糖尿病導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙的機(jī)制及治療潛力

張 肖，黎 瑤

0 引言

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生了巨大變化，高糖、高脂的不健康飲食和運(yùn)動量的缺乏使我國的2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)病率逐步上升。有報(bào)道，中國有1.139億成人糖尿病患者，占全球糖尿病患者的24%，糖尿病對我國甚至全球的醫(yī)療系統(tǒng)都造成了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。隨著糖尿病病程的增加，糖尿病急慢性并發(fā)癥、高脂血癥及代謝綜合征的出現(xiàn)顯著降低了患者的生活質(zhì)量。糖尿病所伴隨的高糖毒性、胰島素抵抗及炎癥介質(zhì)的增加損害了血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量及功能，提高了心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)具有促進(jìn)缺血組織的血管再生及血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[3]。近年來，EPCs作為一項(xiàng)標(biāo)志物頻繁地與心血管不良事件及死亡率聯(lián)系在一起，越來越多的研究表明，糖尿病機(jī)體EPCs水平的下降，預(yù)示著心血管不良事件的發(fā)生率及死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，同時(shí)與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生及惡化密切相關(guān)[4]。EPCs的發(fā)現(xiàn)成為突破糖尿病長期慢性血管并發(fā)癥的窗口，使逆轉(zhuǎn)和改善微血管障礙及動脈粥樣硬化成為可能。本文就糖尿病環(huán)境導(dǎo)致EPCs功能障礙的機(jī)制進(jìn)行綜述，并回顧通過改善EPCs功能障礙使糖尿病血管并發(fā)癥得到受益的研究，探討EPCs逆轉(zhuǎn)糖尿病血管病變的治療潛力。

1 EPCs的概念

1997年，Asahara等[3]從外周血中分離出表達(dá)CD34+表面標(biāo)記的單核細(xì)胞，并證實(shí)了這些細(xì)胞在體外可以促進(jìn)缺血組織的血管再生。這一研究顛覆了既往研究認(rèn)為血管生成只發(fā)生在早期胚胎中的認(rèn)知，開創(chuàng)了研究內(nèi)皮祖細(xì)胞領(lǐng)域的先河。目前有2種方法研究內(nèi)皮祖細(xì)胞，第1種基于不同細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞分析，EPCs通常被量化為表達(dá)CD34+和血管內(nèi)皮生長因子受體 2(Vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2)的單核細(xì)胞百分比[5]；第2種是通過特定底物的培養(yǎng)基在體外細(xì)胞培養(yǎng)分離的方法，Hur等[6]將單核細(xì)胞從外周血中分離后，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2 BulletKi)重懸培養(yǎng)成2種EPCs，分為早期和晚期EPCs，早期的EPCs又稱為髓樣血管生成細(xì)胞(Myeloid angiogenic cells，MACS)，主要通過分泌促血管生成細(xì)胞因子來促進(jìn)新生血管的形成，主要包括血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)等，這些細(xì)胞因子有助于招募常駐的成熟內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)其增殖和存活。晚期EPCs又稱為內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(Endothelial colony forming cells，ECFCs)，ECFCs通過提供足夠數(shù)量的內(nèi)皮細(xì)胞直接促進(jìn)新生血管的生成。EPCs主要來自骨髓，外周血中的EPCs數(shù)量較少，當(dāng)機(jī)體處于缺血、缺氧的環(huán)境中時(shí)，EPCs分泌動員因子如VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)等激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)通路，通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)來促進(jìn)EPCs的動員、遷移，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)新生血管的形成；而糖尿病的慢性高糖暴露、胰島素抵抗、低度全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激阻礙了血管再生細(xì)胞運(yùn)輸，增殖到外周，造成機(jī)體的血管損傷與修復(fù)的失衡，這一過程稱為再生細(xì)胞耗竭[7]。

2 糖尿病導(dǎo)致EPCs功能障礙的機(jī)制

糖尿病最顯著的特征是胰島素抵抗及高血糖，慢性的高糖暴露導(dǎo)致祖細(xì)胞的增殖、分化及遷徙能力受損，同時(shí)使線粒體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成增加，導(dǎo)致eNOS 的表達(dá)和活性降低[8]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種血管擴(kuò)張劑，被證實(shí)具有抗炎、抗動脈粥樣硬化及介導(dǎo)血管生成的作用，NO的信號通路障礙導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，加速動脈粥樣硬化及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生[9-10]，而高糖環(huán)境導(dǎo)致的EPCs數(shù)量減少和功能損傷主要機(jī)制是MMP-9活性降低，eNOS脫偶聯(lián)，釋放受阻，從而導(dǎo)致NO生成減少[11]。EPCs分泌的SDF-1、VEGF促進(jìn)了循環(huán)內(nèi)皮干細(xì)胞的趨化與動員，在血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、成熟中發(fā)揮了重要作用[12]。除此之外，EPCs還通過MMP-9實(shí)現(xiàn)動員，其主要機(jī)制是通過釋放可溶性Kit配體(Soluble kit ligand，SKitL)，將干細(xì)胞與祖細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)[13]，進(jìn)而遷移到損傷的血管內(nèi)皮，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)及血管再生。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，VEGF和SDF-1的釋放受到抑制，使用胰島素治療后可以恢復(fù)兩者的釋放，并提高了eNOS和MMP-9的活性，因此胰島素治療主要通過VEGF/eNOS相關(guān)通路促進(jìn)了代償性新生血管的形成[14]。Terenzi等[15]利用祖細(xì)胞在成熟過程中隨著氧化應(yīng)激作用的增加而自身高醛脫氫酶 (High aldehyde dehydrogenase，ALDH) 活性逐漸降低的原理，結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與健康對照者相比,表達(dá)造血和內(nèi)皮祖細(xì)胞表型的細(xì)胞顯著減少，并且表達(dá)促炎M1表型的原始粒細(xì)胞增加，抗炎M2表型的循環(huán)單核細(xì)胞減少，表明糖尿病環(huán)境引起了機(jī)體全身的低度炎癥反應(yīng)。

3 EPCs的治療潛力

3.1 EPCs移植 EPCs促進(jìn)毛細(xì)血管再生及側(cè)支循環(huán)重塑使人們開始探索EPCs移植對于治療缺血性疾病的可行性。Tanaka等[16]使用自體G-CSF促進(jìn)了外周血中CD34+細(xì)胞的動員，在18周時(shí)發(fā)現(xiàn)糖尿病患者足部潰瘍傷口閉合，足底深動脈的血管灌注及血管分布增加。Yazdanyar等[17]將健康人骨髓中的CD34+細(xì)胞分離后注射到糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠模型玻璃體內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞快速遷徙整合到受損的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管，使視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的密度增加。但這僅證實(shí)祖細(xì)胞移植療法具有一定的安全性與可行性，仍有較多臨床研究發(fā)現(xiàn)，無論肌注、動脈內(nèi)注射，祖細(xì)胞移植療法用于治療心肌缺血、外周動脈缺血等疾病的效果未達(dá)預(yù)期[18]?？赡軝C(jī)制為糖尿病患者機(jī)體的外周血中EPCs數(shù)量減少、衰老加快、遷徙和歸巢功能受損，總之，祖細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的難控性限制了EPCs移植的臨床應(yīng)用及療效。在一項(xiàng)大型的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照試驗(yàn)中，將骨髓單核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells， BMMNCs)輸注到160例下肢嚴(yán)重缺血患者股總動脈內(nèi)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對照組在截肢率上并沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異[19]。因此，逆轉(zhuǎn)高糖、氧化應(yīng)激導(dǎo)致祖細(xì)胞的功能障礙和衰老是祖細(xì)胞移植必須解決的難題。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)核因子NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)的脂肪干細(xì)胞 (Adipose-derived stem cell，ADSC) 衍生的外泌體與祖細(xì)胞共同培養(yǎng)后可以抑制 ROS、IL-6促炎因子的形成來減緩高糖導(dǎo)致祖細(xì)胞的衰老加速，并且將EPCs與高表達(dá)Nrf2的ADSC外泌體聯(lián)合治療糖尿病小鼠傷口模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)傷口處肉芽組織增生顯著，微血管生成增加，證實(shí)了ADSC衍生的外泌體促進(jìn)了祖細(xì)胞增殖，高表達(dá)的Nrf2加強(qiáng)了高糖環(huán)境下對祖細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。除此之外，自體EPCs功能受損還與活性氧的清除減少緊密相關(guān)，糖尿病患者體內(nèi)的抗氧化酶如錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，MnSOD)的表達(dá)降低，有研究表明，用姜黃素處理后的EPCs自體移植到糖尿病小鼠傷口上可以加速傷口的愈合，姜黃素通過提高M(jìn)nSOD的表達(dá)和活性來逆轉(zhuǎn)糖尿病導(dǎo)致的EPCs功能障礙[21]。Tanaka等[22]研究出一種用于培養(yǎng)功能障礙祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，稱為質(zhì)量-數(shù)量培養(yǎng)系統(tǒng)(Quality-quantity control culture，QQc)，將糖尿病患者的外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PbMNCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)后再移植到糖尿病小鼠傷口模型中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后的PbMNCs表現(xiàn)高血管生成能力，抗炎相關(guān)基因表達(dá)增加，并促進(jìn)了糖尿病傷口愈合，這是目前用糖尿病患者血液進(jìn)行血管再生的臨床前研究之一。

3.2 降糖藥物對于EPCs的影響 EPCs的功能受損及體外擴(kuò)增困難限制了EPCs移植在臨床應(yīng)用的可行性，因此，從藥理學(xué)層面探索修復(fù)糖尿病導(dǎo)致的祖細(xì)胞功能障礙、促進(jìn)祖細(xì)胞的動員及歸巢的藥物，對于減少血管內(nèi)皮功能障礙、延緩和改善糖尿病引起的血管并發(fā)癥具有重要的臨床意義。目前一些試驗(yàn)研究了臨床常用的口服降糖藥物[如二甲雙胍、二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制劑、胰高血糖素樣肽受體(Glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1)激動劑及鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(Sodium-glucose cotransporter-2，SGLT-2)抑制劑等]對糖尿病機(jī)體EPCs的影響。

3.2.1 二甲雙胍 二甲雙胍是糖尿病的一線藥物，具有減重、降壓、降脂，改善心肌重塑的作用，已證實(shí)對心血管具有明確的保護(hù)作用。Ahmed等[23]為明確二甲雙胍對心臟保護(hù)作用的機(jī)制，進(jìn)行了一項(xiàng)MRRIT研究，23例無心血管疾病的1型糖尿病患者使用二甲雙胍治療8周，維持穩(wěn)定的血糖水平不變，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過增加EPCs改善了血管內(nèi)皮功能障礙，這種心臟保護(hù)作用超出了血糖水平控制達(dá)標(biāo)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。Asadian等[24]發(fā)現(xiàn)，胰島素與二甲雙胍聯(lián)用促進(jìn)了 T2DM 患者 EPCs 數(shù)量的增殖，SDF-1血清濃度的顯著增加代表EPCs的遷徙頻率增加，此外，還有血管生長因子如VEGF、Ang1 和 Ang2的血清濃度增加，預(yù)示著對糖尿病血管具有潛在保護(hù)作用。

3.2.2 SGLT-2抑制劑 SGLT-2抑制劑被證實(shí)具有保護(hù)心臟、腎臟的作用，可降低心衰患者的住院率。在一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)中，Hess等[25]通過ALDH酶活性量化內(nèi)皮祖細(xì)胞的表達(dá)頻率的方法，發(fā)現(xiàn)使用恩格列凈治療6個(gè)月后，促使循環(huán)單核細(xì)胞的平衡由促炎M1轉(zhuǎn)向抗炎M2表型，其次增加了CD133+的表達(dá)頻率，在關(guān)于氧化應(yīng)激方面，恩格列凈組減少了NADPH氧化酶的產(chǎn)生，降低了氧化應(yīng)激水平。此外，一項(xiàng)二甲雙胍和/或胰島素治療的基礎(chǔ)上加用卡格列凈或安慰劑為期 16 周的雙盲、隨機(jī)、安慰劑匹配試驗(yàn)顯示，卡格列凈組的CD34+細(xì)胞表達(dá)趨化因子C-X-C-基元受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)及 SDF-1顯著增加，表明卡格列凈改善了祖細(xì)胞的遷移功能；并且CD34+細(xì)胞的基因表達(dá)分析顯示，抗氧化劑如超氧化物歧化酶2、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶增加，同時(shí)引起內(nèi)皮標(biāo)志物(PECAM1、VEGF-A 和 NOS3)的表達(dá)上調(diào)，這預(yù)示卡格列凈改善了血管內(nèi)皮功能，CD34+細(xì)胞可以作為評估內(nèi)皮功能的有價(jià)值的生物標(biāo)志物之一，為臨床提前干預(yù)提供有價(jià)值的線索[26]。

3.2.3 GLP-1受體激動劑 GLP-1是由腸道L細(xì)胞分泌的一種腸促胰素，通過促進(jìn)VEGF的分泌，刺激EPCs數(shù)量增加，從而改善內(nèi)皮功能障礙，達(dá)到保護(hù)心血管的作用[27]。De Ciuceis等[28]為比較利拉魯肽與艾塞那肽對EPCs及毛細(xì)血管密度的影響，通過流式細(xì)胞儀評估治療4周后的EPCs數(shù)量，發(fā)現(xiàn)使用艾塞那肽治療后EPCs的數(shù)量及外周靜脈毛細(xì)血管密度增加，而利拉魯肽組沒有增加，但此實(shí)驗(yàn)的樣本量較少，存在一些可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚的混雜因素，如吸煙、高血壓病史等，因此，需要更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)研究來證實(shí)艾塞那肽對EPCs的受益。除外GLP-1受體激動劑，exendin-4 是一種GLP-1類似物，在一項(xiàng)關(guān)于exendin-4對糖尿病大鼠傷口愈合作用的實(shí)驗(yàn)中，使用exendin-4腹腔注射4周后，發(fā)現(xiàn)exendin-4促使了糖尿病大鼠的傷口閉合，EPCs的數(shù)量明顯增加，增加了毛細(xì)血管的生成及分化，并且減弱了炎癥反應(yīng)[29]。Yang等[30]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，exendin-4改善了高糖毒性對于EPCs形成能力及遷徙功能的損傷，通過SDF-1β/CXCR7-AMPK/p38-MAPK軸抑制促炎因子IL-6 的生成來逆轉(zhuǎn)高血糖誘導(dǎo)的 EPCs功能障礙。

3.2.4 DPP-4抑制劑 DPP-4酶可降解GLP-1，趨化因子SDF-1，因此，DPP-4抑制劑可以通過增加SDF-1來促進(jìn)祖細(xì)胞的動員。在一項(xiàng)沙格列汀聯(lián)合二甲雙胍的雙盲隨機(jī)安慰劑對照試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞雖無明顯的增加，但通過提高CD34+細(xì)胞對SDF-1的遷徙反應(yīng)使祖細(xì)胞的遷徙率增加[31]。同樣的陽性結(jié)果出現(xiàn)在另一項(xiàng)隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)中，沙格列汀組和二甲雙胍組均使EPCs的數(shù)量增加，且兩組之間無顯著差異[32]。Awal等[33]研究利格列汀對糖尿病腎病患者內(nèi)皮功能的影響，31例使用胰島素或二甲雙胍的患者加入利格列汀治療，12周后發(fā)現(xiàn)使用利格列汀組的CD34+和CD34+、CD184+雙陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，同時(shí)改善了動脈僵硬參數(shù)和腎功能。

除了降糖藥物對EPCs的影響，EPCs也受益于他汀類藥物、抗氧化物質(zhì)及運(yùn)動等。血管內(nèi)皮損傷及修復(fù)的失衡導(dǎo)致祖細(xì)胞數(shù)量減少，VEFG降低導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[34]。他汀類藥物被證實(shí)具有延緩EPCs衰老、促進(jìn)祖細(xì)胞增殖的作用[35]。將普伐他汀添加到體外培養(yǎng)的內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(Endothelial colony forming cells，ECFC)后，發(fā)現(xiàn)普伐他汀促進(jìn)了ECFC增殖，增加了蛋白激酶B和eNOS 磷酸化，這可能是他汀類藥物改善內(nèi)皮功能障礙、治療動脈粥樣硬化的機(jī)制之一[36]。非諾貝特是一種過氧化物酶體增殖物激活受體α (Peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα) 激動劑，通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3炎癥小體 (Nod-like receptor protein 3，NLRP3) 來恢復(fù)EPCs功能障礙，加速糖尿病小鼠的傷口愈合[37]。番茄紅素(Lycopene ，LYC)是一種天然的抗氧化劑，可以恢復(fù)糖尿病大鼠EPCs周期阻滯，使其免受晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)誘導(dǎo)的凋亡及氧化自噬，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖，保護(hù)EPCs數(shù)量及功能[38]。一項(xiàng)在胰島素基礎(chǔ)上加用硫辛酸治療的隨機(jī)對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加用硫辛酸治療后,機(jī)體的抗氧化酶活性顯著增加，且與內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的明顯增加和功能的改善具有相關(guān)性[39]。除外藥物、抗氧化物質(zhì)，適當(dāng)?shù)挠醒鹾妥杩惯\(yùn)動可以降低全身炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，從而降低糖尿病、代謝綜合征發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[40]。Zhai等[41]發(fā)現(xiàn)了有氧聯(lián)合阻抗運(yùn)動可改善2型糖尿病小鼠EPCs的增殖功能，主要機(jī)制可能是有氧聯(lián)合阻抗運(yùn)動誘導(dǎo)了caveolin-1蛋白表達(dá)的增加。caveolin-1存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，對于SDF-1驅(qū)動的EPCs動員發(fā)揮了核心作用。一項(xiàng)研究對比了運(yùn)動對1型糖尿病患者與健康人群造血干細(xì)胞(Hematopoietic progenitor cells，HPCs)與祖細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動促使1型糖尿病患者機(jī)體HPCs、EPCs的增加，趨化因子受體CXCR4、C-X-C-基元受體7(C-X-C motif chemokine receptor 7，CXCR7)表達(dá)增加，這有助于修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，降低1型糖尿病患者出現(xiàn)血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[42]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，糖尿病引起機(jī)體EPCs數(shù)量減少、衰老加速、動員招募及歸巢障礙，因此，增加糖尿病患者EPCs數(shù)量、保護(hù)EPCs免受氧化應(yīng)激及高糖損傷是逆轉(zhuǎn)糖尿病血管并發(fā)癥的一個(gè)可能的方向。糖尿病患者外周血中EPCs數(shù)量少、EPCs分離困難、具有質(zhì)量難控性，需要大量的臨床試驗(yàn)來證實(shí)細(xì)胞移植的安全性及有效性。目前研究的降糖藥物、降脂藥物及抗氧化物質(zhì)對于糖尿病EPCs的影響是有益的，但仍需更多的臨床試驗(yàn)樣本以及更長的臨床觀察時(shí)間來明確藥物對于遠(yuǎn)期防治糖尿病血管并發(fā)癥的作用，這對于預(yù)防糖尿病導(dǎo)致的微血管病變，動脈粥樣硬化，降低糖尿病心血管事件風(fēng)險(xiǎn)具有重要的臨床意義。