diào)節(jié)表達(dá)，這些變化可以指導(dǎo)使用 BH3 模擬物進(jìn)行治療。最近在一組不同細(xì)胞系中進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，BCL-2 的依賴性與BCL-2 的表達(dá)水平直接相關(guān)，高表達(dá)者對(duì) BCL-2 單靶點(diǎn)抑制劑 ABT-199 更加敏感[18]。BCL-2 在隱窩干細(xì)胞中的表達(dá)，在促進(jìn)腸干細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腺瘤存活中發(fā)揮重要作用，這表明 BCL-2 是家族性腺瘤性息肉病等高危情況下結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防的潛在靶點(diǎn)[19]。然而，隨著病情的發(fā)展，BCL-2 的表達(dá)逐漸喪失，大多數(shù)結(jié)直腸癌細(xì)胞系對(duì) ABT-199 不敏感[17]?？紤]到在大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的高水平BCL-XL，它已經(jīng)成為結(jié)直腸癌治療的主要目標(biāo)[20]。對(duì) BCL-2抑制劑不起反應(yīng)的結(jié)直腸癌干細(xì)胞對(duì) BCL-XL 特異性抑制劑 WEHI-539 非常敏感，聯(lián)合應(yīng)用該藥物提高了化療的療效[21]。泛靶點(diǎn)抑制劑 ABT-737 在耐藥干細(xì)胞中也能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，同時(shí)結(jié)合多種化療方案對(duì)結(jié)直腸癌體外組織和細(xì)胞系也顯示出療效[20]。一些研究表明，ABT-737 以及 ABT-263在實(shí)體腫瘤中發(fā)揮療效主要是通過抑制 BCL-XL[22]。BCL-XL 的抑制效果與 MCL-1 的活性密切相關(guān)，同時(shí)使用MCL-1 抑制劑可能增強(qiáng) BCL-XL 抑制的作用[23]。綜上所述，這些臨床前數(shù)據(jù)表明聯(lián)合應(yīng)用 BH3 模擬物針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療在結(jié)直腸癌治療中有很大的前景，表達(dá)BCL-2 的早期高危腺瘤可以通過 ABT-199 抑制 BCL-2，從而防止腫瘤進(jìn)展。另一方面，使用 BCL-XL 特異性抑制劑聯(lián)合 MCL-1 抑制治療晚期癌癥可能更有效。臨床實(shí)踐中使用 BCL-XL 抑制劑的主要問題是使用后引發(fā)的血小板減少，因?yàn)?BCL-XL 具有調(diào)節(jié)血小板的作用[24]，這個(gè)問題可以通過與其他化療藥物協(xié)同聯(lián)合來解決，這在一定程度上還可以降低藥物的使用劑量[25]。這些臨床前研究推動(dòng)了 BH3模擬物在結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用進(jìn)程。

2.2 BH3 模擬物與聯(lián)合用藥

在靶向治療過程中，癌細(xì)胞有可能改變對(duì)靶點(diǎn)通路的依賴性。如果不同時(shí)抑制替代途徑，就會(huì)迅速產(chǎn)生耐藥性。例如在慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，雖然最初癌細(xì)胞對(duì) navitoclax 敏感，但后期 BCL-XL 和 A1 的上調(diào)和過度表達(dá)使 CLL 細(xì)胞對(duì) navitoclax 的耐藥性提高了 1000 倍[26]。在臨床前模型中，同時(shí)抑制 MCL-1 和 BCL-2 已被反復(fù)證明可以增強(qiáng)誘導(dǎo)凋亡的效果，這表明同時(shí)抑制這兩個(gè)靶點(diǎn)可以起到協(xié)同作用[27]。無論是同時(shí)使用多種 BCL-2 家族抑制劑還是BCL-2 家族抑制劑與標(biāo)準(zhǔn)抗癌藥物相結(jié)合的聯(lián)合療法，在許多情況下都顯示出確實(shí)明顯的療效。但我們尚沒有明確能夠?qū)⒍拘越抵磷畹偷耐瑫r(shí)使聯(lián)合藥物協(xié)同作用達(dá)到最高的劑量標(biāo)準(zhǔn)和藥物組合。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，BCL-2 家族蛋白似乎扮演了更多的角色，BCL-XL 已被證明是血小板存活的關(guān)鍵因子[28]，另一方面，BCL-2 是粒細(xì)胞生成以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的重要因素[22]，用藥所帶來的毒副作用難以忽視。目前已經(jīng)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到 BH3 抑制劑對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的毒性作用以及血小板的抑制作用[29]。MCL-1 和BCL-XL 在小鼠模型中聯(lián)合應(yīng)用引起的急性肝損傷是致命的，但是謹(jǐn)慎的用藥劑量和給藥時(shí)機(jī)仍有可能建立一個(gè)治療窗口[30]。聯(lián)合用藥存在大量潛在的排列組合，特別是在同時(shí)或順序使用超過 2 種藥物的情況下，如何安全獲得更多的效益，我們知之甚少。多藥聯(lián)用在實(shí)現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的同時(shí)會(huì)帶來一系列的毒副作用，需要利用 I 期聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)謹(jǐn)慎評(píng)估。

2.3 BH3 模擬物及 BH3 圖譜

BH3 圖譜是一種用來評(píng)估細(xì)胞發(fā)生凋亡的傾向以及細(xì)胞對(duì)不同抗凋亡蛋白（BCL-2 家族，如 BCL-2、BCL-XL、BCL-W）相對(duì)依賴性的功能分析方法[31]。BH3 圖譜在分析各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中 BCL-2 蛋白的相互作用已有相關(guān)研究，并為 venetoclax 等在血液疾病的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[31]。雖然我們已經(jīng)開始了解不同 BCL-2 家族成員在一系列惡性腫瘤細(xì)胞系中的不同表達(dá)模式，但仍然很難預(yù)測(cè)哪些患者和哪些結(jié)直腸癌類型可能對(duì)特定的藥物或藥物組合產(chǎn)生反應(yīng)，如何識(shí)別腫瘤持續(xù)增殖所必需的促生存蛋白，以及面對(duì)諸多潛在的治療方式，醫(yī)生如何才能在它們之間做出最佳選擇，以滿足特定患者或某類患者的需要。BH3 圖譜結(jié)合各種 BCL-2 家族抑制劑，提供了一個(gè)解決此類問題的可能性[32]。BH3 圖譜雖然尚未廣泛應(yīng)用于臨床，但是在預(yù)測(cè)對(duì) BH3 類似物的耐藥性或應(yīng)答方面有一定的實(shí)用價(jià)值[22]。目前，對(duì)治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)還比較困難，但如果 BH3 圖譜成為治療的標(biāo)準(zhǔn)，便可以基于患者的個(gè)體 BH3 圖譜，選擇合適的 BCL-2 家族抑制劑及其組合，并計(jì)算出可誘導(dǎo)的最大效應(yīng)和最小毒性[33]。由于有一些 BCL-2 家族成員可以在翻譯后被調(diào)控，我們所面對(duì)的挑戰(zhàn)不僅需要預(yù)測(cè)細(xì)胞中不同 BCL-2 家族成員的種類及含量，還需要測(cè)量不同 BCL-2家族成員的分子狀態(tài)（活性），以預(yù)測(cè)對(duì) BH3 模擬藥物的敏感性。所謂的“動(dòng)態(tài) BH3 圖譜”正是為了測(cè)量藥物誘導(dǎo)的早期促凋亡信號(hào)的變化，明確腫瘤細(xì)胞中抗凋亡 BCL-2家族成員的依賴性而提出的策略之一[32]。

3 總結(jié)及展望

目前 BH3 模擬物在結(jié)直腸癌治療的臨床前研究上顯示出極大的可能性，但仍存在許多問題和挑戰(zhàn)。目前臨床上應(yīng)用的 BH3 模擬物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待解開。將兩種甚至更多的 BH3 模擬物聯(lián)合起來，同時(shí)或按順序依次抑制幾種有利于生存的 BCL-2 蛋白，可能是一種很有吸引力的結(jié)直腸癌治療方法。但是，僅僅基于蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)往往很難預(yù)測(cè)特定抑制劑組合的有效性，而且為了保證治療的有效性，需要預(yù)測(cè)聯(lián)合治療在體內(nèi)各種組織中的效果。當(dāng)務(wù)之急是合理設(shè)計(jì)藥物組合和發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物，以識(shí)別最有可能在 BH3 模擬物的治療中受益的患者。當(dāng)然，隨著當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的成熟和更多數(shù)據(jù)的獲得，我們完全有理由對(duì)這一充滿希望的結(jié)直腸癌治療方法的未來持樂觀態(tài)度。