信息熵賦權結合響應面法優(yōu)化石菖蒲揮發(fā)油的高速剪切包合工藝

鄧桂海，胡懿，余欣彤，林嘉明，王瑜婷，曹嵌，王壽富

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

石菖蒲為天南星科石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott的干燥根莖，性溫，味辛、苦，歸心、胃經，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功效，臨床廣泛用于神昏癲癇、健忘失眠、耳鳴耳聾、脘痞不饑、噤口下痢等癥[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，石菖蒲的主要藥效成分為苯丙素類和萜類化合物等揮發(fā)性成分，以及生物堿類、醛和酸類、醌和酮類等非揮發(fā)性成分[3-4]。揮發(fā)油主要含有β-細辛醚、α-細辛醚等，在神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮廣泛且重要的藥理作用[5]。

由于大多數(shù)揮發(fā)油具有不穩(wěn)定、易揮發(fā)、刺激性強等特點，為了提高揮發(fā)油在制劑產品中的穩(wěn)定性，常采用β-環(huán)糊精包合技術對其進行處理。目前，高速剪切技術廣泛應用于有效成分的提取制備[6-7]，揮發(fā)油包合物的制備方法主要為飽和水溶液法、膠體磨法等[8-9]，高速剪切包合法卻鮮有報道。高速剪切技術通過轉子高速旋轉產生的高剪切線速度和高頻機械效應帶來的強勁動能，使物料從轉子下端吸入及從定子噴出，從而實現(xiàn)液力剪切、離心擠壓、液層摩擦、撞擊撕裂和湍流等協(xié)同作用。高速剪切包合與傳統(tǒng)包合方法相比，具有耗時短、節(jié)能、包合率高等特點[10]。

本研究以β-環(huán)糊精為包合材料，基于信息熵賦權原理結合響應面法對高速剪切法制備石菖蒲揮發(fā)油包合物的工藝進行優(yōu)化，建立石菖蒲揮發(fā)油包合工藝的數(shù)學模型和設計空間，以實現(xiàn)包合物質量符合包合物得率、有效成分包合率的要求，并通過傅里葉變換紅外光譜法對包合物質量進行驗證，以期為石菖蒲揮發(fā)油相關制劑的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JRJ300-S 型數(shù)顯高速剪切乳化機（上海平軒科學儀器有限公司）；Agilent 1290 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Spectrum 100 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkinelmer 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；B-290型噴霧干燥儀（瑞士Buchi公司）；JJ2000B 型百分之一天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

β-細辛醚對照品（批號：112018-201601，純度：99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；β-環(huán)糊精（批號：FH2106006）購自孟州市華興生物化工有限責任公司；甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；水為超純水，其他試劑為分析純。

石菖蒲揮發(fā)油（批號：TC2103046，β-細辛醚質量分數(shù)：32.32%）由廣東一方制藥有限公司制備。

2 方法與結果

2.1 包合物的制備

按比例精密稱取一定量的β-環(huán)糊精并加一定量的水在常溫下溶解，吸取適量的石菖蒲揮發(fā)油，按揮發(fā)油與無水乙醇質量比為3∶2的比例加無水乙醇稀釋，緩慢滴加到β-環(huán)糊精溶液中，常溫下以一定的剪切轉速剪切一定時間，噴霧干燥，收集噴干粉，混勻，即得[11]。

2.2 揮發(fā)油得率、包合率的測定

測定各試驗組包合物得率（Y1）、包合物中指標性成分β-細辛醚的包合率（Y2），計算公式分別如下：

Y1=包合物質量/（β-環(huán)糊精加入量+揮發(fā)油加入量）×100%，

Y2=包合物中β-細辛醚質量/（揮發(fā)油加入量×揮發(fā)油中β-細辛醚含量×包合物得率）×100%[12]。

2.3 各指標權重系數(shù)及綜合評分的計算

運用熵權法計算各評價指標的權重系數(shù)（Wi）并計算綜合評分（M），建立原始評價指標矩陣X=（Xij）mn，根據(jù)公式（1）進行處理得概率矩陣P=（Pij）mn。

根據(jù)公式（2）計算各指標的信息熵Hij，根據(jù)公式（3）計算其權重系數(shù)Wj。

若某個指標的信息熵越小，表明該指標的離散程度越大，所提供的信息量越大，其權重也相應越大，在綜合評分中所起的作用也越大[13]。根據(jù)包合物得率、β-細辛醚包合率的權重系數(shù)W1、W2，按公式（4）計算綜合評分（M）。

2.4 β-細辛醚質量分數(shù)測定方法

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為甲醇-水（體積比55∶45）；檢測波長為252 nm；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣量為1 μL[14]。

2.4.2 對照品溶液的制備 取β-細辛醚對照品適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度為650.971 μg/mL的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取包合物適量，約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 專屬性考察 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果表明β-細辛醚的專屬性較強，空白溶液無干擾。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of specificity test

2.4.5 線性關系考察 精密吸取“2.4.2”項下對照品溶液，用甲醇稀釋成6個不同濃度的對照品溶液，分別按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄相應峰面積，以各成分對照品質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程為Y=15.515 0X-88.316 4，r=0.999 8，表明β-細辛醚在23.159～650.971 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算得β-細辛醚峰面積的RSD 為0.69%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性試驗 取同一批包合物適量，按“2.4.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得β-細辛醚峰面積的RSD 為0.95%，表明方法重復性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批包合物適量，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，于制備后放置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得β-細辛醚峰面積的RSD 為0.41%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的包合物9 份，每份約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分為3組，分別按高、中、低濃度精密加入對照品溶液適量，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算得β-細辛醚的平均加樣回收率為99.53%，RSD 為0.77%，表明方法準確性較好。

2.5 單因素試驗

2.5.1 剪切轉速對綜合評分的影響 固定剪切時間為8 min，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為8∶1，β-環(huán)糊精與水的質量比為1∶4，剪切轉速分別設置為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 r/min。以各綜合評分（Y）對剪切轉速（X）繪圖，見圖2?？梢?，隨著剪切轉速的不斷增大，綜合評分呈先增大后平穩(wěn)的趨勢?？紤]到剪切轉速過高，一方面會對剪切機的機械磨損較大，另一方面會使部分包合液濺出，造成一定的物料損失，故剪切轉速不宜設定過高。

圖2 剪切轉速對綜合評分的影響Figure 2 Effect of shear speed on the comprehensive score

2.5.2 剪切時間對綜合評分的影響 固定剪切轉速為3 000 r/min，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為8∶1，β-環(huán)糊精與水的質量比為1∶4，剪切時間分別設置為1、2、3、5、7 min。以各綜合評分（Y）對剪切時間（X）繪圖，見圖3?？梢姡S著剪切時間的不斷增大，綜合評分呈先增大后平穩(wěn)的趨勢；剪切時間在1～2 min時，增加趨勢較明顯；隨著剪切時間延長，包合反應逐漸達到平衡，故綜合評分增加趨勢逐漸平緩。

圖3 剪切時間對綜合評分的影響Figure 3 Effect of shearing time on comprehensive score

2.5.3β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比對綜合評分的影響 固定剪切轉速為3 000 r/min，剪切時間為5 min，β-環(huán)糊精與水的質量比為1∶4，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比分別設置為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1。以各綜合評分（Y）對β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比（X）繪圖，見圖4?？梢?，隨著β-環(huán)糊精用量的不斷增大，綜合評分呈先迅速增加后略有增加的趨勢；當揮發(fā)油的加入量恒定時，隨著β-環(huán)糊精用量的不斷增加，β-細辛醚幾乎全部進入β-環(huán)糊精空腔，因此再增加β-環(huán)糊精用量但綜合評分僅略有增加。

圖4 β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比對綜合評分的影響Figure 4 Effect of mass ratio of β-CD and volatile oil on comprehensive score

2.5.4β-環(huán)糊精與水的質量比對綜合評分的影響 固定剪切轉速為3 000 r/min，剪切時間為5 min，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為8∶1，β-環(huán)糊精與水的質量比分別設置為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。各綜合評分（Y）對β-環(huán)糊精與水的質量比（X）繪圖，見圖5?？梢?，隨著水用量的不斷增大，綜合評分呈略微下降的趨勢。推測隨著水用量的不斷增大，β-環(huán)糊精被逐漸分散在溶液中，β-細辛醚與β-環(huán)糊精的碰撞概率減小，故β-細辛醚進入β-環(huán)糊精空腔的概率減小，使得綜合評分逐漸下降，但下降趨勢不明顯，基于節(jié)能增效等實際生產角度出發(fā)，將β-環(huán)糊精與水的質量比固定為1∶4。

圖5 β-環(huán)糊精與水的質量比對綜合評分的影響Figure 5 Effect of mass ratio of β-CD and water on compre‐hensive score

2.6 Box-Behnken響應面優(yōu)化包合工藝

2.6.1 Box-Behnken 試驗設計及結果 選取單因素試驗考察中影響較大的剪切時間（A）、剪切轉速（B）、β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比（C）為影響因素，以包合物得率、β-細辛醚包合率的綜合評分作為響應值，采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件設計三因素三水平的響應面試驗，因素與水平見表1?；谛畔㈧刭x權原理，按“2.3”項下方法得到包合物得率、β-細辛醚包合率的權重系數(shù)分別為0.162 4、0.837 6，并計算綜合評分，Box-Behnken 響應面設計及結果見表2。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

2.6.2 Box-Behnken 試驗結果分析 利用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對表2中綜合評分值進行二次多元回歸擬合，結果見表3。由結果可得到對編碼自變量A、B、C 的二次多項式擬合回歸方程：M=0.860+0.070A+0.16B+0.032C+0.037AB+0.032AC+0.053BC-0.043A2-0.12B2+0.003C2。建立的二次多元模型F=12.78，模型P=0.001 4<0.01，表明該試驗擬合的模型差異具有統(tǒng)計學意義。失擬項P=0.749 8>0.05，表明失擬項不顯著，未知因素對試驗結果干擾小，殘差均由隨機誤差引起。綜合評分回歸方程的相關系數(shù)R2=0.942 6>0.9，表明可用此模型來分析和預測石菖蒲揮發(fā)油剪切包合工藝結果。由F值可見，各因素對綜合評分影響大小順序為：剪切轉速（B）>剪切時間（A）>β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比（C），因素A、B 及二次項B2對綜合評分的影響具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余項影響不具統(tǒng)計學意義，表明各因素對綜合評分的影響并非簡單的線性關系。為了直觀表達2個因素同時對綜合評分的影響，根據(jù)回歸模型方程，固定任意一個因素的值，考察其他2 個因素交互作用對綜合評分的影響，結果見圖6-8?？梢?，交互項AB、AC、BC對綜合評分的影響不具統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為3D 響應面較為平緩，這與方差分析結果一致。

圖6 剪切轉速與剪切時間對綜合評分影響的響應曲面和等高線圖Figure 6 Response surface and contour plots of the effect of shear speed and shear time on the comprehensive score

表2 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken response surface test

表3 擬合回歸方程的方差分析結果Table 3 The results of analysis variance of the fitted regression equations

2.6.3 設計空間的建立 在Box-Behnken 設計試驗中，建立了剪切時間（A）、剪切轉速（B）、β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比（C）3 個關鍵因素與包合物得率、β-細辛醚包合率的綜合評分之間的二項式模型及其擬合回歸方程。模型是設計空間的基礎，數(shù)學模型的準確性與否將直接影響設計空間是否可靠。但經過對比分析發(fā)現(xiàn)，模型的預測值與實際值存在一定誤差，表明模型的可靠性需要進一步考察[15]。因此，本研究根據(jù)Box-Behnken 設計試驗建立的模型為基礎，選取Box-Behnken 試驗中具有顯著性影響的剪切時間（A）、剪切轉速（B），進行設計空間的開發(fā)，采用置信區(qū)間來考察設計空間的可靠性。為進一步提升工藝品質，依據(jù)企業(yè)實際生產情況，設定包合工藝綜合評分值應大于0.85。通過Design-Expert.V 8.0.6.1 軟件建立設計空間，由于模型的預測值與真實值之間存在一定差異，導致設計空間的邊界具有不確定性[16]，故加入置信水平α=0.05 的置信區(qū)間，結果采用Overlay polt 可視化，見圖9?？梢?，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比對綜合評分的影響無顯著性，故用β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比調節(jié)設計空間；當β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為8∶1時，出現(xiàn)穩(wěn)健區(qū)；當β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為10∶1時，穩(wěn)健區(qū)達到最大值，然后隨著β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比的不斷增大穩(wěn)健區(qū)也逐漸減小。優(yōu)化得到的設計空間具有不規(guī)則性，為方便實際操作，在設計空間中選擇規(guī)則的矩形區(qū)域如圖9B 中紅色框區(qū)域所示，得到推薦的操作空間范圍：剪切轉速為4 400～6 000 r/min，剪切時間為3.5～5.0 min。

圖7 剪切時間和β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比對綜合評分影響的響應曲面和等高線圖Figure 7 Response surface and contour plots of the effect of shear time and mass ratio of β-CD to volatile oil on comprehensive score

圖8 剪切轉速和β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比對綜合評分影響的響應曲面和等高線圖Figure 8 Response surface and contour plots of the effect of shear speed and mass ratio of β-CD to volatile oil on comprehensive score

圖9 加入95%置信區(qū)間的包合工藝設計空間Figure 9 Inclusion process design space with 95% confidence interval

2.7 設計空間的驗證試驗

綜合考慮包合效果及實際生產成本，故從設計空間中選定β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的質量比為8∶1。在設計空間內、外共選取5 個試驗點進行驗證試驗，1號、2 號和3 號為95%置信區(qū)間內的點（亮黃色區(qū)域），4 號和5 號為原設計空間內即95%置信區(qū)間外的點（淺黃色區(qū)域），驗證結果見表4。從驗證結果可知，預測值和實際值相接近，獨立樣本t檢驗P=0.921>0.05，表明實測值與預測值差異無統(tǒng)計學意義，模型具有較好的預測性。

表4 驗證試驗結果Table 4 The results of verification test

2.8 包合物的驗證試驗

采用KBr 壓片法，掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描64 次。分別對石菖蒲揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、石菖蒲揮發(fā)油物理混合物、石菖蒲揮發(fā)油包合物驗證樣品紅外區(qū)間吸收峰的變化進行分析，結果見圖10。以驗證5（包合物5）為參照圖譜，石菖蒲揮發(fā)油、物理混合物、驗證1～4（包合物1～4）、β-環(huán)糊精的相似度分別為0.15、0.53、0.99、0.99、1.00、1.00、0.88，表明所優(yōu)選的設計空間制備工藝穩(wěn)定，包合物質量具有一致性。石菖蒲揮發(fā)油包合物的紅外特征與β-環(huán)糊精相似，在波數(shù)2 927、1 368、947、861、756、609、578、529 cm-1處均有吸收，且峰形相同，但二者的吸收存在一定差異。包合物在1 639、1 511、1 411、1 333、1 246、1 205 cm-1處有新的吸收，在1 205～1 639 cm-1的紅外吸收峰差異較大，原因可能是石菖蒲揮發(fā)油進入了β-環(huán)糊精的空腔且影響了碳氫的彎曲振動（δC-H）；在2 000 cm-1、654～708 cm-1的指紋區(qū)也顯現(xiàn)了一定的差異，表明石菖蒲揮發(fā)油的進入改變了β-環(huán)糊精的化學環(huán)境。石菖蒲揮發(fā)油與石菖蒲揮發(fā)油包合物的紅外吸收光譜具有顯著差異，經包合后石菖蒲揮發(fā)油在1 741、1 672、1 699、1 585、1 608、1 464、1 439 cm-1等處的吸收峰均減小，表明石菖蒲揮發(fā)油包合后，其紅外振動受到限制。物理混合物的紅外光譜圖既有3 368、2 927 cm-1等β-環(huán)糊精的紅外吸收，又有1 511、937、1 205 cm-1等揮發(fā)油的紅外吸收，為β-環(huán)糊精與石菖蒲揮發(fā)油的加和。

圖10 石菖蒲揮發(fā)油包合物的紅外光譜圖Figure 10 IR spectrogram of volatile oil inclusion complex of A.tatarrinowii Schott

3 討論

目前，揮發(fā)油包合物制備工藝主要有飽和水溶液法、研磨法和超聲法，常經過冷藏、抽濾、洗滌、干燥等工序，包合過程速度慢、成本高[17-18]。噴霧干燥通過將包合液霧化成細小的液滴，再采用熱空氣進行干燥，從而在較短的停留時間內將包合液轉化為固體粉末，具有生產效率高、產品特性穩(wěn)定、全過程自動可控的優(yōu)點，更適合大規(guī)模工業(yè)化生產[19-20]。本課題組前期對噴霧干燥工藝進行優(yōu)化并完成了多次驗證試驗，結果表明噴霧干燥工藝參數(shù)對包合物的質量無顯著影響[11]；因此，本研究確定噴霧干燥工藝參數(shù)為進風溫度175 ℃，出風溫度90 ℃，進一步采用響應面法優(yōu)化石菖蒲揮發(fā)油高速剪切包合工藝，為石菖蒲揮發(fā)油的固體制劑生產提供依據(jù)。

從歡[21]、楊小催[22]、柯瑜[23]等采用飽和水溶液法制備石菖蒲揮發(fā)油包合物，攪拌包合時間主要為1～3 h，且常用石油醚、甲醇等對包合物進行洗滌，最后進行3～4 h 的低溫干燥，得粉狀包合物。本研究采用高速剪切結合噴霧干燥技術制備石菖蒲揮發(fā)油包合物，既顯著地縮短了包合時間，提高了生產效率；又可減少過濾、洗滌等制備工序，具有操作簡便、綠色環(huán)保的特點。錢一帆等[9]采用膠體磨包合法制備石菖蒲揮發(fā)油包合物，包合時間較短（20～40 min），但清洗操作較為不便，在一定程度上造成包合物的損失和殘留。本研究采用高速剪切技術對石菖蒲揮發(fā)油進行包合，與王景霞等[24]研究結果對比，其包合物得率及β-細辛醚包合率更高，可分別達90%、50%以上，且包合時間更短，為3.5～5.0 min。

綜上，高速剪切包合技術具有包合率高、生產效率高、工藝穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點，對工業(yè)化放大生產具有一定的參考價值，可進一步推廣使用。