短鏈脂肪酸對(duì)腸上皮緊密連接的作用機(jī)制研究進(jìn)展

董 霞 朱 研 沈林園 趙 葉*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637009)

腸道屏障是抵抗腸道中病原微生物和有毒有害物質(zhì)入侵的第1道防線，對(duì)于維持機(jī)體正常功能至關(guān)重要[1]。正常腸道屏障由微生物屏障、化學(xué)屏障、機(jī)械屏障和免疫屏障共同構(gòu)成。其中機(jī)械屏障是維持腸道黏膜屏障正常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是完整的彼此緊密相連的腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)，主要包括黏膜上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞間的各種連接復(fù)合體[2]。緊密連接(tight junction，TJ)是腸道黏膜上皮細(xì)胞間最重要的連接復(fù)合體，構(gòu)成了相鄰細(xì)胞間頂端復(fù)合連接，是腸道中維持黏膜上皮細(xì)胞間機(jī)械屏障的主要結(jié)構(gòu)之一。TJ包括上皮細(xì)胞側(cè)膜的閉合蛋白(claudins)[3]、咬合蛋白(occludins)[4]以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面的閉合小環(huán)蛋白(ZOs)[5]。TJ蛋白表達(dá)和分布的改變會(huì)影響TJ的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響腸黏膜機(jī)械屏障的正常生理作用。其中，claudins主要調(diào)控細(xì)胞旁電荷的選擇性來調(diào)節(jié)腸道屏障滲透性，occludins通過自身磷酸化調(diào)節(jié)TJ復(fù)合體的定位及功能，ZOs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和維持上皮細(xì)胞極性，三者共同維持腸黏膜上皮機(jī)械屏障穩(wěn)態(tài)[6-7]。近年來，大量研究表明，腸道微生物群代謝物可通過調(diào)節(jié)TJ相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布，調(diào)節(jié)腸黏膜機(jī)械屏障功能[8-9]。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)是由腸道菌群通過糖酵解和磷酸戊糖途徑降解不宜消化的膳食纖維所產(chǎn)生的代謝物。SCFAs是鏈長(zhǎng)為1～6個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，其中乙酸鹽是腸道中含量最豐富的SCFAs[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs可增強(qiáng)動(dòng)物腸上皮TJ蛋白表達(dá)，減輕由病原微生物引起的腸上皮TJ損傷，修復(fù)腸黏膜機(jī)械屏障功能[12-14]。本文就SCFAs對(duì)動(dòng)物腸上皮細(xì)胞TJ的影響及其機(jī)制研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 SCFAs相關(guān)作用受體

SCFAs可作為一些G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)的配體，通過激活GPCRs發(fā)揮生物學(xué)功能[15]。SCFAs激活的受體主要包括GPR41、GPR43和GPR109A，廣泛存在于脂肪[16-17]、骨髓[18]、肝臟[19]、肌肉[20]、肺臟[21]、腦[22-23]、心臟和外周交感神經(jīng)元[21,24]中，在腸道中尤為豐富。Wu等[25]在GPR43敲除與野生型的C57BL/6小鼠上發(fā)現(xiàn)，喂食野生型而不是GPR43敲除小鼠醋酸鹽，促進(jìn)了獨(dú)立于T細(xì)胞的腸道免疫球蛋白A(IgA)反應(yīng)，維持腸道屏障功能。Tazoe等[26]研究發(fā)現(xiàn)，GPR41在人結(jié)腸黏膜高表達(dá)，可以被乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽不同程度激活，是SCFAs的有效受體之一。Borthakur等[27]在人腸道C2BBe1細(xì)胞和大鼠腸道IEC-6細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽通過激活GPR109A調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝。由此可見，GPCRs在動(dòng)物各組織器官?gòu)V泛表達(dá)，SCFAs通過與腸道的不同GPCRs受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。

2 SCFAs對(duì)腸上皮TJ的影響

腸上皮TJ處于動(dòng)態(tài)過程，它的開閉受到外界飲食、神經(jīng)體液信號(hào)及細(xì)菌和病毒等的影響，是決定腸道通透性的關(guān)鍵，而腸道通透性是反映腸道屏障完整性的重要指標(biāo)[28-29]。研究表明，SCFAs通過調(diào)節(jié)TJ相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)腸上皮TJ，降低腸道通透性，保證腸道機(jī)械屏障完整性(表1)。在人Caco-2細(xì)胞上研究發(fā)現(xiàn)，用0.5 mmol/L乙酸鹽、0.01 mmol/L丙酸鹽和0.01 mmol/L丁酸鹽與脂多糖共同處理Caco-2細(xì)胞24 h，可顯著增加ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)，減輕脂多糖誘導(dǎo)的TJ損傷，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞間通透性增大，維持腸上皮細(xì)胞正常生理功能[30]。Elamin等[31]研究發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L丁酸鹽、4 mmol/L丙酸鹽和8 mmol/L乙酸鹽預(yù)處理人Coca-2細(xì)胞1 h，顯著增加ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)，緩解乙醇誘導(dǎo)的TJ損傷及腸道機(jī)械屏障功能障礙。在人未成熟的腸上皮細(xì)胞系H4細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L的丁酸鹽預(yù)處理30 min上調(diào)了occludin、claudin-4、claudin-11和claudin-15等TJ相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，降低由白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的該細(xì)胞TJ損傷[32]。對(duì)C57BL/6J小鼠研究發(fā)現(xiàn)，1%(質(zhì)量體積比)丙酸鹽飲水預(yù)處理1周顯著抑制ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)，有效預(yù)防葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞旁通透性增大，防止結(jié)腸上皮TJ損傷[33]。Guo等[34]通過管飼法給予高尿酸血癥模型C57BL/6J小鼠9.5 g/(kg·d)菊粉7周后發(fā)現(xiàn)，菊粉在腸道微生物群衍生下產(chǎn)生的SCFAs可上調(diào)ZO-1和occludin的mRNA和蛋白表達(dá)，提高腸上皮細(xì)胞間TJ，恢復(fù)腸道機(jī)械屏障功能。在早期斷奶仔豬上研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2 000 mg/kg丁酸鈉顯著上調(diào)ZO-1、occludin和claudin-3的mRNA表達(dá)和occludin、claudin-3的蛋白表達(dá)，降低腸道通透性，減輕腹瀉，提高仔豬生長(zhǎng)性能[12]。綜上所述，適宜濃度SCFAs可以有效緩解外界抗原刺激引起的腸上皮TJ損傷，降低腸道通透性，保護(hù)腸道機(jī)械屏障完整性。

表1 SCFAs對(duì)腸黏膜機(jī)械屏障的影響

續(xù)表1活性成分Active compounds誘導(dǎo)劑Inducer模型Model試驗(yàn)劑量Experimental dosage預(yù)防/治療時(shí)間Prevention/treatment time通透性Permeability關(guān)鍵蛋白Key proteins參考文獻(xiàn)Reference乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽Acetate, propionate and butyrateC57BL/6J小鼠9.5 g/(kg·d)49 d↓ZO-1、occludinGuo等[34]丁酸鈉 Sodium butyrate斷奶仔豬2 000 mg/kg21 d↓ZO-1、occludin、claudin-3Feng等[12]

3 SCFAs對(duì)腸上皮TJ的作用機(jī)制

3.1 SCFAs激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)相關(guān)通路增強(qiáng)腸上皮TJ

AMPK是生物能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其激活可促進(jìn)TJ蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)腸上皮TJ，改善腸道機(jī)械屏障功能[31,35]。SCFAs作為腸上皮細(xì)胞主要的供能物質(zhì)，可通過激活A(yù)MPK參與細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)。通常細(xì)胞內(nèi)能量傳感器AMPK是無(wú)活性的，增加單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ATP比例或增加鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase β，CaMKKβ)的活性使AMPK蘇氨酸172(Thr172)上的α亞基磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)MPK[36-37]。Yan等[38]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L丁酸鹽增加IPEC-J2上皮細(xì)胞AMP/ATP比例，AMPK磷酸化，提高claudin-3和claudin-4的mRNA和蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)腸上皮TJ。對(duì)斷奶仔豬飼糧補(bǔ)充膳食纖維(海藻酸寡糖)發(fā)現(xiàn)，盲腸和結(jié)腸發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs使AMPK磷酸化被激活，顯著增加occludin和claudin-1的mRNA表達(dá)，增強(qiáng)腸上皮TJ作用，提高腸道機(jī)械屏障完整性[39]。由此可見，SCFAs作為腸上皮供能物質(zhì)，保證宿主上皮細(xì)胞能量代謝，通過調(diào)節(jié)AMP/ATP比例激活A(yù)MPK，增加腸上皮細(xì)胞中TJ蛋白的表達(dá)量，保證腸道機(jī)械屏障完整性。

另外，細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度升高可激活CaMKKβ，調(diào)節(jié)AMPK活性[36]。研究表明，SCFAs(主要是丁酸鹽)通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度激活CaMKKβ調(diào)節(jié)AMPK活性。在人Caco-2細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽通過調(diào)節(jié)鈣池操縱性鈣通道(store-operated calcium channel，SOCC)誘導(dǎo)胞外Ca2+流入胞內(nèi)，激活Ca2+/CaMKKβ通路介導(dǎo)的AMPK，使肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的絲氨酸815(Ser815)磷酸化，誘導(dǎo)MLCK失活，進(jìn)而導(dǎo)致肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈(myosin Ⅱ regulatory light chain，MLC2)在絲氨酸19(Ser19)磷酸化水平降低，促進(jìn)TJ蛋白與蛋白相互作用，調(diào)節(jié)腸上皮通透性，對(duì)維持TJ的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要；此外，激活的AMPK增加蛋白激酶Cβ2(protein kinase Cβ2，PKCβ2)在絲氨酸660(Ser660)的磷酸化水平，進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)TJ重組的作用[40-42]。綜上所述，適宜水平的SCFAs作為腸上皮細(xì)胞的供能物質(zhì)，可通過改變細(xì)胞內(nèi)AMP和ATP的水平或通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在不同程度上激活A(yù)MPK的表達(dá)，加強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞TJ，保證腸機(jī)械屏障完整性(圖1)。

3.2 SCFAs抑制炎癥小體(inflammasome)活性增強(qiáng)腸上皮TJ

炎癥小體又稱炎性小體或炎性體，是能夠識(shí)別病原體和外界刺激的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多聚體蛋白復(fù)合物，可響應(yīng)細(xì)胞擾動(dòng)而組裝。該組裝會(huì)導(dǎo)致半胱天冬蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)激活，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-1β和白細(xì)胞介素-18(IL-18)前體的成熟和釋放，炎癥細(xì)胞因子的過渡激活和釋放最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生并損傷腸上皮TJ破壞腸道屏障功能[43-44]。小鼠模型表明，外界刺激核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎癥小體活化產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)是誘導(dǎo)炎癥發(fā)生造成腸上皮TJ損傷的重要原因[45-46]。因此，有效防止炎癥小體的異常激活是保證腸上皮TJ完整性的關(guān)鍵。SCFAs作為腸道微生物代謝的主要產(chǎn)物，在抑制炎癥小體活化維持腸上皮TJ中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，腹腔注射300 mg/kg丁酸鈉溶液可有效抑制重度燙傷C57BL/6小鼠腸黏膜NLRP3炎癥小體的激活，減少IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，上調(diào)TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2的表達(dá)，改善TJ蛋白ZO-1的分布異常，保護(hù)腸道機(jī)械屏障功能[47]。Tye等[48]發(fā)現(xiàn)，炎癥小體NLRP1大量激活會(huì)增加IL-18的產(chǎn)生，可通過限制腸道中有益的產(chǎn)丁酸鹽梭菌來加重葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠結(jié)腸炎，而在補(bǔ)充2%(質(zhì)量體積比)丁酸鹽后可以緩解小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生。因此，適宜濃度的SCFAs可通過抑制炎癥小體的活性減輕腸道炎癥，提高腸道屏障功能。SCFAs可作為組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑，抑制炎癥小體過度激活防止炎癥產(chǎn)生，增強(qiáng)腸上皮TJ并維持腸道機(jī)械屏障完整性。研究表明，0.5 mmol/L醋酸鹽、0.01 mmol/L丙酸鹽和0.01 mmol/L丁酸鹽單獨(dú)或組合處理可抑制HDAC，顯著抑制人Caco-2細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體的過度激活，并顯著增加ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)水平，提高腸上皮TJ，保護(hù)腸道機(jī)械屏障完整性[30]。Beisner等[49]研究也發(fā)現(xiàn)，適宜濃度丁酸鹽作為HDAC的有效抑制劑可有效緩解C57BL/6小鼠結(jié)腸炎癥損傷，并顯著增加結(jié)腸中ZO-1、occludin、claudin-2和claudin-5的mRNA表達(dá)水平，增強(qiáng)腸上皮TJ，改善腸道機(jī)械屏障功能。綜上所述，適宜濃度的SCFAs可作為HDAC抑制劑，從而抑制炎癥小體活性，減少炎癥細(xì)胞因子的發(fā)生，提高腸上皮細(xì)胞間TJ，保護(hù)腸道機(jī)械屏障完整性(圖1)。

Dietary fibre：膳食纖維；Gut microbiota：腸道微生物；SCFAs：短鏈脂肪酸 short-chain fatty acids；Acetate：乙酸鹽；Propionate：丙酸鹽；Butyrate：丁酸鹽；GPR43：G蛋白偶聯(lián)受體43 G protein-coupled receptor 43；GPR41：G蛋白偶聯(lián)受體41 G protein-coupled receptor 41；GPR109A：G蛋白偶聯(lián)受體109A G protein-coupled receptor 109A；Ca2+：鈣離子 calcium ion；SOCC：鈣池操縱性鈣通道 store-operated calcium channel；CaMKKβ：鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶β calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase β；AMPK：?jiǎn)瘟姿嵯佘栈罨鞍准っ?adenosine monophosphate activated protein kinase；PKCβ2：蛋白激酶Cβ2 protein kinase Cβ2；MLCK：肌球蛋白輕鏈激酶 myosin light chain kinase；MLC2：肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈 myosin Ⅱ regulatory light chain; PAMPs：病原體相關(guān)分子模式 pathogen-associated molecular patterns；DAMPs：損傷相關(guān)的分子模式 damage-associated molecular patterns；HDAC：組蛋白去乙?；?histone deacetylase；NLR：NOD樣受體蛋白 NOD-like receptors；ALR：AIM2樣受體蛋白 AIM2-like receptor；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 apoptosis-associated speck-like protein containing CARD；procaspase-1：半胱天冬蛋白酶-1前體 cysteinyl aspartate specific proteinase-1 precursor；pro-IL-1β：白細(xì)胞介素-1β前體 interleukin-1β precursor；pro-IL-18：白細(xì)胞介素-18前體 interleukin-18 precursor；Tight junction：緊密連接。

4 小 結(jié)

綜上所述，SCFAs可增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞間TJ并保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障完整性，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制是分別作為供能物質(zhì)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度激活A(yù)MPK信號(hào)通路；作為HDAC抑制劑抑制炎癥小體活化等。在常規(guī)畜禽養(yǎng)殖中，SCFAs不僅維持腸上皮TJ，而且對(duì)腸道屏障功能也有一定的調(diào)節(jié)作用，但其發(fā)揮具體作用是否與腸道微生物存在必然聯(lián)系需要進(jìn)一步探討。此外，SCFAs對(duì)腸上皮TJ的影響在部分畜禽中研究較少，具體作用機(jī)制仍尚不明確。因此，還需要進(jìn)一步廣泛深入研究SCFAs在常規(guī)畜禽中的具體作用方式，以便為腸道疾病的預(yù)防和治療提供參考。