李 河,郭建偉, 2,盧丙越,孟衡玲,張 薇,王田濤
(1.云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,云南 蒙自 661199; 2.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所山地未來(lái)研究中心,昆明 650201)
【研究意義】馬藍(lán)[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek]為爵床科多年生草本植物,廣泛分布于中國(guó)華東、華南及西南地區(qū);莖、葉可制成中藥材青黛,根莖和根可作為南板藍(lán)根入藥,具有清熱解毒、涼血消斑的功效[1],為云南哈尼族和貴州苗族習(xí)用藥材。靛玉紅和靛藍(lán)是馬藍(lán)的主要活性成分[2],靛玉紅臨床可用于治療慢性粒細(xì)胞白血病,靛藍(lán)既可作染料又具有抗紫外線、抗氧化、抗菌消炎等作用[3]。雖然馬藍(lán)種植區(qū)域廣泛但由于環(huán)境及種植技術(shù)等因素造成產(chǎn)量和藥用成分差異較大且不穩(wěn)定,其在種植中多采為自繁,不利于馬藍(lán)的優(yōu)良品種選育。在選育優(yōu)良作物品種時(shí),可以根據(jù)作物的農(nóng)藝性狀和主要成分等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[4-5]。研究馬藍(lán)農(nóng)藝性狀及其活性成分,對(duì)馬藍(lán)優(yōu)良品種選育及標(biāo)準(zhǔn)化栽培具有重要的指導(dǎo)意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前研究主要集中于馬藍(lán)藥用成分測(cè)定[6-7]、藥用成分比較[8-9]、基因生物學(xué)[10-11]、高效栽培[12-15]等方面,而關(guān)于馬藍(lán)遺傳變異研究報(bào)道少見(jiàn)。黃玉吉等[16]通過(guò)對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地馬藍(lán)進(jìn)行PAPD分析,發(fā)現(xiàn)馬藍(lán)種質(zhì)資源遺傳差異與地理位置無(wú)明顯聯(lián)系,而與形態(tài)特征有明顯聯(lián)系。熊清平等[17]研究表明,野生馬藍(lán)的藥用部位、形態(tài)特征和橫切面組織結(jié)構(gòu)與栽培馬藍(lán)差異明顯,生態(tài)環(huán)境對(duì)馬藍(lán)生理特征、形態(tài)特征、藥用部位、組織結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生較大影響。張武君等[18]、肖春霞等[8]、羅丹冬等[9]和張英嬌等[12]研究表明,生態(tài)環(huán)境和栽培措施對(duì)馬藍(lán)中靛藍(lán)和靛玉紅含量影響顯著。羅君等[19]研究表明,貴州主產(chǎn)區(qū)不同海拔、不同采收期和不同初加工方法馬藍(lán)樣品中靛藍(lán)、靛玉紅的含量存在較大差異。8月采收的馬藍(lán)植株中靛藍(lán)、靛玉紅的含量較高,并隨時(shí)間增加呈下降趨勢(shì);不同初加工方法對(duì)馬藍(lán)藥材中靛藍(lán)、靛玉紅的含量影響較大,以陰干法較好,其次為曬干。侯惠嬋等[20]研究表明,非花果期、花期、果期的馬藍(lán)中靛玉紅、靛藍(lán)的含量依次遞減,未干燥情況下,靛藍(lán)含量下降85%,而靛玉紅含量增加4倍。馬藍(lán)農(nóng)藝性狀和藥用成分有待進(jìn)一步研究?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以不同馬藍(lán)居群為研究對(duì)象,探討其重要農(nóng)藝性狀和主要活性成分的差異及其相互關(guān)系?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)金平縣生產(chǎn)中常見(jiàn)4個(gè)馬藍(lán)居群進(jìn)行品比試驗(yàn),測(cè)定其重要農(nóng)藝性狀和各部位主要活性成分指標(biāo)并進(jìn)行變異系數(shù)、相關(guān)、主成分分析,為馬藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)化栽培和優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)于2018年11月至2019年12月在云南省紅河州金平縣阿得博鄉(xiāng)苦竹箐村進(jìn)行。該地位于103°12′36.67″E,22°56′59.66″N,海拔1480 m,年平均氣溫16.1 ℃,年均降雨量2700 mm,土壤為紅壤土,非常適合馬藍(lán)生長(zhǎng)。
2018年11月底,采集生育期和長(zhǎng)勢(shì)相似的4個(gè)馬藍(lán)居群材料:1號(hào)居群JP1哈尼語(yǔ)音譯為“海稱”,2號(hào)居群JP2哈尼語(yǔ)音譯為“苗淺”,3號(hào)居群JP3哈尼語(yǔ)音譯為“苗活”,4號(hào)居群JP4哈尼語(yǔ)音譯為“苗滿”,剪取20 cm、帶有嫩莖的枝條,作為扦插材料,采集地點(diǎn)為云南省紅河州金平縣沙依坡鄉(xiāng)水源村。
將采集的4個(gè)馬藍(lán)居群材料,剪取長(zhǎng)8~10 cm、帶有2對(duì)剪除半片葉的未成熟嫩莖頂部枝條進(jìn)行無(wú)性扦插育苗。2019年2月中旬,苗長(zhǎng)至6~10 cm 時(shí)進(jìn)行移栽。每個(gè)居群種植3個(gè)小區(qū),每小區(qū)面積8 m×5 m=40 m2,行距35 cm,株距25 cm;施農(nóng)家肥15 000 kg/hm2,磷酸二氫鉀復(fù)合肥450 kg/hm2作為底肥,栽培及田間管理參考張丹雁等[13]進(jìn)行馬藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)化種植。2019年12月進(jìn)行取樣,每個(gè)小區(qū)按照五點(diǎn)取樣法取樣,每小區(qū)選取15株長(zhǎng)勢(shì)均勻的馬藍(lán)植株,分別利用鋼卷尺、游標(biāo)卡尺和電子天平測(cè)定其農(nóng)藝性狀,指標(biāo)包括株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、一級(jí)分枝數(shù)、二級(jí)分枝數(shù)、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、株鮮重、根干重、莖干重、葉干重、株干重14個(gè)農(nóng)藝性狀,其中葉長(zhǎng)、葉寬以平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將各居群馬藍(lán)整株采集并帶回實(shí)驗(yàn)室,放在陰涼干燥的地方風(fēng)干。把風(fēng)干好的植株按不同居群不同部位分離并粉碎過(guò)50目篩,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.1 色譜條件 流動(dòng)相是甲醇-水,其比例為75∶25;檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm;流速為0.10 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣1~8 μL[21]。
1.4.2 配制樣品待測(cè)液 分別取馬藍(lán)葉片0.2 g、莖1 g、根2 g (精確至0.01 mg),并用專用濾紙包好。用長(zhǎng)鑷子把用濾紙包好的小樣包放入60 mL球形索氏提取器中,量取50 mL氯仿加入索氏提取器中,用電爐加熱、回流提取,到溶液顏色呈現(xiàn)無(wú)色為止。把回流得到的溶液直接轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,在40 ℃下蒸干,在25 mL容量瓶中用甲醇-氯仿(80∶20)將干品分次溶解后定容到刻度線。在0.45 μm有機(jī)微孔濾膜中過(guò)濾,濾液則為待測(cè)溶液。用1000 μL移液槍吸取2 mL待測(cè)液于2 mL進(jìn)樣瓶中。
1.4.3 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 (1)考察相關(guān)線性關(guān)系。以精準(zhǔn)電子天平稱取購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司的靛玉紅、靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg,加入10 mL容量瓶,以甲醇-氯仿(80∶20)作為溶劑溶解樣品,在稀釋至刻度后搖晃樣品液至大致混勻,以此作為實(shí)驗(yàn)中的所需母液,用移液槍分別吸取母液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至2 mL進(jìn)樣瓶中,再用1000 μL移液槍分別吸取甲醇溶液1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL加入到對(duì)應(yīng)進(jìn)樣瓶中,搖勻后可得到靛玉紅和靛藍(lán)濃度為100、200、300、400、500 μg/mL。按實(shí)驗(yàn)要求,先后選取1、8 μL為進(jìn)樣量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(μg),峰面積為縱坐標(biāo),根據(jù)所繪曲線可求出靛玉紅、靛藍(lán)含量與峰面積的回歸方程。
(2)色譜儀精密度試驗(yàn)。取靛玉紅、靛藍(lán)母液溶液各2 mL于2 mL進(jìn)樣瓶中(制備及濃度與相關(guān)線性關(guān)系同),分別精密進(jìn)樣1、8 μL,按照色譜條件,連續(xù)5次進(jìn)樣,得出靛玉紅峰面積RSD為0.63%、靛藍(lán)的為0.47%。連續(xù)進(jìn)樣5次,兩者的值均小于1%,說(shuō)明儀器精密度良好。
(3)色譜儀穩(wěn)定性試驗(yàn)。用電子天平稱取4號(hào)馬藍(lán)居群莖粉末1 g (精確至0.01 mg),制備待測(cè)液5份,按試驗(yàn)要求色譜條件,在0、2、4、8、12 h分別精密進(jìn)樣5 μL,得出靛玉紅峰面積RSD為0.34%、靛藍(lán)的為0.39%。得出在12 h內(nèi)待測(cè)樣品溶液穩(wěn)定。
(4)重現(xiàn)性試驗(yàn)。電子天平稱取4號(hào)馬藍(lán)居群莖粉末約1 g (精確至0.01 mg),制備待測(cè)液5份,按色譜條件,分別進(jìn)樣5 μL,得出靛玉紅峰面積RSD為0.56%,而靛藍(lán)的則為0.61%。結(jié)果得出試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。
(5)加樣回收試驗(yàn)。用電子天平稱取1 g (精確至0.01 mg)的4號(hào)馬藍(lán)莖粉末,準(zhǔn)確加入0.18 mg靛玉紅和靛藍(lán)作為對(duì)照,制備5份待測(cè)液,按實(shí)驗(yàn)要求色譜條件,分析、計(jì)算得到靛玉紅和靛藍(lán)平均回收率分別為98.3%和98.1%。此方法測(cè)定馬藍(lán)靛玉紅和靛藍(lán)含量可行。
使用軟件Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì),計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)等。用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和主成分分析等。
由表1可知,馬藍(lán)各居群間農(nóng)藝性狀差異各不相同。株高JP1與JP4差異不顯著,二者均顯著高于JP2和JP3,JP2與JP3差異不顯著。莖粗JP4顯著高于JP3,JP3顯著高于JP1,JP1與JP2差異不顯著。葉長(zhǎng)、葉寬JP4與JP3、JP1差異不顯著,三者均顯著高于JP2。一級(jí)分枝數(shù)JP1、JP2、JP3間差異不顯著,三者均顯著高于JP4。二級(jí)分枝數(shù)JP2顯著高于JP3,二者與JP1、JP4差異均不顯著。根鮮重JP1、JP3差異不顯著,二者均顯著低于JP2。莖鮮重JP2、JP4與JP3差異不顯著,三者均顯著高于JP1。葉鮮重JP1、JP2、JP4間差異不顯著,三者均顯著低于JP3。株鮮重JP2、JP3、JP4差異不顯著,三者均顯著高于JP1。根干重JP1與JP3差異不顯著,二者均顯著低于JP2。莖干重JP2和JP4均顯著高于JP1,與JP3差異不顯著。葉干重JP3顯著高于JP4,JP4顯著高于JP1和JP2,JP1與JP2差異不顯著。株干重JP2和JP4顯著高于JP1,與JP3差異不顯著。各馬藍(lán)居群根、莖、葉干重占株干重比值分別為12.37%~22.26%、52.03%~70.58%、9.16%~35.60%。JP3馬藍(lán)整株含有靛玉紅5582.88 mg,分別比JP1、JP2、JP4高224.60%、78.17%、17.56%;JP3馬藍(lán)整株含有靛藍(lán)34465.50 mg,分別比JP1、JP2、JP4高242.58%、113.38%、1.17%。
由表1可知,根靛玉紅含量JP3顯著高于JP1、JP2,與JP4差異不顯著。莖靛玉紅含量各居群間差異不顯著。葉靛玉紅含量JP2、JP3、JP4差異不顯著,三者均顯著高于JP1。根靛藍(lán)含量JP3顯著高于其它居群,JP1與JP2差異不顯著,二者均顯著高于JP4。莖靛藍(lán)含量JP3與JP4差異不顯著,二者均顯著高于JP1和JP2。葉靛藍(lán)含量JP2、JP3、JP4差異不顯著,三者均顯著高于JP1。靛玉紅含量根、莖、葉比值為1∶(1.99~2.79)∶(10.87~18.01);靛藍(lán)含量根、莖、葉比值為1∶(1.60~5.97)∶(10.51~33.92)。
表1 馬藍(lán)重要農(nóng)藝性狀及主要活性成分含量多重比較
由表2可知,不同居群的農(nóng)藝性狀及主要成分含量存在明顯差異,變異系數(shù)由大到小依次為葉鮮重>莖干重>葉干重>莖鮮重>莖靛藍(lán)>根鮮重>二級(jí)分枝數(shù)>根干重>株鮮重>株干重>一級(jí)分枝數(shù)>根靛藍(lán)>根靛玉紅>葉寬>莖粗>葉長(zhǎng)>株高>葉靛藍(lán)>莖靛玉紅>葉靛玉紅。葉鮮重、莖干重、葉干重、莖鮮重、莖靛藍(lán)、根鮮重、二級(jí)分枝數(shù)、根干重、株鮮重、株干重、一級(jí)分枝數(shù)、根靛藍(lán)、根靛玉紅、葉寬、莖粗的變異系數(shù)較大,均大于30%。葉長(zhǎng)、株高、葉靛藍(lán)、莖靛玉紅、葉靛玉紅的變異系數(shù)較小,均小于25%,屬于較穩(wěn)定的性狀,說(shuō)明這些性狀不易受環(huán)境因子影響,主要由自身遺傳特性決定。
表2 馬藍(lán)主要農(nóng)藝性狀及主要成分含量的變異系數(shù)分析
由表3可知,株高與葉長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān),與一級(jí)分枝數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān);莖粗與莖鮮重、株鮮重、莖干重、株干重呈極顯著正相關(guān),與根干重呈顯著正相關(guān),與一級(jí)分枝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān);葉長(zhǎng)與葉寬呈極顯著正相關(guān),與莖靛藍(lán)呈顯著正相關(guān),與一級(jí)分枝數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān),與二級(jí)分枝數(shù)、根鮮重呈顯著負(fù)相關(guān);葉寬與一級(jí)分枝數(shù)、二級(jí)分枝數(shù)、根鮮重呈顯著負(fù)相關(guān);一級(jí)分枝數(shù)與二級(jí)分枝數(shù)呈顯著正相關(guān);二級(jí)分枝數(shù)與根鮮重、根干重、莖干重、株干重呈顯著正相關(guān);根鮮重與莖鮮重、株鮮重、根干重、莖干重、株干重極呈顯著正相關(guān),與葉靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);莖鮮重與株鮮重、根干重、莖干重、株干重極呈顯著正相關(guān),與葉靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);葉鮮重與株鮮重、葉干重、莖靛玉紅、莖靛藍(lán)呈極顯著正相關(guān),與根靛玉紅呈顯著正相關(guān);株鮮重與根干重、莖干重、株干重呈極顯著正相關(guān),與葉干重、葉靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);根干重與莖干重、株干重、葉靛藍(lán)呈極顯著正相關(guān),與根靛藍(lán)呈顯著負(fù)相關(guān);莖干重與株干重呈極顯著正相關(guān),與葉靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);葉干重與莖靛藍(lán)呈極顯著正相關(guān),與根靛玉紅、莖靛玉紅呈顯著正相關(guān);株干重與葉靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);根靛玉紅與莖靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);莖靛玉紅與莖靛藍(lán)呈顯著正相關(guān);根靛藍(lán)與莖靛藍(lán)呈顯著負(fù)相關(guān)。
表3 馬藍(lán)主要農(nóng)藝性狀及主要成分含量的相關(guān)分析
續(xù)表3 Continued table 3
由表4可知,有4個(gè)主成分對(duì)馬藍(lán)的農(nóng)藝性狀及主要成分含量影響最大,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)88.83%,表明可用4個(gè)主成分對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。第1主成分的特征值為7.884,貢獻(xiàn)率為39.421。決定第1主成分的主要性狀包括莖干重、株干重、莖鮮重、根干重、株鮮重,屬于產(chǎn)量因子1。第2主成分的特征值為6.090,貢獻(xiàn)率為30.450%。決定第2主成分的主要性狀包括葉干重、葉鮮重,屬于產(chǎn)量因子2。第3主成分的特征值為2.449,貢獻(xiàn)率為12.245%。決定第3主成分的主要性狀是一級(jí)分枝數(shù)、根靛藍(lán)、根靛玉紅,屬于生長(zhǎng)與品質(zhì)因子。第4主成分的特征值為1.343,貢獻(xiàn)率為6.717%。決定第4主成分的主要是一級(jí)分枝數(shù),屬于生長(zhǎng)因子。
表4 馬藍(lán)主要農(nóng)藝性狀及主要成分含量的主成分分析
續(xù)表4 Continued table 4
本研究結(jié)果表明,各馬藍(lán)居群根、莖、葉干重占株干重比值分別為12.37%~22.26%、52.03%~70.58%、9.16~35.60%,與侯惠嬋等[20]研究結(jié)果類似。株干重JP4最高達(dá)114.18 g,與JP2、JP3差異不顯著,二者均顯著高于JP1。從產(chǎn)量來(lái)說(shuō),馬藍(lán)居群JP4最優(yōu)。藥用植物優(yōu)良種質(zhì)資源的選育不僅要考慮產(chǎn)量,亦要側(cè)重主要藥用成分含量[17]。本研究馬藍(lán)各部位的靛藍(lán)、靛玉紅含量排序呈葉>莖>根的規(guī)律,與羅丹冬等[9]和林文津[22]研究結(jié)果類似。馬藍(lán)整株靛玉紅含量JP3和JP4分別為5582.88和4748.99 mg,二者比JP1分別高224.60%和176.11%,比JP2分別高78.17%和51.56%;馬藍(lán)整株靛藍(lán)含量 JP3和JP4分別為34465.50和34065.56 mg,二者比JP1分別高242.58%和238.60%,比JP2分別高113.38%和110.91%。因此JP3與JP4馬藍(lán)綜合表現(xiàn)較好,可重點(diǎn)推廣栽培。
在篩選優(yōu)良品種時(shí),變異系數(shù)越大,表明遺傳多樣性越豐富,育種潛力越大[23]。本研究馬藍(lán)14個(gè)重要農(nóng)藝性狀變異范圍為20.41%~61.33%,植株各部位2個(gè)主要活性成分含量的變異范圍為12.01%~56.37%,表明4個(gè)馬藍(lán)居群存在表型差異,具備優(yōu)良種質(zhì)選育的潛力。葉鮮重、莖干重、葉干重等15個(gè)主要性狀的變異系數(shù)較大,均大于30%。因此,選育馬藍(lán)優(yōu)良品種,應(yīng)優(yōu)先考慮莖葉鮮干重大的品種。
利用各性狀的相關(guān)性和主成分排序?qū)τ谶x擇性育種的親本選擇具有積極作用[24]。前人對(duì)續(xù)斷[25]、人參[26]等研究表明,藥用植物農(nóng)藝性狀間存在顯著的相關(guān)性,與化學(xué)有效成分的含量也存在相關(guān)性。本研究葉干重與葉鮮重、莖靛藍(lán)含量呈極顯著正相關(guān),與株鮮重、根靛藍(lán)含量、莖靛藍(lán)含量呈顯著正相關(guān),與梁晴等[25]、沈亮等[26]的研究結(jié)果類似。主成分分析結(jié)果顯示,14個(gè)重要農(nóng)藝性狀和6個(gè)活性成分可歸納為4個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)88.833%,其中PC1載荷較高的指標(biāo)為莖干重、株干重、莖鮮重、根干重、株鮮重,屬于產(chǎn)量因子1;PC2載荷較高的指標(biāo)為葉干重、葉鮮重,屬于產(chǎn)量因子2。表明在影響馬藍(lán)質(zhì)量的性狀中,產(chǎn)量因子對(duì)馬藍(lán)性狀選擇的可靠性要高于其它因子,與曾吳靜等[27]研究結(jié)果相似。該研究通過(guò)對(duì)金平4個(gè)馬藍(lán)居群的農(nóng)藝性狀及主要活性成分進(jìn)行多重比較、相關(guān)性分析和主成分分析,為馬藍(lán)優(yōu)良品種選育提供參考。
4個(gè)馬藍(lán)居群各部位靛玉紅、靛藍(lán)含量排序均為葉>莖>根。莖粗與株鮮、干重呈極顯著正相關(guān),與一級(jí)分枝數(shù)顯著負(fù)相關(guān);二級(jí)分枝數(shù)與株干重顯著正相關(guān);葉靛藍(lán)含量與根干重呈極顯著正相關(guān),與株鮮、干重、呈顯著正相關(guān),與根靛藍(lán)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)主成分分析提出4個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.83%。在選育優(yōu)良馬藍(lán)品種時(shí),要重點(diǎn)考慮莖葉鮮干重大的品種。3號(hào)和4號(hào)馬藍(lán)居群是農(nóng)藝性狀好且靛藍(lán)及靛玉紅含量較高的優(yōu)質(zhì)馬藍(lán)資源,可為馬藍(lán)的優(yōu)良品種選育及種植推廣提供原料。