大米硒蛋白的提取及工藝優(yōu)化研究

羅 晶，胡 帥，楊標(biāo)斌，李 信，歐陽(yáng)玲花，周巾英，袁林峰，祝水蘭*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江西 南昌 330200；2.江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院 工業(yè)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)院，江西 南昌 330200）

目前我國(guó)富硒稻米的種植面積不斷擴(kuò)大，但富硒大米深加工仍處于初級(jí)加工狀態(tài)，在加工技術(shù)和經(jīng)濟(jì)效益上與發(fā)達(dá)國(guó)家存在很大差距。硒蛋白具有良好的生物活性，主要包括抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)活性和抑制高血糖活性等［1-3］。硒是人和動(dòng)物的必需微量元素之一，具有調(diào)節(jié)心血管、提高免疫力和抗癌防癌等作用［4］，硒蛋白在人體內(nèi)發(fā)揮著降低重金屬毒害等特殊生理功能［5］。富硒蛋白是無(wú)機(jī)硒的潛在替代品，不僅具有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，而且具有硒的理化性質(zhì)［6］。基于此，開(kāi)發(fā)一種科學(xué)、定量補(bǔ)硒的富硒蛋白粉已成為目前的迫切需求，同時(shí)在深加工中減少硒的流失，從而提高富硒稻米的經(jīng)濟(jì)附加值及硒元素的利用率，提升我國(guó)稻米深加工的技術(shù)水平和綜合利用水平。

目前，硒蛋白的提取方法主要包括溶劑提?。ㄋⅪ}、乙醇、酸、酶和堿溶液萃取）、電泳分離萃取、TRIzol結(jié)合陰離子交換柱萃取、超聲輔助提取和脈沖電場(chǎng)輔助提取等［7］。梁潘霞等［8］以富硒大米為原料，采用堿提法提取硒蛋白，最佳提取條件為：提取溫度50 ℃、堿液濃度0.14 mol/L、提取時(shí)間5 h、料液比1∶30，硒蛋白提取率為57.11%。王克鐵等［9］以米渣磨漿，采用超聲與高壓均質(zhì)法結(jié)合處理，得到蛋白液，濃縮干燥后獲取蛋白粉。Liang等［10］使用100 Hz超聲波清洗器輔助，料液比1∶15的NaOH 0.05 mol/L，DL-二硫蘇糖醇2.5%和0.5%亞硫酸鈉，40 ℃提取4 h，經(jīng)冷凍干燥，獲得蛋白粉。Wu等［11］比較了4種提取方法（水提取、脈沖電預(yù)處理+水提取、超聲輔助提取和脈沖電預(yù)處理+超聲輔助提取）對(duì)富硒小豆蔻的蛋白質(zhì)和硒含量的影響，其中超聲輔助提取方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)純度最高（77%）和總硒含量（9097.33±35.66 mg/kg）。溶劑提取法由于其高效率和低成本而受到廣泛推廣，但是同時(shí)也存在著硒蛋白嚴(yán)重流失的問(wèn)題。因此，研究一種高效提取硒蛋白的方法具有廣闊的市場(chǎng)推廣價(jià)值。

本研究使用富硒稻米生產(chǎn)中的碎米為主要原料提取硒蛋白。采用超聲波細(xì)胞粉碎與堿法聯(lián)用提取硒蛋白，并分析其硒形態(tài)。通過(guò)配制堿提液來(lái)高效斷裂蛋白質(zhì)分子的二硫鍵，再用酸調(diào)等電點(diǎn)使硒蛋白析出沉淀并獲取硒蛋白。此方法解決了缺硒地區(qū)補(bǔ)硒的問(wèn)題，高效、便捷地提取出了具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的碎米硒蛋白，該硒蛋白可用作營(yíng)養(yǎng)輔料或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有較高的利用價(jià)值。探究了超聲波堿法提取富硒大米中硒蛋白的效果，并獲得提取的最佳工藝條件，為提高硒蛋白資源的開(kāi)發(fā)利用及增加營(yíng)養(yǎng)食品的附加值、多樣性和便捷性提供了有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒大米用粉碎機(jī)粉碎至全部通過(guò)100目篩孔，密封置于干燥器中備用；試驗(yàn)用水均為超純水；鹽酸、氫氧化鈉采購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

使用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備包括XL-200A型粉碎機(jī)（上海潤(rùn)實(shí)電器有限公司）、TP-214型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、UP250型超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、WZJ-12B型超微粉碎儀（濟(jì)南天方機(jī)械有限公司）、B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）、SHA-B型水浴恒溫振蕩器（常州潤(rùn)華電器有限公司）、LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）、HJ-4B數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力攪拌器（金壇區(qū)金城晶澤實(shí)驗(yàn)儀器廠）、PHS-3C雷磁pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、SY-3000A型磨粉機(jī)（善友機(jī)械設(shè)備有限公司）、EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 富硒大米硒蛋白等電點(diǎn)pH值的測(cè)定 將富硒大米加工產(chǎn)物碎米粉碎，加入NaOH溶液混勻。采用5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，使淀粉充分沉淀，分別取出上清液20 mL，放入7個(gè)50 mL的小燒杯中用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將燒杯中溶液的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。取7個(gè)潔凈并已稱質(zhì)量（m0）的離心管，分別將上述燒杯中的溶液放于離心管中稱量質(zhì)量（m1），然后在5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，將上清液小心傾入另一試管中，并測(cè)定上清液中的蛋白的質(zhì)量濃度，同時(shí)稱量離心后沉淀與離心管的質(zhì)量（m），并計(jì)算沉淀率，計(jì)算公式如下：

1.3.2 富硒大米硒蛋白提取工藝 將富硒大米碎米粉碎得到大米粉末，加入一定量的堿液混勻，經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎儀及磁力攪拌器攪拌一定的時(shí)間，所得漿液在5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，然后將pH值調(diào)至等電點(diǎn)4.5，倒出上清液，將沉淀物的pH值調(diào)至中性，經(jīng)冷凍干燥得富硒大米蛋白粉。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 固定超聲波功率190 Hz，料液比1∶8，NaOH濃度0.4%，提取時(shí)間2 h。分析不同的超聲波功率（130、160、190、220、250 Hz）、料液質(zhì)量體積比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、NaOH濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)硒蛋白提取的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件選擇對(duì)硒得率有顯著影響的因素，應(yīng)用Box-Behnhen設(shè)計(jì)硒得率為響應(yīng)值，從中篩選出提取硒蛋白的最優(yōu)條件。響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平

1.3.4 硒蛋白提取率的計(jì)算 上清液中的蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，采用G250染色液試劑比色法。采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度值，再用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求曲線回歸方程，從而算出總蛋白質(zhì)含量；硒蛋白質(zhì)測(cè)定采用GB 5009.5—2016食品中的蛋白質(zhì)的測(cè)定；硒含量測(cè)定采用氫化物原子熒光光譜法，按照GB 5009.93—2017中的方法測(cè)定硒含量。硒得率和硒蛋白提取率的計(jì)算公式如下所示：

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。應(yīng)用SPSS 24軟件進(jìn)行Anova和Duncan檢驗(yàn)，以確定平均值之間的顯著性差異（P＜0.05）；應(yīng)用Origin 8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖；應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米硒蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

2.1.1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線 牛血清蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度0～1.5 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 大米蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH值的測(cè)定 在等電點(diǎn)pH條件下，蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度最小，產(chǎn)生的沉淀量最大。由圖2可知，在不同pH值條件下，蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。在pH值為5.5條件下的硒蛋白沉淀量較大；pH值為3.5條件下的沉淀率最大（7.0%），且上清液中的蛋白含量達(dá)到最低（0.11 mg/mL），硒蛋白的等電點(diǎn)的pH值為3.5。由于等電點(diǎn)條件下的蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其蛋白質(zhì)分子顆粒極易相互碰撞、凝聚而析出沉淀。因此，在該等電點(diǎn)條件下溶液中蛋白質(zhì)的溶解度最小［12］。由本試驗(yàn)的結(jié)果可以得出，硒蛋白的等電點(diǎn)為3.5。

圖2 pH值對(duì)富硒大米蛋白含量及沉淀率的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲波功率對(duì)大米蛋白提取率及硒得率的影響 在硒蛋白提取過(guò)程中，結(jié)合超聲波細(xì)胞粉碎儀可大幅提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)出率。由圖3可知，隨著超聲波功率升高，硒蛋白提取率先升高后降低。當(dāng)超聲波功率為220 Hz時(shí)，硒蛋白提取率為50.6%，硒得率為98.17%；在超聲波功率為250 Hz時(shí)，硒蛋白提取率為49.91%，硒得率為99.43%。因此，當(dāng)超聲波功率為220 Hz時(shí)，硒蛋白提取率最高。這說(shuō)明超聲波通過(guò)機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)提取蛋白質(zhì)，可顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，從而提高蛋白質(zhì)的提取速率［13］。加大超聲波功率，可強(qiáng)化超聲空化作用和機(jī)械剪切作用，有助于大米蛋白的溶出。但隨著功率增加，上述作用效應(yīng)會(huì)出現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，如當(dāng)功率達(dá)220 Hz后，硒蛋白提取率出現(xiàn)了略微下降。綜上，設(shè)定220 Hz為最適的超聲波功率。

圖3 超聲波功率對(duì)硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.2 料液比對(duì)大米蛋白得率及硒得率的影響 由圖4可知，硒蛋白提取率和硒得率隨料液比增大呈先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為50.93%、99.86%。當(dāng)液料比較低時(shí)，提取液的黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，蛋白分子的溶出速率較低，且蛋白質(zhì)量濃度較高，分子間的相互斥力會(huì)阻礙更多蛋白的溶出［14］。隨著液料比的增加，稀釋作用加強(qiáng)，提取液的黏度和蛋白質(zhì)量濃度均有所下降，蛋白的溶出增加，提取率升高。當(dāng)料液比為1∶10條件下，蛋白能夠充分析出，此時(shí)蛋白收率達(dá)到最大。當(dāng)繼續(xù)增大料液比時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)濃度較低，泡沫穩(wěn)定性較差，蛋白質(zhì)得率降低［15］。

圖4 料液比對(duì)硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.3 堿濃度對(duì)大米蛋白提取率及硒得率的影響 由圖5可知，隨著堿濃度增加，硒蛋白提取率與硒得率呈先增后降趨勢(shì)。當(dāng)堿濃度為0.4%時(shí)，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為49.36%、99.43%。大米蛋白在胚乳中與淀粉結(jié)合緊密，較難溶出。NaOH能夠有效提高蛋白的溶解性，其可以破壞蛋白分子中的二硫鍵、氫鍵和酰胺鍵，使蛋白質(zhì)的溶解性上升，提高了蛋白質(zhì)的提取產(chǎn)率［16］。當(dāng)堿濃度超過(guò)0.4%后，由于淀粉部分糊化，使溶液黏度增加，導(dǎo)致蛋白無(wú)法被提取出來(lái)，蛋白提取率下降。因此最適的堿濃度為0.4%。

圖5 堿濃度對(duì)硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)大米蛋白提取率及硒得率的影響 由圖6可知，隨著提取時(shí)間的增加，硒蛋白提取率與硒得率均呈先增后降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，硒蛋白提取率和硒得率最大，分別為55.74%、99.98%。提取時(shí)間較長(zhǎng)和過(guò)高濃度的堿液會(huì)使得蛋白質(zhì)的半胱氨酸和絲氨酸結(jié)合形成賴丙氨酸，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失［17］。因此使用超聲波細(xì)胞粉碎儀和磁力攪拌器輔助，可縮短堿液提取時(shí)間，降低堿液濃度，提高硒蛋白提取率。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2 h時(shí)，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)凝聚沉積現(xiàn)象，導(dǎo)致了蛋白提取率降低［18］。

圖6 提取時(shí)間對(duì)硒蛋白提取率及硒得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

從單因素試驗(yàn)的結(jié)果可得，超聲波功率220 Hz、料液比1∶10 g/mL、堿濃度0.4%、提取時(shí)間2 h分別為各單因素下的最佳提取硒蛋白條件。在單因素的基礎(chǔ)上，以硒蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)超聲波功率、料液比、堿濃度、提取時(shí)間進(jìn)行四因 素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 回歸方程及參數(shù)分析 通過(guò)Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=57.44+1.55A+1.15B+1.13C-1.18D-0.35AB+ 1.15AC-1.50AD+1.38BC+1.34BD+0.013CD-2.96A2-4.19B2-8.52C2-3.73D2。

該模型的顯著性分析見(jiàn)表3，由方差分析結(jié)果可知，模型F=89.16，該回歸模型P＜0.0001，說(shuō)明該回歸差異極顯著；方程失擬項(xiàng)F=3.46、P＞0.05，表明失擬項(xiàng)對(duì)純誤差的影響不顯著；該模型的決定系數(shù)（R2）為0.9778，校正決定系數(shù)（R2adj）為0.9409，說(shuō)明該回歸方程與試驗(yàn)擬合度良好，其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾??；根據(jù)F值可知，影響富硒大米蛋白提取率的4個(gè)因素的大小順序依次為堿濃度、料液比、超聲功率、提取時(shí)間；根據(jù)P的變化可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、BC和AD對(duì)硒蛋白提取率影響極顯著（P＜0.01）。

表3 顯著性分析

續(xù)表3：

2.3.2 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件分析得出大米蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為：堿濃度0.14%、料液比1∶10、超聲波功率220 Hz、提取時(shí)間2 h。該條件下大米硒蛋白提取率為57.44%，對(duì)優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得大米硒蛋白提取率為57.95%，與預(yù)測(cè)值非常接近，證實(shí)了該回歸模型用于提取大米硒蛋白具有較高的可靠性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)富硒大米蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。各因素對(duì)大米蛋白得率的主次因素為：NaOH濃度＞料液比＞超聲功率＞提取時(shí)間，驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步得到在超聲波功率220 Hz，堿液濃度0.4%，提取時(shí)間2 h，料液比1∶10條件下，大米硒蛋白提取率達(dá)到57.95%。本試驗(yàn)結(jié)果可為規(guī)?；崛〈竺孜鞍滋峁﹨⒖?，但其理化性質(zhì)還有待進(jìn)一步深入研究。