生防細菌蠟樣芽孢桿菌BCCY-22發(fā)酵條件優(yōu)化

趙 月，楊亞楠，李雅華，趙洪海，咸洪泉

（青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東 青島 266000）

0 引言

【研究意義】蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性內(nèi)生芽孢桿菌，常見于土壤和植物中[1]，其中有些蠟樣芽孢桿菌可作為生防菌用于防治植物病蟲害，發(fā)酵條件研究是其開發(fā)和應用前提和基礎，具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蠟樣芽孢桿菌細胞63 ℃處理2 min死亡率達99.30%[2]，而游離芽孢在70 ℃處理30 min條件下才能將其殺死[3]，蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢在高溫、寒冷等極端環(huán)境下具有很強的抗逆性[4]，有利于制劑化，提高制劑的穩(wěn)定性。蠟樣芽孢桿菌能有效防治植物病害，例如蠟樣芽孢桿菌強化的生物有機肥可防控細菌引起的煙草青枯病[5]，蠟狀芽孢桿菌可抑制植物病原真菌引發(fā)的棉花黃萎病并激活天然免疫[6]，防治鐮刀菌引起的玉米穗腐和根腐病[7]；蠟樣芽孢桿菌還可以防治多種線蟲病害[8-11]，同時促進植物生長[12]，對部分抗生素也可產(chǎn)生一定的耐受性[13]。因此蠟樣芽孢桿菌是一種具有很好開發(fā)前景的生防菌。生防菌開發(fā)利用的前提條件是發(fā)酵培養(yǎng)，不同生防菌株最適培養(yǎng)條件不同[14]，響應面法是一種高效的微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化方法，可以使用較少的實驗數(shù)據(jù)精準推算出目標值的優(yōu)化條件[15]。例如Zhang等[16]對谷物孢囊線蟲生防菌Trichoderma longibrachiatumT6進行響應面發(fā)酵優(yōu)化，在初始 pH 為6.06、接種量為1.62 mL、孵育時間為7.15 h的條件下發(fā)酵培養(yǎng)濾液獲得了最高的殺線蟲活性?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期篩選出1株對多種植物線蟲病害具有良好生防作用的蠟樣芽孢 桿 菌 BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）， 可有效防治小麥孢囊線蟲、花生根結(jié)線蟲和甜瓜根結(jié)線蟲等線蟲病害[17]，具有良好開發(fā)前景，然而其發(fā)酵培養(yǎng)條件有待深入探討?！緮M解決的關鍵問題】本研究探討pH、培養(yǎng)溫度、接種量、裝瓶量等對生防菌BCCY-22生長的影響，在單因素試驗基礎上，進行發(fā)酵參數(shù)響應面優(yōu)化，篩選BCCY-22菌發(fā)酵的最佳條件，旨在為BCCY-22菌株的發(fā)酵培養(yǎng)和開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠟樣芽孢桿菌BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）由青島農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室分離鑒定保存。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏5 g·L-1；蛋白胨 10 g·L-1；氯化鈉 5 g·L-1，pH 調(diào)至 7.2～7.6。

1.2 試驗方法

1.2.1 BCCY-22菌株生長曲線測定 將冰箱保存的斜面菌株，NA平板劃線活化，挑取一環(huán)接種到含有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，32.5 ℃，140 r·min-1培養(yǎng)，4 h取樣 1次，將樣品菌液稀釋8倍后，以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為對照，采用比濁法測定菌液600 nm波長處的吸光值（Optical Density 600，OD600）。將 OD600值以為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.2 BCCY-22菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 經(jīng)本實驗室前期不同培養(yǎng)基發(fā)酵比較試驗，發(fā)現(xiàn)適宜BCCY-22菌株生長的培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基，后續(xù)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件均利用NA液體培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 接種量為1%，裝瓶量20%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.5的條件下，分別置于23.5 、28、32.5 、37、41.5 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中，140 r·min-1培養(yǎng)3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化 利用1 mol·L-1的氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的初始pH值，將pH值分別設定為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。在接種量1%，裝瓶量20%條件下32.5 ℃，140 r·min-1培養(yǎng)3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.5 接種量的優(yōu)化 設置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%。裝瓶量20%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.5 的條件下，32.5 ℃、140 r·min-1培養(yǎng) 3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.6 裝瓶量的優(yōu)化 設置裝瓶量分別為10%、20%、30%、40%、50%。接種量1%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.5的條件下， 32.5 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后OD600值。

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)條件的響應面優(yōu)化設計試驗

（1）選取對生物量影響較大的3個因素：溫度、pH、裝瓶量。

（2）利用minitab軟件，采用中心復合設計（Central composite design，CCD)進行響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，中心符合序貫設計（Central composite circumscribed design）確定試驗因素和水平（表1）。

表1 試驗因素水平Table 1 Factor level of optimization experimentation

1.2.8 發(fā)酵時間的優(yōu)化 在上述優(yōu)化的發(fā)酵條件基礎上發(fā)酵培養(yǎng)，分別在 6、12、24、36、48、60、66、72 h測定菌液生物量，確定最佳的發(fā)酵時間。

1.2.9 差異顯著性分析 采用DPS v7.05軟件使用Duncan’s新復極差法進行因素多重比較分析，多個處理間的顯著性差異水平P＜0.05時為差異顯著，Excel進行數(shù)據(jù)整理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定

菌株BCCY-22在4~12 h快速增長，為對數(shù)生長期（圖1），因此選取對數(shù)生長期的菌體（10 h）作為后續(xù)試驗的種子液。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化結(jié)果 在23.5～37.0 ℃，培養(yǎng)36 h以內(nèi)，BCCY-22菌體量差異不顯著，說明BCCY-22生長適宜溫度范圍較寬；32.5 ℃培養(yǎng)48 h時，BCCY-22培養(yǎng)液OD600顯著高于其他溫度下培養(yǎng)液OD600，菌體量最高；隨著培養(yǎng)時間的增加，在37.0 ℃和41.5 ℃較高溫度培養(yǎng)下，菌體不穩(wěn)定，數(shù)量下降（圖2）。綜合生長速率和生物量指標，BCCY-22適宜的培養(yǎng)溫度范圍為23～32.5 ℃。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化結(jié)果 菌株BCCY-22在初始pH為5.5培養(yǎng)基中，菌體生長緩慢，60 h時，菌體量達到最大，之后OD600值開始下降，在初始pH為6.5的培養(yǎng)基中，生長較快，培養(yǎng)48 h達到穩(wěn)定期，生物量最大。培養(yǎng)基初始培pH值6.5和7.5，60 h內(nèi)BCCY-22培養(yǎng)液OD600不顯著；培養(yǎng)基初始pH值為8.5和9.5時，培養(yǎng)24 h對BCCY-22生長無顯著影響（圖3）。綜合培養(yǎng)基初始pH對菌株BCCY-22影響，BCCY-22菌株在初始pH為6.5的培養(yǎng)基中生長較快，有利于獲得最大的生物量。

2.2.3 接種量的優(yōu)化結(jié)果 接種量對菌體生長有一定影響，在24 h內(nèi)，接種量為3%時BCCY-22的菌體數(shù)量顯著高于其他處理組；培養(yǎng)至36 h，BCCY-22的菌體數(shù)量接種量為3%和1%差異不顯著，但顯著高于其他處理組（圖4）。綜合考慮生長速率和生物量指標，接種量以3%為宜。

2.2.4 裝瓶量的優(yōu)化結(jié)果 在所有的處理組中，當裝瓶量為10%時，培養(yǎng)12 h的菌體數(shù)量顯著高于其他處理組；培養(yǎng)24 h時，裝瓶量為10%和20%兩者之間的菌體數(shù)量差異不顯著，但是顯著高于其他處理組，此時菌體數(shù)量最多；說明裝瓶量少，有利于菌體數(shù)量的快速增加（圖5），BCCY-22菌株對氧的需求較高。

2.3 發(fā)酵條件響應面試驗設計優(yōu)化結(jié)果分析

響應面試驗結(jié)果見表2，利用統(tǒng)計軟件Minitab對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合。多項式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2（R-Sq）表達，其統(tǒng)計學上的顯著性由F檢驗確定。通過的RSREG（響應面回歸）過程進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應面回歸模型。結(jié)果表明，R-Sq=86.48%，R-Sq（預測）=11.52%，R-Sq（調(diào)整）=74.31%，說明經(jīng)過調(diào)整后該模型能解釋74.31%的變化。表3為二次多項式回歸方差分析表，回歸、線性以及平方的P值小于0.05，模型失擬檢驗的P值大于0.05，說明回歸模型正確，不需要對回歸模型做出調(diào)整。表4為二次多項式回歸系數(shù)及其顯著性檢測結(jié)果，模型方程A、C、A2、C2、A與C、A與B以及B與C項的P值大于0.05，B、B2的P值分別為0.000、0.003，說明在這3個因素中，溫度以及裝瓶量對OD600值影響不顯著，培養(yǎng)基的初始pH對生物量影響顯著，并且3個因素之間交互作用不明顯。

表2 中心復合設計及試驗結(jié)果Table 2 Design and results of experiment

表3 二次多項式回歸方差分析Table 3 Quadratic polynomial regression variance test results

表4 二次多項式回歸系數(shù)及其顯著性檢驗Table 4 Quadratic polynomial regression coefficient and significance test

可以用以下回歸方程表示三個因素與生物量之間的關系：Y=-4.248 9+0.186 9A+0.804 9B+0.015 7C-0.003 1A2-0.044 7B2-0.000 2C2-0.007 0AB-0.000 2AC-0.000 3BC，其中A代表溫度、B代表培養(yǎng)基的初始pH、C代表裝瓶量。

pH、溫度的交互作用對OD600的響應曲面見圖6、7，當溫度一定的時，pH為2～6時，隨著pH的增加，生物量也隨之增加，變化較明顯；pH為6～8時，生物量變化不明顯。當pH一定時，溫度對生物量的影響不明顯。

溫度、裝瓶量的交互作用對OD600的響應曲面見圖8，當裝瓶量一定時，隨著溫度的上升，生物量增加，但是當溫度超過25 ℃左右時，生物量開始下降。當溫度一定時，隨著裝瓶量的增加，生物量增加，裝瓶量超過40%左右后，生物量隨著裝瓶量的增大而減小。溫度、裝瓶量的交互作用對OD600的等值線見圖9，當裝瓶量為40%時，溫度在20～26 ℃時，生物量可以達到0.8以上。

pH、裝瓶量的交互作用對OD600的響應曲面見圖10，當pH一定時，裝瓶量對生物量影響不明顯時。當裝瓶量一定時，隨著pH的上升，生物量增加，但是超過一定的pH時，生物量開始下降。pH、裝瓶量的交互作用對OD600的等值線見圖11，相較于裝瓶量，培養(yǎng)基的初始pH對生物量影響明顯。

通過對回歸方程分析當培養(yǎng)溫度為21.33 ℃，培養(yǎng)基的初始pH為7.27，裝瓶量為23.13%時可得到響應最大值。為了方便操作，培養(yǎng)溫度取21.5 ℃、培養(yǎng)基的初始pH為7.3、裝瓶量為23%，在此條件下重復3次試驗，此時培養(yǎng)基的OD600值為0.99。通過試驗證明，在這種條件下培養(yǎng)，菌體培養(yǎng)36 h后的OD600值為0.987，為理論預測值的99.70%，說明響應面模型可靠，為BCCY-22菌株的發(fā)酵提供了理論依據(jù)。

2.4 發(fā)酵時間的優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化前，細菌生長較慢，發(fā)酵42 h進入穩(wěn)定期，生物量達到最大，OD600=0.768；優(yōu)化發(fā)酵條件后，細菌生長迅速進入對數(shù)生長期，在36 h時達到生物量最大，OD600=1.044；進入穩(wěn)定期（圖12）。所以在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵時間以36 h為宜。蠟樣芽孢桿菌BCCY-22優(yōu)化發(fā)酵后，縮短發(fā)酵時間6 h，生物量是優(yōu)化前的135.94%。

3 討論與結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，是一種兼性厭氧或好氧的革蘭氏陽性菌[18]，是土壤微生物的重要組成部分[19]，其在植物根際土壤具有快速定殖的特征，可通過抑制病原菌的侵染和定殖來進行生物防治[20]；蠟樣芽孢桿菌具有超強的抗逆性，抵御外界不良因子和較強的環(huán)境適應能力與它產(chǎn)生的芽孢有關，芽孢在休眠期間可在酸堿環(huán)境、高溫等環(huán)境存活[21]。目前芽孢桿菌被廣泛應用于生物防治[22]，成為目前生防菌研究的重要對象。眾多研究表明，通過對生防菌培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，可提高其生物量或促進生物活性物質(zhì)產(chǎn)生，從而提高生防效果[23,24]。朱海云等[25]對抗獼猴桃細菌性潰瘍病蠟樣芽孢桿菌MA23進行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了蠟樣芽孢桿菌MA23最佳發(fā)酵初始pH6.5、最佳發(fā)酵溫度為30 ℃、最佳接種量為8%、最佳搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1；Chen等[26]對以富硒為有機硒源的蠟樣芽孢桿菌進行發(fā)酵工藝優(yōu)化研究，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為接種量7%、發(fā)酵溫度33 ℃、搖床轉(zhuǎn)速170 r·min-1；尹艷楠等[27]對蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株進行響應面發(fā)酵優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為溫度28 ℃、發(fā)酵初始pH值7.5、接種量為2%、裝液量30%。上述一系列研究結(jié)果表明，不同蠟樣芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件不同。

生防細菌菌株蠟樣芽孢桿菌BCCY-22對多種農(nóng)作物線蟲病害具有防治效果，本研究單因素試驗結(jié)果表明，溫度、pH和裝瓶量對蠟樣芽孢桿菌BCCY-22菌株的生物量影響較大。通過響應面試驗結(jié)果分析和試驗驗證：生防細菌BCCY-22最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度21.5 ℃、初始pH 7.3、種子液接種量3%、裝瓶量23%、發(fā)酵時間36 h；比優(yōu)化前發(fā)酵時間縮短了6 h，生物量是優(yōu)化前的135.94%。對比不同蠟樣芽孢桿菌最適發(fā)酵條件，蠟樣芽孢桿菌BCCY-22的發(fā)酵溫度較低，這可能由于是菌株差異造成的，BCCY-22菌株最初是以小麥孢囊線蟲病為靶標篩選的生防菌，小麥孢囊線蟲侵染植物以春季孵化的二齡幼為主[28]，此時溫度較低，蠟樣芽孢桿菌BCCY-22可在較低的溫度快速生長繁殖，可能更有利于蠟樣芽孢桿菌BCCY-22發(fā)揮其生防潛能。本研究為蠟樣芽孢桿菌BCCY-22生物防治發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎。