朱梓維,白宇新,李云霞,孫冶,劉光焱,楊彪*
(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生,遼寧 沈陽 110034;2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室;3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科)
中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,我國2018年有393萬人被確診患有癌癥,其中死亡率前五位的癌癥分別為肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌和乳腺癌[1]。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)[2-3]。因此,探索結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找特異性的早期診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高患者健康,提升患者生活質(zhì)量具有重要意義。
結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程,在此過程中腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中各種成分之間的相互作用起重要作用。缺氧微環(huán)境是腫瘤生長所必需的,這個(gè)過程中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α與VEGF表達(dá)呈正相關(guān),而且在結(jié)直腸癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。在低氧條件下,癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞通過HIF-1α和轉(zhuǎn)化生長因子β的協(xié)同作用,可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌化療耐藥[5]。
腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,是當(dāng)前臨床治療所面臨的最主要問題之一。本研究通過沉默轉(zhuǎn)錄應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá),轉(zhuǎn)錄組分析差異表達(dá)基因,預(yù)測(cè)可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制,為全面了解和應(yīng)對(duì)癌癥的耐藥提供線索。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480購置于中國科學(xué)院,RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS,1%青霉素和鏈霉素)5 ml,吹勻后轉(zhuǎn)入25 cm2螺口培養(yǎng)瓶,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。
1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞計(jì)數(shù),1×106/孔,接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(康寧公司),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)所用的siRNA-HIF1α引物從上海吉瑪公司購得。RNA Oligo序列如下:siRNA-HIF1α-830:上游引物:5′-GGAAAUGAGAGAAAUGCUU TT-3′;下游引物:5′-AAGCAUUUCUCUCAUUUC CTT-3′。siRNA-HIF1α-934:上游引物:5′-GGAA AUGAGAGAAAUGCUUTT-3′;下游引物:5′-AAGC AUUUCUCUCAUUUCCTT-3′。siRNA-HIF1α-1067:上游引物:5′-GCUGAUUUGUGAACCCAUUTT-3′;下游引物:5′-AAUGGGUUCACAAAUCAGCTT-3′。陰性對(duì)照:上游引物:5′-UUCUCCGAACGUGUCAC GUTT-3′;下游引物:5′-ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3′。siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟如下:(1)將GPtransfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑5μl與195μl的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中,靜置5 min。(2)將10μl siRNA與190μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中,靜置5 min。(3)將上述(1)步驟混勻靜置的轉(zhuǎn)染試劑和(2)步驟混勻靜置的siRNA再次混勻,靜置20 min。(4)將6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞更換RPMI 1640無血清培養(yǎng)基1.8 ml。(5)將各組的孵育試劑加入到更換無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)6 h,更換完全培養(yǎng)基。(6)48 h后提取總RNA。
1.3 總RNA提取,電泳質(zhì)檢,逆轉(zhuǎn)錄cDNA及Real-time PCR(qPCR)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染siRNA結(jié)果。
1.3.1 Trizol法提取總RNA 采用Trizol Reagent試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取細(xì)胞總RNA。(1)消化收集約有100μl體積的SW480細(xì)胞株,加入1ml Trizol反復(fù)吹勻,室溫靜置5 min;(2)加五分之一體積氯仿進(jìn)行分離,混勻15 s,室溫5 min。4℃,12 000×g離心15 min;(3)轉(zhuǎn)水相到EP管,加入等體積異丙醇,混勻10 min,進(jìn)行RNA沉淀。4℃,12 000×g離心10 min;(4)棄上清,加1 ml冰預(yù)冷75%乙醇(DEPC水配制)。4℃,7 500×g,5 min(2次)。棄上清,室溫干燥5~10 min;(5)DEPC水50μl在55~60℃水中溶解RNA。
1.3.2 RNA質(zhì)量鑒定(1)2%瓊脂糖凝膠配制:稱取瓊脂粉1 g,倒入錐形瓶中,加50 ml 1×TAE電泳緩沖液,搖勻后微波爐加熱1 min取出放涼至約50℃,加入2.5μl核酸染料,充分混勻,倒入電泳槽中,膠完全凝固后備用。(2)將凝膠放入電泳槽中,加入足量1×TAE電泳緩沖液,沒過凝膠,取一定量RNA與10×Loading buffer按10∶1比例混勻后加入凝膠孔。(3)電壓80 V,電泳約15 min,于凝膠成像儀紫外光下成像,觀察條帶邊緣情況、28S和18S條帶亮度以及有無DNA污染。
1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 將提取的2μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。應(yīng)用GoScript Reverse Transcription System試劑盒(Promega),獲得cDNA。
1.3.4 qPCR驗(yàn)證siRNA-HIF1α轉(zhuǎn)染結(jié)果 通過ABI 7500 real time PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)驗(yàn)證測(cè)序得到的篩選基因。qPCR引物序列如下:HIF1α,上游引物:5′-CCACAGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游引物:5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′;GAPDH,上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引 物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。通過ΔΔCT法進(jìn)行樣品間相對(duì)量的比較。
1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征改變。
1.5 RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序由華大基因公司完成。DNBSEQ平臺(tái)一共測(cè)了6個(gè)樣品(siRNA干擾實(shí)驗(yàn)組3個(gè)樣品重復(fù),對(duì)照組3個(gè)樣品重復(fù))。測(cè)序文庫構(gòu)建、簇生成、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析。依據(jù)結(jié)果對(duì)siRNA-HIF1α-934干擾的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株的差異表達(dá)基因的GO(Gene ontology)聚類、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等Pathway分析,獲得篩選基因。
1.6 qPCR驗(yàn)證篩選基因 在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)RNA-Seq結(jié)果的Pathway分析及篩選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過ABI 7500 real time PCR擴(kuò)增儀檢測(cè),驗(yàn)證測(cè)序得到的篩選基因,6個(gè)上調(diào)基因(H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6)和3個(gè)下調(diào)基因(OR2A4、CSNK2A3和MIOX)。引物序列見表1。
表1 qPCR的引物序列
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,CA,USA)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)報(bào)告為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用2組的非配對(duì)雙尾Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 qPCR驗(yàn)證siRNA-HIF1α的敲除結(jié)果 將siRNA-HIF1α-830、siRNA-HIF1α-934、siRNAHIF1α-1067分別轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480,提取siRNA-HIF1α和對(duì)照組細(xì)胞株的4種細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過qPCR驗(yàn)證3種siRNAHIF1α的敲除結(jié)果。通過分析HIF1α的基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)siRNA-HIF1α-934敲除效果最為顯著,即mRNA的表達(dá)水平下調(diào)1倍以上,見圖1。
圖1 qPCR檢測(cè)3種siRNA-HIF1α的敲除結(jié)果
2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài) 與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照引物相比較,轉(zhuǎn)染siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞,其形態(tài)與對(duì)照組基本無太大的變化,但是通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞的偽足較對(duì)照組有所減少,但細(xì)胞的體積無顯著改變,見圖2。
圖2 siRNA-HIF1α轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的形態(tài)觀察(100×)
2.3 RNA-Seq結(jié)果
2.3.1 差異表達(dá)基因分析 通過對(duì)6個(gè)樣品(siRNA干擾實(shí)驗(yàn)組3個(gè)樣品重復(fù),對(duì)照組3個(gè)樣品重復(fù))RNA-Seq結(jié)果分析,每個(gè)樣品平均產(chǎn)出7.25 G數(shù)據(jù),一共檢測(cè)到17 230個(gè)基因。如圖3,得到了差異表達(dá)基因共計(jì)3 900個(gè),其中上調(diào)表達(dá)1 292個(gè),下調(diào)表達(dá)1 608個(gè)。為了驗(yàn)證差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)水平,從RNA-Seq的結(jié)果中隨機(jī)選擇9個(gè)顯著差異基因進(jìn)行qPCR檢測(cè),包括6個(gè)上調(diào)基因(H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6)和3個(gè)下調(diào)基因(OR2A4、CSNK2A3和MIOX)。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RNA-Seq的分析結(jié)果,且趨勢(shì)與高通量測(cè)序數(shù)據(jù)一致,見表2。
圖3 RNA-Seq分析的差異表達(dá)基因火山圖
表2 siRNA-HIF1α-934干擾SW480細(xì)胞后的差異基因表達(dá)情況
2.3.2 差異基因表達(dá)富集分析 通過Pathway分析表明,20種通路受這些差異表達(dá)基因的調(diào)控影響,主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)信號(hào)通路等通路(圖4A)。差異表達(dá)基因的功能如圖4B所示,這些差異基因的轉(zhuǎn)錄物最常見的功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞質(zhì)、黏附作用、核糖體、細(xì)胞骨架和線粒體基質(zhì)等。
圖4 差異基因表達(dá)富集分析圖
結(jié)直腸癌在全球最常見癌癥中排名第三,每年報(bào)告的新病例超過100萬,約有600 000例患者死于該?。?]?;颊吣退幮缘漠a(chǎn)生仍然是結(jié)直腸癌患者生存率低的重要原因。由于耐藥的發(fā)生及多重耐藥的出現(xiàn),經(jīng)常導(dǎo)致化療的失敗,從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響人民群眾的健康。腫瘤耐藥機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程,其影響因素較多,主要包括個(gè)體遺傳差異、腫瘤微環(huán)境、腫瘤干細(xì)胞、藥物失活、藥物吸收減少、抗腫瘤藥物代謝改變等。惡性腫瘤的重要特征就是缺氧微環(huán)境,在缺氧環(huán)境下HIF-1α起到了重要的作用,與腫瘤的生長情況以及侵襲能力密切相關(guān)。因此,HIF-1α在結(jié)直腸癌中參與了多種與腫瘤相關(guān)的途徑的調(diào)節(jié),促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲遷移過程,導(dǎo)致了患者的不良預(yù)后[7]。
缺氧微環(huán)境是惡性腫瘤的重要特征,實(shí)體瘤中的腫瘤細(xì)胞會(huì)表達(dá)HIF-1轉(zhuǎn)錄因子,而HIF-1在缺氧環(huán)境下起到了重要的作用,與腫瘤的生長以及侵襲能力密切相關(guān)。研究證明,腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與多種機(jī)制有關(guān),包括血管生成、糖酵解、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞存活等,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的低氧環(huán)境促進(jìn)了這些環(huán)節(jié)的發(fā)展[8-10]。本研究中,我們使用siRNA技術(shù)獲得了HIF1α低表達(dá)的細(xì)胞株,以期研究腫瘤細(xì)胞在引發(fā)HIF-1α這類治療藥物耐藥后,腫瘤發(fā)展的調(diào)控通路改變情況,解析其可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞的偽足明顯減少,同時(shí)腫瘤細(xì)胞在面對(duì)HIF1α低表達(dá)調(diào)整了其部分的調(diào)控通路,如上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白通路、激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路等通路基因的表達(dá)。所以,通過本研究了解和應(yīng)對(duì)癌癥的耐藥,能夠有效提高患者健康、提升患者生活質(zhì)量,對(duì)于癌癥患者和所屬家庭來說意義重大。
低表達(dá)HIF1α后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路調(diào)控活性增強(qiáng)。細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾后,參與細(xì)胞功能和命運(yùn)的調(diào)控過程。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無法完成功能蛋白的修飾時(shí),細(xì)胞就會(huì)受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。引發(fā)范圍廣泛的細(xì)胞紊亂,破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)修飾的效率,并導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累,從而觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的同時(shí),UPR最初發(fā)出適應(yīng)性輸出,減少負(fù)荷并增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌途徑的能力,以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。面對(duì)更為強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,UPR會(huì)發(fā)出促炎和死亡信號(hào),導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。腫瘤塊內(nèi)的惡劣微環(huán)境條件,如營養(yǎng)缺乏、氧限制、高代謝需求和氧化應(yīng)激,會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力,這些條件可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白的積累從而引發(fā)“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”的狀態(tài)[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器的持續(xù)激活賦予惡性細(xì)胞更大的致瘤性、轉(zhuǎn)移性和耐藥性。研究中我們發(fā)現(xiàn),siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞的KEGG分析,分值最高就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白通路的改變。說明當(dāng)SW480細(xì)胞面對(duì)低HIF1α表達(dá)的情況,將啟動(dòng)新一輪的蛋白修飾程序,通過加強(qiáng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)控,編輯新的修飾蛋白,從而在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)新的微環(huán)境的適應(yīng)。
低表達(dá)HIF1α后,肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路發(fā)生顯著的改變。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌癥進(jìn)展過程中重要的細(xì)胞程序。肌動(dòng)蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架介導(dǎo)了細(xì)胞形狀和極性所必需的結(jié)構(gòu)框架等生物學(xué)功能。研究表明,肌動(dòng)蛋白重塑是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中EMT的加速劑[14]。當(dāng)敲低HIF1α表達(dá)使得肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重塑,說明抑制HIF1α表達(dá)可以增加肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)力調(diào)控的異常,同時(shí)腫瘤細(xì)胞通過相應(yīng)轉(zhuǎn)錄通路調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,導(dǎo)致了惡性腫瘤的遷移能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)移的早期步驟涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和微環(huán)境的協(xié)調(diào),通過細(xì)胞形態(tài)的變化,以允許細(xì)胞從原發(fā)部位分離。黏著斑在細(xì)胞成熟過程中通過黏附作用及改變分子組合來產(chǎn)生牽引并轉(zhuǎn)換信號(hào)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞遷移,細(xì)胞的黏附能力下降是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一[15]。實(shí)驗(yàn)中,我們敲低了HIF1α表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)該組細(xì)胞的定植能力減弱,即細(xì)胞間彼此交流的偽足開始減少,說明細(xì)胞已經(jīng)開啟了一種新的遷移模式。惡性腫瘤細(xì)胞利用這種低的遷移阻力侵入鄰近組織和血管系統(tǒng),并最終轉(zhuǎn)移。
低表達(dá)HIF1α后,F(xiàn)oxO信號(hào)通路活性上調(diào)。Fox蛋白家族是一大類在化療耐藥和EMT中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子可大量激活,能夠控制多種特定的基因表達(dá)程序。FoxO可通過磷酸化、乙?;⒎核鼗图谆榷喾N修飾方式,同時(shí)參與PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的作用,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、EMT及能量代謝等多種生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)FOXC1和FOXQ1通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵EMT相關(guān)分子促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移[16-17]。FOXD1在包括胃癌在內(nèi)的幾種實(shí)體瘤中被發(fā)現(xiàn)失調(diào),并抑制NF-κB活化,特別是p65亞單位的活化。據(jù)報(bào)道,F(xiàn)OXM1可調(diào)節(jié)卵巢癌的EMT、細(xì)胞干性和化療耐藥性[18]。FOXL2是FOX蛋白家族的另一成員,F(xiàn)OXL2在對(duì)常規(guī)化療耐藥的進(jìn)行性和復(fù)發(fā)性顆粒細(xì)胞腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)[19-20]。本研究沉默轉(zhuǎn)錄應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá),發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞開啟了FOX的調(diào)控,通過激活FOX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號(hào)通路,使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖和轉(zhuǎn)移,從而發(fā)展成為新一輪的耐藥細(xì)胞株。所以,在腫瘤藥物的研發(fā)過程中應(yīng)加入伴侶藥物的協(xié)同作用的研究,預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物耐藥株的出現(xiàn),同時(shí)加入另外一種協(xié)同成分,以期更好地抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,其仍然是當(dāng)前臨床治療所面臨的最主要問題之一。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),沉默轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá),可通過激活FoxO轉(zhuǎn)錄因子等信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖和轉(zhuǎn)移。我們接下來將針對(duì)HIF-1α這類治療藥物進(jìn)行腫瘤耐藥性分析,解釋其可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制,以全面了解和應(yīng)對(duì)癌癥的耐藥,此途徑將有效提高患者健康、提升患者生活質(zhì)量,是新的治療選擇和生存希望,具有廣泛而深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。
沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2022年6期