發(fā)酵溫度對(duì)高山被孢霉合成ω3/ω6多不飽和脂肪酸的影響

夏繼蓉，金 娜，蘇榮鎮(zhèn)，楊建華，溫燕龍，李凌飛

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 昆明 650201)

【研究意義】多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是細(xì)胞正常生長和發(fā)育必需的脂質(zhì)，是生物膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，對(duì)激素代謝和許多酶的活性起調(diào)控作用[1]。根據(jù)第一個(gè)不飽和雙鍵位置的不同，PUFAs主要分成4類：ω-3、ω-6、ω-7、ω-9類，其中ω-3類和ω-6類較為常見[2]。ω-3 PUFAs包含二十碳五烯酸(EPA)、α-亞麻酸(ALA)、十二碳六烯酸(DHA)等；ω-6 PUFAs包含花生四烯酸(ARA)、γ-亞油酸(GLA)、亞油酸(LA)等。ω-3和ω-6 PUFAs在包括人類在內(nèi)的高等生物體中具有重要的結(jié)構(gòu)和功能作用[3]，例如ω-6 PUFAs中的ARA是前列腺素、白三烯、血栓烷等二十烷類激素的前體，由于其獨(dú)特的生理功能，它被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域[4]。在膳食中攝入ω-3 PUFAs對(duì)預(yù)防炎癥性疾病和維持正常腦功能具有重要作用[5-6]。二十碳五烯酸(EPA)是一種具有代表性的ω-3 PUFAs[7]，可用于治療心血管疾病，降低血小板聚集和血壓[8]。相對(duì)于ω-6 PUFAs的豐富來源，自然界中ω-3 PUFAs的來源僅僅是深海魚類[9]。然而，海洋魚類資源的減少、開采的復(fù)雜性和海洋污染的增加已經(jīng)成為生產(chǎn)ω-3 PUFAs的限制因素[10]。研究表明，含有一些外源去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生ω-3和ω-6 PUFAs[11]，但基于對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全性的考慮，這些轉(zhuǎn)基因來源并不適合實(shí)際用途。因此，許多研究優(yōu)先開發(fā)微生物作為生產(chǎn)PUFAs的新來源[12]。【前人研究進(jìn)展】高山被孢霉(Mortierellaalpina)是目前產(chǎn)PUFAs真菌中具有正式安全性評(píng)估的菌種，其菌體中含有豐富的PUFAs，總脂肪酸含量可達(dá)菌體生物量的50%，其中ω-3達(dá)到總脂肪酸含量的3%，而ω-6可達(dá)總脂肪酸含量的近30%，是名副其實(shí)的油脂細(xì)胞工廠[13]。M.alpina菌體中PUFAs合成路徑復(fù)雜，M.alpina主要通過ω-6途徑積累以ARA為主的PUFAs[14]，十八烷酸(Stearic C18∶0)依次在Δ9脫飽和酶、Δ12脫飽和酶和Δ6脫飽和酶的催化下生成GLA，而后在Δ6延長酶的作用下生成DGLA，在通過Δ5脫飽和生成ARA。Δ12脫飽和酶和Δ15脫飽和酶分別催化ω-6和ω-3 PUFAs的生物合成，其活性差異可能是M.alpina高產(chǎn)ARA而低產(chǎn)EPA的原因[15]。研究人員采用過表達(dá)ω-3脂肪酸去飽和酶基因，如oPaFADS17和oPpFADS17來提高EPA的產(chǎn)量[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】酶的催化效率易受溫度的影響，而目前溫度對(duì)M.alpina合成PUFAs的影響知之甚少。在本研究中，采用改變培養(yǎng)溫度的策略，測(cè)定不同發(fā)酵溫度下M.alpina的生物量以及ω3、ω6 PUFAs組成及各組分含量和產(chǎn)量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina合成ω3、ω6 PUFAs的影響，為M.alpina工業(yè)化生產(chǎn)ω3/ω6營養(yǎng)平衡膳食油脂奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 高子被孢霉(M.alpinaD36)菌株為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離獲得并經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定的菌株。

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂含氯霉素(PDA)、葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、甲苯、甲醇、正己烷、碳酸氫鉀、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、十七烷酸標(biāo)品(Heptadecanoic acid)、酵母提取物等。

1.1.3 儀器 TS-211CF往復(fù)回旋式搖床、YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1C雙人單面凈化工作臺(tái)、BS11OS分析天平、DN-12A干式氮吹儀、LGJ-12冷凍干燥機(jī)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫5975C-7890A)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母提取物6 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，121 ℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，酵母提取物11 g/L，NaNO33.4 g/L，KH2PO43.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2M.alpina發(fā)酵培養(yǎng) 無菌挑取少量M.alpina菌絲體，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為20 ℃，175 r/min震蕩培養(yǎng)3 d。然后將培養(yǎng)結(jié)束后的菌絲混勻后按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于6個(gè)不同發(fā)酵溫度(10、15、25、30、35 ℃)下，175 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.3 生物量(DCW)的測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束后收集M.alpina菌絲體，用無菌蒸餾水反復(fù)多次洗滌菌體，經(jīng)真空冷凍干燥并稱重。

生物量=菌體干重/發(fā)酵液體積

1.2.4 脂肪酸的提取及甲酯化 參考顧曉穎等[18-19]的方法，稱取干菌體粉末50 mg，依次加入甲苯、硫酸甲醇、十七烷酸標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻后置于50 ℃水浴過夜。加入5% NaCl水溶液，混勻后加入正己烷萃取2次，合并上清液，加入2% KHCO3水溶液清洗，收集上層清液并用氮?dú)獯蹈?，獲得的脂質(zhì)復(fù)溶于1 mL含0.05% BHT的正己烷溶液中，過濾膜后待測(cè)。

1.2.5 脂肪酸組成測(cè)定及定量分析 通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)甲酯化的脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析。GC-MS具體條件參見顧曉穎等[19]的方法。參照標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)菌體中脂肪酸進(jìn)行定性分析，以C17∶0為參照內(nèi)標(biāo)，根據(jù)峰面積對(duì)各類脂肪酸進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用軟件Excel 2016、Graphpad prism 8.0、SPSS 25.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與作圖。對(duì)6個(gè)不同發(fā)酵溫度下ω-3 PUFAs和ω-6 PUFAs的含量和產(chǎn)量進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，再采用SNK法進(jìn)行均值的兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體生物量的影響

如圖1所示,M.alpina菌體生物量隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。25 ℃時(shí)，M.alpina菌體生物量達(dá)到最高(16.07 g/L)；當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃及以上時(shí)，菌體幾乎不生長；35 ℃時(shí)，菌體生物量僅為0.33 g/L。由此可見，25 ℃最適合M.alpina生長，而30 ℃及以上則會(huì)抑制M.alpina菌體生長。

不同字母表示差異顯著，即P<0.05，下同Different letters in the graph indicate significant differences, P<0.05,the same as below圖1 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體生物量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperatures on biomass of M. alpina

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體中脂肪酸組分的影響

發(fā)酵溫度為10、15、20、25、30和35 ℃時(shí)，M.alpina菌體中的脂肪酸種類分別為11、12、10、10、12和7種。其中，15和30 ℃時(shí)菌體中脂肪酸種類最多，由于35 ℃不利于菌體生長，其脂肪酸種類和含量也隨之急劇減少。參考武迎春[20]對(duì)M.alpinaPUFAs的分類，本研究在所有溫度條件下共檢測(cè)到的ω-3類PUFAs有2種，分別是十八碳三烯酸(α-亞麻酸，ALA)和二十碳五烯酸(EPA)；ω-6類PUFAs有4種，分別是十八碳二烯酸(亞油酸，LA)、十八碳三烯酸(γ-亞麻酸，GLA)、二十碳三烯酸(DGLA)和二十碳四烯酸(花生四烯酸，ARA)(表1)。

表1 不同溫度條件下M. alpina脂肪酸組分及含量

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體中總脂肪酸(TFA)和PUFAs含量的影響

如圖2所示，20 ℃時(shí)TFA含量最高，為62.32 mg/g，15～30 ℃含量無顯著差異；PUFAs含量在15 ℃時(shí)最高，為28.23 mg/g，與其它溫度下的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 不同發(fā)酵溫度條件下M. alpina 菌體中TFA和PUFAs的含量Fig.2 Contents of TFA and PUFAs in M. alpina at different fermentation temperatures

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體中ω-3 PUFAs的影響

2.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體中ω-3 PUFAs含量的影響 就ALA而言，30 ℃時(shí)菌體中ALA含量最高(表2)，為5.39 mg/g；25 ℃時(shí)其含量最低，為0.2 mg/g；20 ℃時(shí)未檢測(cè)到ALA。就EPA而言，15 ℃時(shí)含量最高，為3.79 mg/g；20 ℃時(shí)含量最低，為0.91 mg/g；25、30、35 ℃時(shí)未檢測(cè)到ALA。且15、25、35 ℃條件下ALA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；10和20 ℃條件下EPA含量也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 不同發(fā)酵溫度條件下M. alpina菌體中ω-3 PUFAs含量

圖3 不同發(fā)酵溫度條件下M. alpina 菌體中ω-3 PUFAs的產(chǎn)量Fig.3 The yields of ω-3 PUFAs in M. alpina at different temperatures

2.4.2 發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體中ω-3 PUFAs產(chǎn)量的影響 從圖3可知，10 ℃時(shí)ALA產(chǎn)量最高(33.94 mg/L)，顯著高于15和25 ℃的。15 ℃時(shí)EPA產(chǎn)量最高，為44.10 mg/L，10 ℃和20 ℃時(shí)EPA產(chǎn)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)不再合成EPA。

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體中ω-6 PUFAs的影響

2.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體中ω-6 PUFAs含量的影響 就亞油酸(LA)而言，30 ℃時(shí)其含量最高(表3)，為2.82 mg/g；25 ℃時(shí)含量最低，僅為0.32 mg/g；15和20 ℃時(shí)未檢測(cè)到LA。就GLA而言，15 ℃時(shí)其含量最高，為4.13 mg/g；20 ℃時(shí)含量最低，為1.68 mg/g；10、30、35 ℃時(shí)未檢測(cè)到GLA。就二十碳三烯酸(DGLA)而言，15 ℃時(shí)其含量最高，為3.60 mg/g；35 ℃時(shí)含量最低，為0.16 mg/g。就花生四烯酸(ARA)而言，所有發(fā)酵條件下均能合成ARA，其中15 ℃時(shí)ARA含量最高，為15.84 mg/g；35 ℃時(shí)ARA的含量最低，為0.81 mg/g。表明發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體中ω-6 PUFAs含量具有顯著影響。

表3 不同溫度下M. alpina ω-6 PUFAs含量

2.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體中ω-6 PUFAs產(chǎn)量的影響 如圖4所示，LA在10 ℃條件下產(chǎn)量最高，為15.86 mg/L；GLA產(chǎn)量在25 ℃時(shí)最高，為58.72 mg/L；DGLA產(chǎn)量在15 ℃時(shí)最高，為40.65 mg/L；ARA產(chǎn)量在15 ℃時(shí)最高，為184.41 mg/L，且在各個(gè)溫度條件下，ARA均是ω-6 PUFAs中產(chǎn)量最高的PUFAs。

圖4 不同溫度條件下M. alpina ω-6 PUFAs的產(chǎn)量Fig.4 The yields of ω-6 PUFAs in M. alpina at different temperatures

2.6 發(fā)酵溫度對(duì)M. alpina菌體中ω-3和ω-6 PUFAs合成代謝的影響

如圖5所示，本研究中所有溫度條件下M.alpina菌體中ω-3和ω-6 PUFAs合成代謝同時(shí)進(jìn)行，但15 ℃時(shí)ω-3和ω-6 PUFAs的產(chǎn)量均為最高，分別是51.20和273.13 mg/L；當(dāng)溫度為30 ℃及以上時(shí)，由于菌體幾乎不生長，ω-3和ω-6 PUFAs的合成代謝幾乎都停止。故15 ℃最有利于M.alpina合成ω3/ω6營養(yǎng)平衡膳食油脂。

圖5 不同溫度條件下M. alpina菌體中ω-3和ω-6 PUFAs的產(chǎn)量Fig.5 The yields of ω-3 and ω-6 PUFAs in M. alpina at different temperatures

3 討 論

如何平衡飲食中的膳食油脂是近幾年的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外研究表明，膳食中ω-6與ω-3 PUFAs比值與心血管疾病具有相關(guān)性，通過調(diào)節(jié)含有ω-6與ω-3 PUFAs食物的膳食攝入量來降低該比值具有防治心血管疾病的效果[21-22]。由于可獲取ω-6與ω-3 PUFAs的資源匱乏，目前許多研究以微生物作為生產(chǎn)各類PUFAs的新能源。為提高微生物工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs的可能性和了解更多的合成機(jī)制，對(duì)微生物合成PUFAs的影響因素進(jìn)行研究顯得尤為重要。

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一。在本研究中，25 ℃最適合M.alpina生長，30 ℃及以上則會(huì)抑制M.alpina生長，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)M.alpina菌體中一些重要的酶失去活性[23]。而當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)，M.alpina的生物量也顯著降低，其原因可能是低溫抑制了菌絲的生長。M.alpina合成PUFAs的過程中，10 ℃時(shí)菌體中ω-3和ω-6 PUFAs合成代謝同時(shí)進(jìn)行；10與15 ℃時(shí)ω-3 PUFAs產(chǎn)量無顯著差異，當(dāng)溫度超過20 ℃時(shí)不再合成EPA，僅在20 ℃以下的溫度才能合成EPA，表明參與EPA合成的酶具低溫依賴性的[23]。在ω-6 PUFAs的合成過程中，ARA在各個(gè)溫度下均能合成，且產(chǎn)量相對(duì)較高，Wynn等[24]在培養(yǎng)基中添加含有亞油酸的菜籽油作為底物提高了ARA的產(chǎn)量，因此ARA在各溫度下都能合成，可能是由于在整個(gè)脂肪酸合成過程中有特定的并具有較高活性的酶可使C18類PUFAs脫飽和生成ARA。

本研究結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)ω-3 PUFAs與ω-6 PUFAs的合成均具有較大影響，且在各個(gè)溫度下ω-6 PUFAs的產(chǎn)量均高于ω-3 PUFAs。這可能是由于M.alpina自身ω-3脂肪酸脫飽和酶MAW3偏好C18鏈PUFAs，而對(duì)C20鏈底物的偏好性較差，且在高于20 ℃時(shí)活性太低，不能有效地將積累的ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的ω-3 PUFAs[25-26]。本研究僅考慮了不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體中ω-3/ω-6 PUFAs合成的影響，關(guān)于其影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究中M.alpina在固定發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵培養(yǎng)基成分的條件下，通過改變發(fā)酵溫度，比較分析發(fā)酵溫度對(duì)菌體的生物量、ω-3和ω-6 PUFAs組分及其含量和產(chǎn)量的影響。研究結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)M.alpina菌體代謝合成ω-3、ω-6 PUFAs組分、含量和產(chǎn)量均具有顯著影響，其中15 ℃最利于M.alpina菌體同時(shí)累積ω-3和ω-6 PUFAs。M.alpina代謝積累的ω-3 PUFAs主要是EPA，ω-6 PUFAs主要是ARA，且在M.alpina脂肪酸合成代謝過程中合成ω-6 PUFAs的能力顯著高于合成ω-3 PUFAs的能力。本研究結(jié)果為M.alpina工業(yè)化生產(chǎn)ω-3/ω-6營養(yǎng)平衡膳食油脂奠定了研究基礎(chǔ)。