不同生長(zhǎng)階段呼倫貝爾羊3種脂肪組織中膻味脂肪酸含量的變化規(guī)律研究

歐慧敏 張小麗 鐘榮珍 李建中 譚支良 許麗衛(wèi) 焦金真*

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物腸道功能湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410081；3.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林省草地畜牧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130102)

我國(guó)是養(yǎng)羊大國(guó)，2020年我國(guó)羊存欄量為30 654.8萬頭，穩(wěn)居世界首位，但是羊肉消費(fèi)量?jī)H為492萬t，占全部肉類消費(fèi)的6%，遠(yuǎn)低于15%的世界平均水平。羊肉風(fēng)味是決定人們對(duì)羊肉接受度的重要因素，部分消費(fèi)者因其獨(dú)特的膻味而拒絕接受羊肉，因此降低羊肉膻味物質(zhì)含量有望改善人們對(duì)羊肉的接受度，進(jìn)而促進(jìn)羊肉的消費(fèi)和養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[1]。羊肉膻味主要來源于不同類型脂肪組織的脂肪酸，其中3種4-烷基支鏈脂肪酸，即4-甲基辛酸(4-methyloctanoic acid，MOA)、4-乙基辛酸(4-ethyloctanoic acid，EOA)和4-甲基壬酸(4-methylnonanoic acid，MNA)是導(dǎo)致羊肉產(chǎn)生膻味的主要脂肪酸[2-3]。目前研究表明，這些膻味脂肪酸組成成分復(fù)雜，雖然含量極少，但功能強(qiáng)大，其含量的變化將直接影響羊肉膻味的強(qiáng)弱。

眾所周知，呼倫貝爾羊生存在空間系無污染的內(nèi)蒙古大草原，自然放牧模式使羊肉具有口感細(xì)嫩、多汁味美、膻味低的特點(diǎn)。但是舍飼或半舍飼快速育肥作為現(xiàn)如今養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的主流模式，其雖能提高養(yǎng)殖效率，卻使呼倫貝爾羊的膻味程度明顯增加[4]，從而在一定程度上影響了人們對(duì)呼倫貝爾羊肉的消費(fèi)需求。張志超等[5]的研究已證實(shí)，3歲呼倫貝爾大尾羊的膻味脂肪酸MOA和EOA的含量均顯著高于8月齡羊，且MNA含量只能在3歲羯羊中被檢測(cè)到。隨著動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)，膻味脂肪酸在脂肪組織中逐漸沉積，但在呼倫貝爾羊中是否也存在這一相同的變化規(guī)律目前并不清楚，也少有系統(tǒng)的研究。因此，探索不同生長(zhǎng)階段呼倫貝爾羊的膻味脂肪酸含量的變化規(guī)律，對(duì)改善羊肉膻味尤為重要。本研究以酸堿法甲酯化處理為前提，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)不同生長(zhǎng)階段(新生期、斷奶期、育肥中期和后期)呼倫貝爾羊3種脂肪組織(背部皮下脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪)中的3種膻味脂肪酸(MOA、EOA和MNA)含量進(jìn)行了測(cè)定和比較分析，旨在明確呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段脂肪組織中膻味脂肪酸含量的變化規(guī)律，為后續(xù)改善羊肉風(fēng)味提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)中動(dòng)物試驗(yàn)的所有程序遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》要求，由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)動(dòng)物的使用。在呼倫貝爾市鄂溫克旗中國(guó)科學(xué)院草牧業(yè)工程試驗(yàn)站進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)選擇32只體況較好、初生重[(3.63±0.46) kg]相近的新生呼倫貝爾羊，隨機(jī)選取其中8只新生期羔羊(出生1～2 d內(nèi))屠宰后采集脂肪組織樣品，剩余24只羔羊隨母羊生活。羔羊從6周齡開始補(bǔ)飼固體開食料，分別于08:00和16:00將羔羊單獨(dú)關(guān)進(jìn)補(bǔ)飼欄飼喂開食料，其余時(shí)間隨母羊自由吮乳，直至2月齡斷奶。斷奶羔羊單籠飼養(yǎng)并飼喂固體開食料至3月齡，之后供給育肥料至6月齡。開食料及育肥料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)間共180 d，在斷奶期(2.5月齡)、育肥中期(5月齡)和后期(6月齡)各隨機(jī)屠宰8只。

1.2 樣品采集

宰前禁食24 h，禁水2 h，采用頸動(dòng)脈放血的方式屠宰，屠宰后胴體沿脊柱劈開為左右兩半，取背部皮下脂肪(第12～13肋骨處背部肌肉上方的脂肪組織)、腎周脂肪和腸系膜脂肪組織各80 g左右，裝入保鮮袋中于-20 ℃冰箱冷凍保存。

表1 開食料及育肥料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 主要試劑與儀器

MOA、EOA、MNA標(biāo)準(zhǔn)液(純度≥98.0%，Sigma公司，美國(guó))；甲醇、正己烷(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚、氫氧化鈉、濃硫酸(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

冷凍干燥機(jī)(Scientz-18N，寧波新芝生物科技有限公司，中國(guó))；配備有EI電離源、四級(jí)桿質(zhì)量分析儀和自動(dòng)進(jìn)樣器的7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS，Agilent，美國(guó))；索氏提取儀(Gerhardt，德國(guó))；0.22 μm濾膜(希波氏，中國(guó))。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 脂肪的提取

取5 g左右冷凍干燥后的樣品，用濾紙包好后放入索氏提取器中，以石油醚為溶劑，在60 ℃恒溫條件下連續(xù)抽提2 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去提取物中的有機(jī)溶劑，得到透明濃稠狀的粗脂肪油。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取MOA、EOA和MNA各100 mg，混合并用正己烷定容至50 mL，即為脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成的脂肪酸濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3 酸堿衍生法

準(zhǔn)確吸取8 μg/mL脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于150 mL錐形瓶中，加入5 mL 2%氫氧化鈉-甲醇溶液搖勻，安裝冷凝回流裝置，置于75 ℃恒溫水浴箱中回流20 min。再?gòu)睦淠苌隙思尤?0 mL 0.5 moL/L硫酸-甲醇溶液，75 ℃水浴回流15 min，最后加入10 mL正己烷回流2 min。取出后冷卻至室溫，加入10 mL超純水，在渦旋振蕩儀上振搖5 min，靜置分層后取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.4.4 GC-MS分析

檢測(cè)條件為：SP-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm, Supelco，美國(guó))；程序升溫條件：140 ℃，保持5 min，然后以2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；再以30 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口：250 ℃；離子源：230 ℃；四級(jí)桿：150 ℃；質(zhì)譜接口：220 ℃。流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1，選擇離子掃描模式，定量離子選擇m/z：MOA、EOA和MNA均為87，輔助定量離子均為74、57。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)品分別上機(jī)測(cè)定，以各目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程；以目標(biāo)物3倍信噪比的濃度為其檢出限，10倍信噪比的濃度為其定量限。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA過程進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(k個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn))，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)性能

呼倫貝爾羊的體重、體高和體長(zhǎng)的增長(zhǎng)主要發(fā)生在新生期～斷奶期這一階段(表2)，增長(zhǎng)幅度分別達(dá)480%、240%和337%。從斷奶期～育肥期，呼倫貝爾羊體重繼續(xù)隨日齡的增加而顯著增加(P<0.05)，而體高和體長(zhǎng)的增長(zhǎng)幅度則低于14%，僅在育肥中期～育肥后期呼倫貝爾羊的體長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)。

表2 呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)性能

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

MOA、EOA、MNA含量線性范圍分別在0.35～16.00 μg/mL、0.20～16.00 μg/mL和0.20～16.00 μg/mL，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.998以上，檢測(cè)限(RS/N=3)分別為0.10、0.05和0.05 μg/mL(表3)。

2.3 呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段3種脂肪組織中膻味脂肪酸的含量

2.3.1 背部皮下脂肪組織

不同生長(zhǎng)階段呼倫貝爾羊背部皮下脂肪組織中3種膻味脂肪酸MOA、EOA和MNA的含量存在顯著差異(P<0.05，表4)，均表現(xiàn)為育肥后期>育肥中期>斷奶期>新生期。其中，MOA和MNA的含量在育肥中期～育肥后期的增長(zhǎng)速率最快，而EOA的含量在斷奶期～育肥中期的增長(zhǎng)速率最快。從數(shù)值上來看，除育肥中期外，其他3個(gè)生長(zhǎng)階段中3種膻味脂肪酸均以MOA的含量最高。

表3 MOA, EOA and MNA的線性方程及檢出限

表4 呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段背部皮下脂肪組織中膻味脂肪酸的含量

2.3.2 腎周脂肪組織

由表5可知，不同生長(zhǎng)階段的呼倫貝爾羊腎周脂肪組織中的膻味脂肪酸(MOA、EOA和MNA)的含量均存在顯著差異(P<0.05)，且變化趨勢(shì)與背部皮下脂肪組織一致，均表現(xiàn)為育肥后期最高，新生期最低。在斷奶期～育肥中期，腎周脂肪組織中的MOA和EOA的增長(zhǎng)速率最快，育肥中期MOA、EOA的含量分別約是斷奶期的3和4倍多；而MNA的含量則在育肥中期后快速增長(zhǎng)，至育肥后期MNA的含量約增加3倍。與EOA和MNA含量相比，MOA的含量在4個(gè)不同生長(zhǎng)階段中均為最高，新生期其含量至少是MNA的2倍以上，而從斷奶期開始其含量至少為MNA的4倍以上。

表5 呼倫貝爾羊不同生長(zhǎng)階段腎周脂肪組織中膻味脂肪酸的含量

2.3.3 腸系膜脂肪組織

由表6可知，新生期羔羊的腸系膜脂肪組織中MOA、EOA和MNA的含量極低，均未達(dá)到檢測(cè)限；斷奶期羔羊的腸系膜脂肪組織中的MNA也不能被檢測(cè)到。育肥中期和育肥后期羊的腸系膜脂肪組織中MOA和EOA的含量均顯著高于斷奶期(P<0.05)，其含量均為斷奶期的5倍以上。育肥中期和育肥后期的MNA的含量差異不顯著(P>0.05)。在腸系膜脂肪組織中，MOA和EOA的含量在同一生長(zhǎng)階段均相差不大，而MNA含量?jī)H為MOA或EOA含量的1/20。

表6 不同生長(zhǎng)階段呼倫貝爾羊腸系膜脂肪組織中膻味脂肪酸的含量

從脂肪組織部位差異性來看，4個(gè)不同生長(zhǎng)階段呼倫貝爾羊的3種膻味脂肪酸的含量均以背部皮下脂肪組織為最高。以育肥后期為例，背部皮下脂肪中的MOA、EOA、MNA的含量分別是腎周脂肪組織中的7.8、3.8和9.1倍。

3 討 論

目前為止有關(guān)測(cè)定羊肉膻味脂肪酸含量方法的報(bào)道較少，以氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法最為常見。多項(xiàng)研究表明，膻味脂肪酸因具有極強(qiáng)的揮發(fā)性，導(dǎo)致常規(guī)檢測(cè)方法無法準(zhǔn)確定量分析[6]，通常情況下需將膻味脂肪酸通過甲酯化衍生成脂肪酸甲酯進(jìn)行檢測(cè)。李秋桐等[7]比較了不同脂肪酸甲酯化的方法，發(fā)現(xiàn)酸堿法和三氟化硼-甲醇法反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高，所測(cè)得的色譜圖峰形和分離度較好，整體效果優(yōu)于1%硫酸-甲醇法，更能準(zhǔn)確地測(cè)定羊肉中膻味脂肪酸的含量。最新研究也表明，酸堿法甲酯化效率總體上高于三氟化硼-甲醇法[8]，可作為定量檢測(cè)膻味脂肪酸的首選方法[9]。因此，本試驗(yàn)結(jié)合酸堿法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，首先將不同部位的脂肪組織抽提出的脂肪經(jīng)酸堿法衍生成脂肪酸甲酯，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定膻味脂肪酸的含量。結(jié)果表明，MOA、EOA、MNA的定量檢測(cè)限分別為0.10、0.05和0.05 μg/mL，R2>0.998。Kaffarnik等[10]采用1%硫酸-甲醇法測(cè)定綿羊皮下脂肪組織膻味脂肪酸，MOA、EOA和MNA的定量檢測(cè)限為3.6～4.8 μg/g，最低檢出限為1.1～1.4 μg/g。這一結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于我們的定量檢測(cè)線，表明我們目前的研究方法靈敏度更高，可操作性更強(qiáng)，適用于呼倫貝爾羊脂肪中膻味脂肪酸含量變化規(guī)律的研究。

不同品種羊脂肪組織中膻味脂肪酸含量不同，也是影響羊肉膻味強(qiáng)弱的主要因素之一。一般綿羊中的膻味脂肪酸的含量低于山羊[7,11]，其中呼倫貝爾羊是典型的低膻味綿羊品種。本研究結(jié)果表明，呼倫貝爾羊脂肪組織的膻味脂肪酸中MOA的含量最為豐富，EOA和MNA的含量相對(duì)較低，這與前期研究結(jié)果[9,12-13]相一致，說明MOA和EOA是引起羊肉具有膻味的主要脂肪酸。另有研究報(bào)道，隨著日齡的增加，羊肉中的膻味脂肪酸沉積量不斷增長(zhǎng)，表明年齡因素對(duì)羊肉膻味的形成和沉積具有重要影響[14-15]。Salvatore等[16]研究結(jié)果表明，羔羊中MOA和EOA的含量低于周歲羊和成年羊，但羔羊的MNA含量高于周歲羊和成年羊。青海黑藏羊背最長(zhǎng)肌中MOA的含量隨著年齡的增加而不斷增加，而EOA的含量則表現(xiàn)出先增長(zhǎng)后降低的變化趨勢(shì)[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生期的呼倫貝爾羔羊MOA、EOA和MNA含量，以及斷奶期羔羊的MNA含量均未達(dá)到檢測(cè)線，有可能是因?yàn)楹魝愗悹栄虮旧砗铣呻吨舅岬哪芰秃苋?，而在新生期和斷奶期羔羊合成膻味脂肪酸的能力甚至更弱。此外，本試?yàn)結(jié)果表明，3種膻味脂肪酸含量均隨日齡增長(zhǎng)而不斷增加，且大多數(shù)膻味脂肪酸含量均在斷奶期～育肥中期的增長(zhǎng)速率最快，這一結(jié)果為后續(xù)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供了關(guān)鍵理論支持。除了品種與年齡因素外，飼糧類型、添加劑、飼養(yǎng)方式等多種因素均可引起羊脂肪中的膻味脂肪酸含量的變化[18]。放牧羊皮下脂肪中膻味脂肪酸含量低于舍飼苜蓿組和玉米組，且玉米組的膻味脂肪酸含量高于苜蓿組[19]，其可能原因是高淀粉谷物經(jīng)過瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸可以作為合成支鏈脂肪酸的重要前體物質(zhì)。本試驗(yàn)中新生期羔羊營(yíng)養(yǎng)主要來源于母乳，斷奶期羔羊營(yíng)養(yǎng)來源于開食料(高蛋白質(zhì))，育肥中期和后期來源于育肥飼糧(高碳水化合物)。此營(yíng)養(yǎng)來源的轉(zhuǎn)變引起呼倫貝爾羊體內(nèi)激素和代謝水平的差異，從而引起脂肪組織中膻味脂肪酸的含量和組成發(fā)生變化，進(jìn)而產(chǎn)生不同程度的膻味[18,20]。

羊不同部位脂肪組織中的脂肪酸組成具有顯著差異。李維紅等[21]對(duì)靖遠(yuǎn)灘羊體脂脂肪酸的研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸的含量按照腎臟脂肪>背膘脂肪>尾部脂肪的順序依次減少，膻味逐漸減輕。Brennand等[22]對(duì)羔羊不同部位組織中支鏈脂肪酸進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其在皮下脂肪組織中含量較高，而在腎周脂肪和肌內(nèi)脂肪中的含量相對(duì)較低。本研究結(jié)果表明，呼倫貝爾羊不同部位脂肪組織中3種膻味脂肪酸的含量按背部皮下脂肪>腸系膜脂肪>腎周脂肪的規(guī)律降低，這一結(jié)果與前人多項(xiàng)研究結(jié)果[23-24]相符。肉羊膻味脂肪酸在皮下脂肪組織中的沉積量普遍高于內(nèi)臟脂肪組織，這種差異可能是由于脂肪酸合成路徑(短鏈脂肪酸的從頭合成和外源脂肪酸的直接攝取)在不同脂肪組織間有所不同所導(dǎo)致的[12]?？傊巢科は轮窘M織中膻味脂肪酸含量較高，易于定量檢測(cè)，可以作為后續(xù)有關(guān)呼倫貝爾羊膻味脂肪酸相關(guān)研究的首選部位。

4 結(jié) 論

呼倫貝爾羊3種脂肪組織中的膻味脂肪酸的含量隨日齡增長(zhǎng)而不斷增加，且在斷奶期至育肥中期的增長(zhǎng)速率最快；背部皮下脂肪組織的膻味脂肪酸在整個(gè)生長(zhǎng)期含量最高。