miR-146a-5p靶向調(diào)控Notch2促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞線粒體損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

武彬，丁雨溪，王靜，夏建平，馬立威，張勁松

（愛爾卓越眼科醫(yī)院眼科，沈陽 110003）

隨著人口老齡化的日益嚴(yán)重，白內(nèi)障的發(fā)生率逐年遞增，已經(jīng)成為影響老年人健康的嚴(yán)重問題［1］。白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，與多種生理進(jìn)程密切相關(guān)，還與周圍環(huán)境暴露和表觀遺傳有關(guān)［1］。微RNA（microRNA，miRNA）對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是一種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。miRNA是短片段的非編碼RNA序列，長(zhǎng)度約為20～22個(gè)堿基序列。研究［2］報(bào)道，晶狀體和白內(nèi)障晶狀體樣本的中央上皮的miRNA表達(dá)譜不同，表明不同表達(dá)的miRNA可能在晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障發(fā)生中發(fā)揮作用。

miR-146a-5p是miR-146家族的成員，miR-146a是最新研究熱點(diǎn)之一，在多個(gè)物種中高度保守，人miR-146a位于5號(hào)染色體LOC285628基因的第2個(gè)外顯子上［3］。miR-146a-5p主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和細(xì)胞發(fā)育［4-6］。胃癌、肺癌和前列腺癌中，miR-146a-5p水平低于癌旁組織。miR-146-5p可以調(diào)控食管鱗狀細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，通過直接與Notch2的3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）靶向結(jié)合，抑制Notch2的表達(dá)，從而發(fā)揮作用［7］。然而，關(guān)于miR-146a-5p在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中作用的研究很少。本研究探討了miR-146a-5p對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞（human lens epithelial cell，HLEC）凋亡的調(diào)控作用，采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)白內(nèi)障患者晶狀體上皮組織中miR-146a-5p的表達(dá)，確定miR-146a-5p為潛在的疾病生物標(biāo)志物；建立體外細(xì)胞模型，通過過表達(dá)miR-146a-5p，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及線粒體相關(guān)蛋白的變化；并進(jìn)一步驗(yàn)證miR-146a-5p對(duì)Notch2 3’-UTR的靶向調(diào)控作用，以及miR-146a-5p對(duì)Notch2下游蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采集2018年12月至2020年10月間我院收治的白內(nèi)障患者的晶狀體上皮樣本，通過完整的連續(xù)環(huán)形撕囊術(shù)獲得晶狀體上皮。所有患者均接受完整的術(shù)前眼科檢查，除年齡相關(guān)性白內(nèi)障外無其他眼部疾病。根據(jù)晶狀體混濁分級(jí)系統(tǒng)Ⅲ的修訂版本，對(duì)白內(nèi)障的類型和嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)和記錄。選擇CN 4～6分、C 4～5分和P 4～5分（C，皮質(zhì)性混濁；N，晶狀體核混濁；P，后囊下性混濁）的15例患者晶狀體為白內(nèi)障組，患者年齡60～70歲，其中男8例，女7例。收集我院眼科眼庫新鮮人眼晶狀體上皮樣本15例為對(duì)照組，患者年齡55～65歲，其中男9例，女6例。本研究通過我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 qRT-PCR

采用qRT-PCR檢測(cè)組織或細(xì)胞中miR-146a-5p的表達(dá)水平。應(yīng)用miRNeasy試劑盒（德國QIAGEN公司）從總RNA中分離miRNA，并應(yīng)用1 μg RNA和Prime Script RT試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參。使用SYBR Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）對(duì)特定產(chǎn)物進(jìn)行3次擴(kuò)增和檢測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性反應(yīng) 15 min，94℃變性反應(yīng) 15 s，55 ℃退火反應(yīng) 30 s，70 ℃延伸反應(yīng)30 s，40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

采用qRT-PCR檢測(cè)NDUFS8、SDHb、COX5b、ATP5a1mRNA的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，TRIzol法提取RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性反應(yīng) 5 s，56 ℃退火反應(yīng)30 s，72 ℃延伸反應(yīng) 30 s，40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各組間mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HLEC細(xì)胞系SRA01/04購自美國ATCC公司。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC（中國上海生工股份有限公司）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后采用qRT-PCR檢測(cè)miR-146a-5p水平。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國eBioscience公司），將轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。按照試劑盒說明書，將轉(zhuǎn)染48 h后的SRA01/04細(xì)胞1 000g離心10 min，用預(yù)冷的PBS清洗，并重新懸浮在250 μL結(jié)合緩沖液中。將細(xì)胞與Annexin V-FITC和PI在室溫下黑暗中孵育15 min，隨后用流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）進(jìn)行分析。采用ImageJ軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blotting檢測(cè)

將消化后的SRA01/04細(xì)胞在放射免疫沉淀法裂解緩沖液中4 ℃裂解30 min。使用線粒體分離試劑盒（美國賽默飛公司）分離線粒體，蛋白定量、蛋白變性后，取30 μg蛋白在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4 ℃下與caspase 9、caspase 12、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、Notch2、Hey1、GAPDH抗體孵育過夜；與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合后，采用ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國GE醫(yī)療公司）檢測(cè)，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5pNC的胞，使用2’，7’-二氯二氫熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA，美國Sigma公司）對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS進(jìn)行定量。細(xì)胞與10.0 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵化30 min。采用熒光電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，拍照后，采用ImageJ軟件計(jì)算ROS水平。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用TargetScan生物信息學(xué)網(wǎng)站（https：//www.targetscan.org/vert_42/）預(yù) 測(cè)miR-146a-5p 靶 點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞。將Notch2mRNA的野生型3’-UTR片段以及含有預(yù)測(cè)miR-146a-5p結(jié)合序列或無預(yù)測(cè)序列的miR-NC結(jié)合序列的構(gòu)建體克隆到psiCHECK2熒光素酶報(bào)告載體中（美國Promega公司），分別為Notch2 3’-UTR WT+miR-146a-5p組 和Notch2 3’-UTR WT+miR-NC組。攜帶Notch2mRNA的3’-UTR突變片段以及結(jié)合序列的miR-NC也被克隆到psiCHECK2熒光素酶報(bào)告載體中，分別為Notch2 3’-UTR MUT+miR-146a-5p組 和Notch2 3’-UTR MUT+miR-NC組。將HEK293T細(xì)胞接種在24孔板中，用FuGENE 6（美國Promega公司）與10 μmol/L miR-146a-5p或miR-NC和2.5 μg psiCHECK2載體共同轉(zhuǎn)染，該載體含有Notch2 3’-UTR的突變或野生預(yù)測(cè)片段。擴(kuò)增子被插入到熒光素酶報(bào)告基因的cDNA下游載體中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（美國Promega公司），自動(dòng)微孔板測(cè)定儀測(cè)量相對(duì)熒光素酶表達(dá)，并計(jì)算活性值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-146a-5p在白內(nèi)障患者晶狀體上皮中表達(dá)上調(diào)

與對(duì)照組相比，白內(nèi)障組miR-146a-5p表達(dá)明顯上調(diào)（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)白內(nèi)障組和對(duì)照組晶狀體上皮中miR-146a-5p的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-146a-5p in lens epithelial samples of cataract patients and control subjects detected by qRT-PCR

2.2 miR-146a-5p促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞的凋亡

qRT-PCR結(jié)果（圖2A）顯示，miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞后，miR-145a-5p處于過表達(dá)狀態(tài)。Annexin V和PI雙染色結(jié)果（圖2B）顯示，miR-146a-5p過表達(dá)增加了SRA01/04細(xì)胞的早期和晚期凋亡水平。檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中caspase 9和caspase 12表達(dá)的變化，結(jié)果（圖2C）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細(xì)胞中caspase 9表達(dá)水平顯著增高（P＜ 0.05），但caspase 12表達(dá)變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。上述結(jié)果表明，線粒體功能紊亂是miR-146a-5p調(diào)控的第一步，通過caspase 9的激活引發(fā)miR-146a-5p誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖2 miR-146a-5p模擬物促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞凋亡Fig.2 miR-146a-5p mimics promotes apoptosis in lens epithelial SRA01/04 cells

2.3 miR-146a-5p通過誘導(dǎo)線粒體功能紊亂促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞凋亡

miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞后，MMP-2和MMP-9表達(dá)均下調(diào)（圖3A），表明miR-146a-5p mimics引發(fā)MMP蛋白破壞。進(jìn)一步分離各組細(xì)胞中的線粒體和細(xì)胞質(zhì)，Western blotting結(jié)果（圖3B）顯示，miR-146a-5p過表達(dá)導(dǎo)致Cyt c從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。miR-146a-5p NC或miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞48 h后，qRT-PCR結(jié)果（圖3C）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細(xì)胞中NDUFS8、COX5b和ATP5a1mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），表明線粒體電子運(yùn)輸鏈被增強(qiáng)的miR-146a-5p表達(dá)阻斷。同時(shí)免疫熒光結(jié)果（圖3D）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細(xì)胞中ROS水平下降。結(jié)果證實(shí)，miR-146a-5p過表達(dá)可能促進(jìn)HLEC中ROS的釋放，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 miR-146a-5p通過誘導(dǎo)線粒體功能紊亂促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞凋亡Fig.3 miR-146a-5p promotes the apoptosis of SRA01/04 cells by inducing mitochondrial dysfunction

2.4 Notch2是miR-146a-5p的功能靶點(diǎn)

TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析結(jié)果（圖 4A）顯示，Notch2 3’-UTR 中部分核苷酸序列能與 miR-146a-5p特異性互補(bǔ)配對(duì)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（圖4B）發(fā)現(xiàn)，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組Notch2 3’-UTR WT載體的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P＜ 0.05），而Notch2 3’-UTR MUT 熒光素酶相對(duì)活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），結(jié)果表明，miR-146a-5p NC不影響突變體構(gòu)建中的熒光素酶活性。Western blotting結(jié)果（圖4C）證實(shí)，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組Notch2的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜ 0.05）。

圖4 miR -146a-5p靶向結(jié)合Notch2的3’-UTR并下調(diào)Notch2的表達(dá)Fig.4 miR-146a-5p specifically targets the 3’-UTR of Notch2 and reduces its expression

2.5 miR-146a-5p對(duì)Notch2信號(hào)通路下游蛋白的影響

與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組SRA01/04細(xì)胞中Hey1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting檢測(cè)Hey1蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression of Hey1 protein detected by Western blotting

3 討論

白內(nèi)障是致盲的主要原因之一，與衰老過程密切相關(guān)。近期有研究報(bào)道，miR-146a-5p過表達(dá)能夠激活前列腺癌［4］和非小細(xì)胞肺癌［3］細(xì)胞凋亡，并引發(fā)細(xì)胞周期阻滯。同時(shí)，miR-146a-5p通過靶向調(diào)控Notch2的水平，影響心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷［8］。此外，miR-146a在多種細(xì)胞和組織中調(diào)控慢性炎癥反應(yīng)［9］，而慢性炎癥可誘發(fā)機(jī)體的氧化損傷、DNA損傷和干細(xì)胞衰老，這些均與加速衰老密切相關(guān)［10］?；谏鲜鲅芯繄?bào)道，本研究通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，miR-146a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮中表達(dá)上調(diào)。

大量研究［11］證實(shí)，多種因素與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，包括糖尿病、紫外線過量照射、不良藥物使用和其他眼部疾病等。上述疾病因素中，氧化應(yīng)激和由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS被認(rèn)為是白內(nèi)障的主要易感因素。LI等［12］的研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是哺乳動(dòng)物非先天性白內(nèi)障發(fā)生的特性表型。因此，本研究檢測(cè)miR-146a-5p過表達(dá)的HLEC中的凋亡生物標(biāo)志物和細(xì)胞功能，結(jié)果表明，miR-146a-5p通過線粒體功能障礙激活HLEC凋亡，包括阻斷電子傳遞、形成ROS，進(jìn)一步將Cyt c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并觸發(fā)caspase 9激活。

為了鑒定miR-146a-5p的靶基因，本研究采用TargetScan靶預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)Notch2是miR-146a-5p的靶基因，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-146a-5p與Notch2的3’-UTR特異性結(jié)合，同時(shí)Western blotting結(jié)果證實(shí)miR-146a-5p與Notch2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。1991年和1997年，WEINMASTER等［13］證實(shí)Notch受體分別在果蠅和發(fā)育中的大鼠眼睛中表達(dá)。對(duì)出生后大鼠晶狀體上皮細(xì)胞分化進(jìn)行的體外研究結(jié)果表明，在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子依賴的次級(jí)纖維細(xì)胞分化過程中，Notch2信號(hào)被激活，但未檢測(cè)到相應(yīng)的Notch1激活。Notch2條件突變小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的小眼畸形、纖維細(xì)胞形態(tài)破壞和白內(nèi)障表型［14］。由此可見，Notch2突變和表達(dá)下調(diào)是白內(nèi)障產(chǎn)生的主要原因之一。Hey1是Notch信號(hào)通路下游重要的調(diào)控蛋白，與胚胎血管形成有關(guān)［15］。本研究除發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p抑制Notch2表達(dá)外，還發(fā)現(xiàn)Notch2下游的重要調(diào)控蛋白Hey1明顯下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)miR-146a-5p對(duì)Notch2信號(hào)通路的抑制作用。

綜上所述，miR-146a-5p在白內(nèi)障患者晶狀體上皮組織中表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)能夠促進(jìn)HLEC凋亡，其作用機(jī)制與影響線粒體穩(wěn)態(tài)和下調(diào)Notch2信號(hào)通路密切相關(guān)。