溶磷內(nèi)生菌的篩選鑒定及其對(duì)薏苡生長(zhǎng)發(fā)育的影響

普鳳雅，谷書杰，何永宏，陳崧林，楊志清,3,4*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201）

0 引言

【研究意義】薏苡(Coix lacryma- jobiL.)屬于禾本科(Gramineae)，玉蜀黍族(Maydeae)薏苡屬 (CoixL.)植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用作物[1]。薏苡長(zhǎng)期以傳統(tǒng)的種植方式栽培，管理較為粗放，化肥農(nóng)藥投入量大，土壤環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致磷素利用率嚴(yán)重下降，不符合綠色生產(chǎn)[2]。微生物對(duì)土壤磷的轉(zhuǎn)化和有效性影響很大[3]，解磷微生物能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，提高磷元素利用率，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】20世紀(jì)50年代我國(guó)逐漸對(duì)解磷菌的應(yīng)用開始進(jìn)行研究，先后從東北黑土和灰化土中篩選出解磷能力較強(qiáng)的芽孢桿菌、極毛桿菌等[6]。近年來，通過篩選具有解磷功能的菌株來提高作物栽培過程中磷元素的利用率，促進(jìn)作物生長(zhǎng)已成為目前研究的熱點(diǎn)。陸藍(lán)翔等[7]從樟樹組織中分離篩選到4株菌具有解無(wú)機(jī)磷能力，2株菌具有解有機(jī)磷能力；盧志紅等[8]研究表明內(nèi)生細(xì)菌SRW具有較強(qiáng)的增磷能力，能夠促進(jìn)鴨跖草生長(zhǎng)發(fā)育；蔡紅丹等[9]研究表明解磷菌P2的使用能夠提高水稻種子的萌發(fā)，促進(jìn)根系生長(zhǎng)。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)薏苡內(nèi)生菌的研究鮮見報(bào)道，尤其是薏苡溶磷內(nèi)生細(xì)菌。因此，有必要篩選薏苡溶磷內(nèi)生菌并探究?jī)?nèi)生菌對(duì)薏苡生長(zhǎng)的影響，以便深入了解薏苡生長(zhǎng)發(fā)育過程中內(nèi)生菌的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分離文薏2號(hào)根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌，篩選薏苡溶磷內(nèi)生菌，并分別以植酸鈣和Ca3(PO4)2作為唯一有機(jī)磷源和無(wú)機(jī)磷源，初步探究其溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷能力，通過盆栽試驗(yàn)探究溶磷內(nèi)生菌對(duì)薏苡的促生長(zhǎng)作用，為薏苡溶磷內(nèi)生菌的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

文薏2號(hào)（2015年通過國(guó)家小宗糧豆作物品種鑒定委員會(huì)鑒定[10]）由云南省文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。2020年7月，盆栽試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山標(biāo)本園大棚內(nèi)進(jìn)行，播種25 d后，進(jìn)行內(nèi)生菌分離。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0；固體培養(yǎng)基在液體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g·L-1瓊脂粉。

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：10 g·L-1葡萄糖，5 g·L-1Ca3(PO4)2，0.1 g·L-1(NH4)2SO4，5 g·L-1MgCl2?6H2O，0.25 g·L-1MgSO4?7H2O，0.2 g·L-1KCl ，蒸餾水 1 000 mL，pH值為7.0～7.5，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 15.0～18.0 g·L-1瓊脂粉。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：10 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1NaCl，0.03 g·L-1FeSO4， 0.03 g·L-1MnSO4?H2O， 0.5 g·L-1(NH4)2SO4， 0.3 g·L-1KCl， 0.3 g·L-1MgSO4?7H2O，2 g·L-1植酸鈣，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15～18 g·L-1瓊脂粉。

1.3 薏苡內(nèi)生細(xì)菌分離和純化

內(nèi)生菌的分離純化參考Cardoso等[11]的方法略有修改。播種25 d后，從薏苡植株上剪取健康的根、莖及葉組織各1 g，隨后使用自來水沖洗3 min去除表面多余的雜質(zhì)，濾紙吸干表面水分。然后用75 %乙醇浸泡2 min；再用1 %次氯酸鈉消毒根組織5 min，莖、葉組織3 min；最后用無(wú)菌水漂洗6次，除去殘留消毒劑并用無(wú)菌濾紙將其吸干。將消毒好的植物組織樣品放入無(wú)菌研缽中并向其內(nèi)加入9 mL無(wú)菌水，研磨至呈勻漿狀，靜置5 min，取上清液稀釋10-2倍，涂布在LB平板上，置于35 ℃下培養(yǎng)2 d。挑取長(zhǎng)出的菌株進(jìn)行純化，直至板上菌落顏色和形態(tài)基本一致，純化的菌株用40 %甘油保存至-20 ℃冰箱備用。同時(shí)吸取最后一次漂洗的無(wú)菌水100 μL涂布于LB平板，同等條件下培養(yǎng)，檢驗(yàn)表面消毒是否徹底。

1.4 溶磷內(nèi)生細(xì)菌的篩選

定性測(cè)定：從冰箱中取出保存的內(nèi)生細(xì)菌，室溫下讓其呈熔融狀態(tài)。在超凈臺(tái)上用接種環(huán)蘸取少許菌液，參照郭藝鵬等[12]的方法分別點(diǎn)接于有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷固體平板上，每個(gè)菌株重復(fù)3次。30 ℃培養(yǎng)5 d，觀察有無(wú)溶磷圈生成，測(cè)定溶磷圈直徑（D）、菌落直徑（d）。根據(jù)可溶性指數(shù)（D/d）大小初步確定菌株的溶磷能力。定量測(cè)定：采用鉬銻抗比色法[13]測(cè)定其磷含量。

1.5 溶磷菌分泌磷酸酶活性測(cè)定

磷酸酶活性測(cè)定參照趙為容等[14]的方法。分別將菌株R24、L21接種于100 mL有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，于 30 °C，160 r·min-1震蕩培養(yǎng)，以相應(yīng)的不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，每隔24 h取1 mL進(jìn)行磷酸酶活性測(cè)定。

1.6 溶磷細(xì)菌對(duì)薏苡生長(zhǎng)發(fā)育的影響

菌懸液制備：將菌體于35 ℃下培養(yǎng)28 h，然后8 000 r·min-1離心收集菌體，無(wú)菌水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107cfu·mL-1用于后續(xù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置4個(gè)處理，分別為 T1、T2、T3、T4（CK），每個(gè)處理 5次重復(fù)，共20盆。T1：澆L21重懸菌液；T2：澆R24重懸菌液；T3：澆R24和L21等比例混合重懸菌液；T4：澆無(wú)菌水（CK）。

挑選籽粒外觀飽滿無(wú)病蟲危害的健康薏苡種子，表面消毒處理后播種于育苗盤內(nèi)，10 d后選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的苗移栽至高17 cm、外口徑25 cm的花盆里。采用灌根法，每盆灌入400 mL上述菌懸液，置于溫室大棚中培養(yǎng)，對(duì)照用無(wú)菌水。在薏苡的生長(zhǎng)過程中，于灌根菌液后，每隔15 d測(cè)量薏苡株高、莖粗、葉面積、分蘗數(shù)、葉片數(shù)，并用葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉綠素含量。

1.7 菌株生理生化測(cè)定和16S rDNA序列分析

將篩選獲得的菌株劃線接種在LB固體培養(yǎng)基上，35 °C 培養(yǎng)24 h后，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化測(cè)定。用生工生物工程（上海）有限公司研制的試劑盒提取細(xì)菌DNA，采用通用引物27 F（5′-3′：AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492 R（5′-3′：GG TTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，獲得菌株的16S rDNA序列。將所測(cè)序列在GenBank中進(jìn)行blast同源性搜索，然后將菌相似性較高的序列用MAGE-X軟件中的鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

采用 Excel 2010 和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄、整理、統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株降解有機(jī)磷能力測(cè)定

2.1.1 定性測(cè)定 將菌株點(diǎn)接于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，觀察有無(wú)透明圈，結(jié)果如表1所示，在固體平板上，菌株R24的溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比最大，為（2.15 ± 0.13），顯著大于其余菌株（P＜0.05）。

表1 菌株降解有機(jī)磷能力的比較Table 1 Organic phosphate degrading ability of strains

2.1.2 定量測(cè)定 菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，測(cè)定上清液可溶性磷的含量，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)不同菌株間存在顯著差異（P＜0.05）。其中，R24菌株可溶性磷含量最大，為37.20 mg·L-1，顯著大于除R29以外的其他供試菌株（P＜0.05），分離自根部的R29菌株可溶性磷含量次之，為30.03 mg·L-1。

2.2 不同菌株降解無(wú)機(jī)磷能力的測(cè)定

2.2.1 定性測(cè)定 將菌株點(diǎn)接至無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后觀察有無(wú)透明圈。各供試菌株的溶無(wú)機(jī)磷能力存在一定差異，分離自葉片的L21菌株的溶磷圈最大，溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比為（2.01 ± 0.25），顯著大于其余菌株（P＜0.05）（表2）。

表2 菌株降解無(wú)機(jī)磷的能力比較Table 2 Inorganic phosphate degrading ability of strains

2.2.2 定量測(cè)定 菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，測(cè)定上清液可溶性磷含量。測(cè)定結(jié)果如圖2所示。L21菌株可溶性磷含量最大，為62.93 mg·L-1，顯著大于其余供試菌株（P＜0.05），分離自根部的R5菌株可溶性磷含量最小，為1.99 mg·L-1。

2.3 在有機(jī)磷培養(yǎng)基中溶磷菌株分泌磷酸酶的動(dòng)態(tài)變化

在有機(jī)磷培養(yǎng)基中，2株解磷細(xì)菌培養(yǎng)6 d后，發(fā)酵液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性分別如圖3-a、b所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株分泌磷酸酶活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)4 d后，菌株R24的酸性磷酸酶活性達(dá)到最大值；培養(yǎng)5 d后，菌株L21的酸性磷酸酶活性達(dá)到最大值。兩菌株相比，R24分泌酸性磷酸酶活性的峰值比L21高出10.37%。R24和L21分泌堿性磷酸酶的能力均在培養(yǎng)第5天時(shí)達(dá)到最大值，其中R24比L21高出72.58%。測(cè)定發(fā)酵液每天的pH值發(fā)現(xiàn)，兩菌株培養(yǎng)后，其發(fā)酵液的pH值均低于空白處理，R24的pH低于L21（圖3-c）。說明在有機(jī)磷培養(yǎng)基中，菌株R24分泌酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均高于L21，有利于其分解難溶性有機(jī)磷，此結(jié)果與2.1中該菌株溶解有機(jī)磷能力最高一致。

2.4 在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中溶磷菌株分泌磷酸酶的動(dòng)態(tài)變化

在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，2株解磷菌培養(yǎng)6 d后，發(fā)酵液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性如圖4-a、b所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株分泌磷酸酶活性呈現(xiàn)的趨勢(shì)為先上升后下降。R24分泌酸性磷酸酶活性在培養(yǎng)第4天時(shí)達(dá)到最大值，而L21在培養(yǎng)5 d時(shí)達(dá)到最大值，L21的酸性磷酸酶活性最大值比R24高出27.30%；R24分泌堿性磷酸酶活性在培養(yǎng)第5天達(dá)到最大值，而L21在培養(yǎng)4 d達(dá)到最大值，L21堿性磷酸酶活性最大值比R24高出116.84%。測(cè)定發(fā)酵液每天的pH可知，兩菌株培養(yǎng)后，發(fā)酵液的pH均低于空白處理，L21發(fā)酵液的pH低于R24（圖4-c）。說明在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，L21分泌的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性高于R24，有利于該菌株分解難溶性無(wú)機(jī)磷，此結(jié)果與2.2中的該菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力相同。

2.5 不同溶磷菌株處理對(duì)薏苡農(nóng)藝性狀的影響

由表3可知，在培養(yǎng)60 d后，T1、T2和T3處理下的薏苡株高、莖粗、分蘗數(shù)和葉面積均大于對(duì)照CK。其中，株高和分蘗數(shù)與CK達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。T1、T2和T3處理對(duì)薏苡的葉片生長(zhǎng)影響較小，與CK相比未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。在培養(yǎng)30 d后，薏苡葉片葉綠素相對(duì)含量達(dá)到最大值，T1、T2和T3處理分別比CK增加19.74%、12.85%、7.98%。總之在培養(yǎng)60 d后，T1、T2和T3處理對(duì)薏苡的生長(zhǎng)發(fā)育均有一定的促進(jìn)作用（圖5）。

表3 不同處理下盆栽薏苡農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of potted plants after treatments

2.6 溶磷菌株生理生化與16S rDNA鑒定

2.6.1 細(xì)菌的生理生化鑒定 如圖6所示，R24菌落圓形，凸起明顯，白色，表面粗糙濕潤(rùn)；L21菌落圓形，凸起不明顯，白色，表面粗糙干燥，R24和L21革蘭氏染色均為陽(yáng)性。菌株R24、L21的生理生化測(cè)定結(jié)果見表4，在所測(cè)定的生理生化指標(biāo)中，菌株R24的甲基紅試驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽試驗(yàn)為陰性，其余為陽(yáng)性；菌株L21的檸檬酸試驗(yàn)為陰性，其余為陽(yáng)性。

表4 菌株的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.6.2 細(xì)菌分子鑒定 對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果提交GenBank與序列相似性較高的菌株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。結(jié)果顯示：2株細(xì)菌均為芽孢桿菌屬（Bacillus.）。其中，菌株R24與Bacillus pumilus（登錄號(hào)：NBRC 12092）處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，同源性99%，鑒定為短小芽孢桿菌；菌株L21與Bacillus velezensis（登錄號(hào)：MK092676.1）處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，同源性100%，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

續(xù)上表

3 討論與結(jié)論

解磷菌是一類能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性磷轉(zhuǎn)化為可以被植物吸收利用的可溶性磷的有益微生物，在玉米[15]、小麥[16]等作物上已進(jìn)行廣泛研究。目前國(guó)內(nèi)很少有對(duì)薏苡進(jìn)行內(nèi)生菌的分離鑒定及功能的探究。本研究通過平板接菌試驗(yàn)篩選得到溶解有機(jī)磷細(xì)菌8株，分別為分離自薏苡根系的R5、R24、R29、R401，分離自薏苡莖稈的S1、S4、S22，分離自薏苡葉片的L21，而R5、R24、R29、R401和L21同時(shí)具有溶解無(wú)機(jī)磷的能力。這與馬驄毓等[17]從黃芪根際中分離得到溶解無(wú)機(jī)磷菌株42株和溶解有機(jī)磷菌株33株在數(shù)量上有所差距，究其原因可能是不同的植物、分離的材料數(shù)所導(dǎo)致。

本研究中，分離自薏苡根系的R24對(duì)有機(jī)磷的溶解能力最強(qiáng)，為37.20 mg·L-1，分離自薏苡葉片的L21對(duì)無(wú)機(jī)磷的溶解能力最強(qiáng)，為62.93 mg·L-1；狄義寧等[18]在甘蔗中分離得到的溶磷菌D5的溶磷量。此外，R24在有機(jī)磷培養(yǎng)基中分泌磷酸酶的能力最強(qiáng)，酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性分別達(dá)9.64 μg·(mL·h)-1和 9.63 μg·(mL·h)-1；L21 在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中分泌磷酸酶的能力最強(qiáng)，酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性分別達(dá)到 11.47 μg·(mL·h)-1、10.69 μg·(mL·h)-1。溶磷內(nèi)生細(xì)菌的溶無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力各不相同，這可能是因?yàn)榫攴置诘牧姿崦浮⒅菜崦傅饶芰Σ煌琜19]，同時(shí)菌株溶磷能力的高低也與菌株自身的遺傳因素有關(guān)[20-21]，有待進(jìn)一步深入研究。

溶磷菌對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用，在本研究中，澆灌L21菌液后，與對(duì)照相比，薏苡的株高較CK增加22.07%，莖粗增加24.86%，葉面積增加53.33%，分蘗數(shù)增加83.33%。經(jīng)L21和R24處理后，薏苡根系活力與CK達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，分別較CK增加89.52%、63.76%。L21和R24的等比例混合菌液與CK相比，在株高、葉面積方面促進(jìn)效果顯著，但是低于L21和R24單獨(dú)處理的效果，可能的原因是兩株菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位等方面有所競(jìng)爭(zhēng)，這與Li等[22]研究的溶磷菌增加了玉米芽長(zhǎng)、生物量的結(jié)果一致?？偟膩碚fL21、R24和混合菌劑處理對(duì)薏苡的生長(zhǎng)發(fā)育均有一定的促進(jìn)作用，促生長(zhǎng)能力從大到小為：L21＞R24＞（L21+R24），可作為開發(fā)薏苡微生物肥料的優(yōu)質(zhì)菌種資源。