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    產(chǎn)油單針藻的最適培養(yǎng)基篩選及產(chǎn)油特性提升

    2022-11-30 05:53:52馬思琦尹紫良林宜萌葛菁萍
    中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2022年27期
    關(guān)鍵詞:藻株產(chǎn)油微藻

    馬思琦,李 暢,樊 陽,孫 瑩,尹紫良,林宜萌,葛菁萍

    (1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱 150500;2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150080)

    0 引言

    隨著世界經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和世界人口的不斷膨脹,人們對(duì)能源的需求量日益增加,有研究預(yù)計(jì)人類對(duì)能源的需求到2030年將會(huì)增加50%[1]。目前全球能源主要由化石能源如煤、石油、天然氣等供應(yīng),化石能源屬于不可再生能源,其儲(chǔ)存量有限,無法滿足人類對(duì)能源的長期使用需求。為緩解人類社會(huì)面臨的能源危機(jī),人們需要尋找清潔的可再生能源來代替化石能源的使用,生物柴油是一個(gè)可選擇的替代方案。生物柴油即來源于生物體的燃料,其使用能夠減少二氧化碳及碳?xì)浠衔锏呐欧?,有利于減緩溫室效應(yīng),但目前的生物柴油原料主要基于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的食品及資源,如大豆油、玉米油等,這類生物柴油的生產(chǎn)需要占用大量耕地資源,產(chǎn)出效率低[2]。近年來,微藻作為第三代生物柴油的潛在生產(chǎn)者表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。微藻在代謝過程中能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為三酰基甘油酯,用于生物柴油的生產(chǎn)[3-4]。微藻光合效率高,生長周期短,不與農(nóng)作物爭地。除了生產(chǎn)生物柴油外,微藻還能生產(chǎn)多不飽和脂肪酸、色素、抗氧化劑等高價(jià)值副產(chǎn)物[5-9]。

    利用微藻生產(chǎn)生物柴油尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,主要障礙在于微藻生物柴油的生產(chǎn)成本較高。為了降低微藻產(chǎn)油成本,需要在開發(fā)新藻種、提高藻株產(chǎn)油潛能、采用新的培養(yǎng)技術(shù)、減少采收過程中的能源消耗等各環(huán)節(jié)加大研究力度[10]。在上述環(huán)節(jié)中,對(duì)藻株培養(yǎng)條件的探索與優(yōu)化是分離新藻株后的必要流程。不同藻株在分離生境上的差異往往導(dǎo)致了其生理代謝特征的特殊性,進(jìn)一步體現(xiàn)在藻株生長對(duì)培養(yǎng)基營養(yǎng)的獨(dú)特需求上。因此,選擇合適的培養(yǎng)基并對(duì)培養(yǎng)基中的重要成分做系統(tǒng)性優(yōu)化是提升藻株產(chǎn)油指標(biāo)的重要步驟,也是挖掘藻株產(chǎn)油潛能的最直接和有效的方法[11]。目前已有研究利用培養(yǎng)基篩選[12]及營養(yǎng)條件優(yōu)化[13],顯著提升微藻藻株的生物量及油脂含量。

    本研究以前期分離自黑龍江省大慶地區(qū)鹽堿湖泊的單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11為供試藻株[14],篩選其適合生長及產(chǎn)油的培養(yǎng)基,并對(duì)其培養(yǎng)條件做了進(jìn)一步的優(yōu)化,以期進(jìn)一步提升藻株的產(chǎn)油潛能,為進(jìn)一步應(yīng)用于生物柴油生產(chǎn)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試藻株與培養(yǎng)基

    1.1.1 供試藻株 供試藻株單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11由黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[12,15-16]。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 培養(yǎng)條件 以培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期的藻液作為種子液,以10%(v/v)的接種量接種于新鮮的培養(yǎng)基中,裝液量200 mL/500 mL(三角瓶)。在光照搖床中,每天光照16 h、黑暗8 h培養(yǎng),光照強(qiáng)度3000 lux,恒溫25℃。每天以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)液3次,每次10 min,培養(yǎng)周期為6~22天。

    1.2.2 藻株生長曲線的測定 利用光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板來計(jì)算微藻細(xì)胞個(gè)體數(shù),以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的藻細(xì)胞密度為縱軸,繪制藻株生長曲線,用于藻株生長狀況和生長速度的比較。

    1.2.3 藻株生物量的測定 取穩(wěn)定期的微藻培養(yǎng)液70 mL于已稱重的100 mL的離心管中(W1),以轉(zhuǎn)速3800 r/min離心20 min,倒去上清液,再以ddH2O洗滌2次后,分別離心并倒去上清液,將離心得到的微藻藻泥放在50℃的烘箱中烘干至恒重(W2)。藻細(xì)胞的生物量(DCW)的計(jì)算見公式(1)。

    1.2.4 藻株油脂含量的測定 微藻油脂的含量利用尼羅紅染色熒光光譜法測定,參照方法Greenspan等[17]的方法,在培養(yǎng)周期相應(yīng)時(shí)間(T)取藻液,調(diào)整藻液OD680值為0.8。取調(diào)整OD值后藻液4 mL,加入1 mL DSMO,使用50 μL 100 μg/mL的尼羅紅溶液對(duì)藻液染色5 min,使用熒光光度計(jì)測定相對(duì)熒光強(qiáng)度(Relative Fluorescence Units,RFU),激發(fā)波波長為480 nm,檢測波波長為570 nm。油脂生產(chǎn)率的計(jì)算見公式(2)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS軟件(20.0版本)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 培養(yǎng)基種類對(duì)HDMA-11生長速度的影響

    使用培養(yǎng)微藻常用的培養(yǎng)基(BBM培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基、D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基)對(duì)HDMA-11進(jìn)行培養(yǎng),以HDMA-11使用BG-11培養(yǎng)基的生長為參照,篩選適合HDMA-11生長的培養(yǎng)基。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),藻液的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制藻株的生長曲線(圖1)。HDMA-11在這幾種培養(yǎng)基中均可生長,未觀察到明顯的生長延滯期,但生長速度區(qū)別較大。在BBM培養(yǎng)基中,HDMA-11的生長情況與在BG-11培養(yǎng)基中類似,細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定增加,在培養(yǎng)末期細(xì)胞數(shù)達(dá)到8.0×107/mL,與在BG-11培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)(8.4×107/mL)相似。使用D1培養(yǎng)基、SE培養(yǎng)基時(shí)HDMA-11的生長較慢,培養(yǎng)末期細(xì)胞數(shù)僅為BG-11培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)的一半。在TAP培養(yǎng)基中HDMA-11的生長最快,培養(yǎng)第6天即可達(dá)到穩(wěn)定期,雖然HDMA-11在TAP培養(yǎng)基中生長至培養(yǎng)末期時(shí),細(xì)胞數(shù)(6.5×107/mL)有所降低,略低于BG-11培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù),但考慮到HDMA-11在TAP中生長時(shí)在較短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)定期,極大縮短了培養(yǎng)周期,生長效率最高。

    圖1 Monoraphidium sp.HDMA-11在不同培養(yǎng)基中的生長曲線

    2.2 培養(yǎng)基種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

    對(duì)于產(chǎn)油藻株來說,藻細(xì)胞的生物量、含油量是藻株產(chǎn)油能力的基礎(chǔ)指標(biāo)。本研究檢測了HDMA-11在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)后期的生物量和油脂含量,結(jié)果如圖2所示。在BG-11培養(yǎng)基中,HDMA-11可達(dá)到較高生物量,為(490±6)mg/L。在BBM培養(yǎng)基中,HDMA-11的生物量為(480±14)mg/L,與HDMA-11在BG-11培養(yǎng)基中的生物量相比差異不顯著。在TAP培養(yǎng)基中,HDMA-11的生物量有所降低,為(301±4)mg/L。在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中,藻細(xì)胞的生物量較低,僅為226~230 mg/L。與生物量的差異相比,HDMA-11的油脂含量在BG-11、BBM和TAP培養(yǎng)基中沒有顯著差異。而在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中,HDMA-11的油脂含量較低。綜合考慮HDMA-11在D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基中較慢的生長速度(圖1)和較低的生物量和油脂含量(圖2),D1培養(yǎng)基和SE培養(yǎng)基不適合該藻株的生長和產(chǎn)油。因?yàn)樵寮?xì)胞在不同培養(yǎng)基中達(dá)到穩(wěn)定期的培養(yǎng)天數(shù)不同,油脂生產(chǎn)率更能反應(yīng)藻細(xì)胞的產(chǎn)油能力。計(jì)算后發(fā)現(xiàn),雖然藻株在TAP培養(yǎng)基中生物量略有降低,但藻株在TAP培養(yǎng)基中生長速度快,同時(shí)油脂含量未下降,最終藻株在TAP培養(yǎng)基中的相對(duì)油脂生產(chǎn)率最高,達(dá)256 RFU/(L·d),比在BG-11培養(yǎng)基中的相對(duì)油脂生產(chǎn)率增加117%。因此,選擇TAP培養(yǎng)基作為HDMA-11的培養(yǎng)基,進(jìn)行進(jìn)一步的生長優(yōu)化。

    圖2 Monoraphidium sp.HDMA-11在不同培養(yǎng)基中的生物量、油脂含量

    2.3 碳源種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

    以TAP培養(yǎng)基為起始培養(yǎng)基,選擇微藻培養(yǎng)常用的8種碳源(果糖、甘露醇、麥芽糖、乙酸、甘油、乙酸鈉、葡萄糖和蔗糖),以培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)HDMA-11的生物量和油脂含量為檢測指標(biāo),檢測HDMA-11可利用的碳源種類(圖3)。HDMA-11幾乎不能利用甘油生長,對(duì)甘露醇、乙酸鈉和葡萄糖的利用效率也很低,只能達(dá)到79~130 mg/L的生物量。果糖或蔗糖作為碳源時(shí),HDMA-11的生物量略有增加,達(dá)到222~230 mg/L。藻細(xì)胞利用麥芽糖生長時(shí),生物量進(jìn)一步增加至為294 mg/L。在檢測的八種碳源中,乙酸為HDMA-11最適生長碳源,在培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí),HDMA-11的生物量為(351±19)mg/L(圖3A)。進(jìn)一步檢測HDMA-11利用各碳源生長至穩(wěn)定期的油脂含量,發(fā)現(xiàn)當(dāng)以甘露醇、甘油、乙酸鈉、葡萄糖或蔗糖為碳源時(shí),藻細(xì)胞積累油脂的能力也受到了影響。果糖或乙酸作為碳源時(shí),HDMA-11的油脂含量較高??紤]到乙酸作為碳源時(shí)更有利于HDMA-11生物量的積累,并綜合考慮碳源成本和藻株生長狀態(tài),之后的實(shí)驗(yàn)均以乙酸作為HDMA-11培養(yǎng)的添加碳源。

    圖3 碳源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

    2.4 氮源種類對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

    分別用硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、酵母提取物和尿素作為氮源,考察HDMA-11利用不同氮源的生長情況。以培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)HDMA-11的生物量和油脂含量為檢測指標(biāo),檢測HDMA-11可利用的碳源種類。由圖4A可知,6種氮源均可被HDMA-11利用,使用不同氮源所獲得的最終生物量數(shù)值差異不顯著。使用硝酸銨、硝酸鈉和氯化銨作為氮源時(shí)HDMA-11的油脂相對(duì)含量高于使用蛋白胨、酵母提取物和尿素作為氮源時(shí)的水平(圖4B)。從生長情況來看,使用氯化銨作為氮源時(shí)藻細(xì)胞生長的狀態(tài)最好,藻液較綠,最終OD680達(dá)到了2.8(圖5),因此之后的實(shí)驗(yàn)中選擇氯化銨作為氮源。

    圖4 氮源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

    圖5 氮源種類對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生長中OD680的影響

    2.5 乙酸添加量對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

    為了進(jìn)一步優(yōu)化HDMA-11的產(chǎn)油特性,檢測了乙酸添加量對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響。設(shè)置了0、1、2、4、8 mL/L共5個(gè)乙酸添加量,為了避免乙酸對(duì)培養(yǎng)體系pH的影響,在加入乙酸后,將培養(yǎng)基初始pH統(tǒng)一調(diào)整為7.0。如圖6A所示,當(dāng)乙酸含量為0~2 mL/L,藻細(xì)胞的生物量隨著乙酸增加而增加,最高生物量為(406±10)mg/L。但隨著乙酸濃度進(jìn)一步增加,藻細(xì)胞生長受到抑制,以8 mL/L乙酸對(duì)藻細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。高濃度的乙酸極大影響藻細(xì)胞生物量的積累,在8 mL/L乙酸濃度下,HDMA-11的生物量僅為(126±6)mg/L。藻細(xì)胞的油脂積累特性也與乙酸濃度密切相關(guān)(圖6B),不添加乙酸的實(shí)驗(yàn)組,油脂積累受到的影響最大,僅為1.3 RFU。1 mL/L乙酸和2 mL/L乙酸最有利于藻細(xì)胞的油脂積累,而較高濃度的乙酸(4~8 mL/L)不利于藻細(xì)胞產(chǎn)油。當(dāng)乙酸濃度從1 mL/L升至2 mL/L,HDMA-11的生物量顯著增加,油脂含量下降不顯著,因此選擇2 mL/L為本研究添加乙酸的濃度。

    圖6 乙酸濃度對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

    2.6 氯化銨濃度對(duì)HDMA-11生物量及含油量的影響

    在優(yōu)化乙酸添加量的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢測不同的氯化銨濃度(125、375、750、1500、3000 mg/L)對(duì)藻株HDMA-11生長的影響。在培養(yǎng)期結(jié)束后檢測藻細(xì)胞的生物量和油脂含量,結(jié)果如圖7所示。當(dāng)氯化銨濃度在從125 mg/L升至750 mg/L時(shí),藻細(xì)胞的生物量由350 mg/L增加至419 mg/L,但當(dāng)氯化銨濃度進(jìn)一步增加,藻細(xì)胞的生長受到抑制,生物量顯著降低(圖7A)。相比之下,藻株的含油量在不同氯化銨濃度下差異不顯著。考慮到氯化銨對(duì)HDMA-11生物量的影響,將氯化銨濃度確定為750 mg/L。

    圖7 氯化銨濃度對(duì)Monoraphidium sp.HDMA-11生物量(A)和油脂含量(B)的影響

    經(jīng)過了培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化,HDMA-11的產(chǎn)油指標(biāo)提升情況見表1。將培養(yǎng)基由BG-11替換為TAP后,藻株生物量有所降低,但因培養(yǎng)周期極大縮短,藻株的生物量生產(chǎn)率提升了127%,油脂生產(chǎn)率提升了117%。又進(jìn)一步對(duì)HDMA-11可利用的碳源種類、氮源種類進(jìn)行摸索,優(yōu)化了碳源添加量和氮源添加量,優(yōu)化后的HDMA-11生物量生產(chǎn)率提升了40%,較本研究初始培養(yǎng)條件提升218%,優(yōu)化后的HDMA-11油脂生產(chǎn)率提升23%,較本研究初始培養(yǎng)條件提升了116%。

    表1 HDMA-11在優(yōu)化培養(yǎng)條件前后的生物量、生物量生產(chǎn)率、油脂含量和油脂生產(chǎn)率

    3 討論

    培養(yǎng)基是影響微藻類生長的重要因素。ZHAO等[12]研究了4種培養(yǎng)基對(duì)雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)LUGU生長的影響,發(fā)現(xiàn)LUGU在BBM培養(yǎng)基中生長可獲得較高生物量。對(duì)于單針藻M.sp.NTAI02來說,BG-11培養(yǎng)基并不適合它生長[18],而卷曲纖維藻(Ankistrodesmus falcatus)在BG-11培養(yǎng)基中的生長速度遠(yuǎn)超另外3種培養(yǎng)基[19]。對(duì)于不同的微藻藻種或者藻株來說,由于生理特性及利用營養(yǎng)素的效率不同,最適培養(yǎng)基可能非常不同。為了提升藻株的生長速度、生物量積累水平和產(chǎn)油效率,有必要篩選合適的培養(yǎng)基。以往研究對(duì)于單針藻的生理特性及適用培養(yǎng)基研究較為有限,本研究選擇5種微藻常用的培養(yǎng)基,檢測HDMA-11對(duì)這幾種培養(yǎng)基的適用性(圖1)及HDMA-11產(chǎn)油指標(biāo)的變化(圖2)。從達(dá)到穩(wěn)定期的細(xì)胞數(shù)來看,使用BG-11和BBM培養(yǎng)基的結(jié)果較為類似,使用TAP培養(yǎng)基時(shí)藻株細(xì)胞數(shù)略低。但當(dāng)藻株在TAP培養(yǎng)基中生長時(shí),藻株可以在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定期,生長速度快,再結(jié)合生物量與油脂含量的指標(biāo),確定藻株使用TAP培養(yǎng)基兼具生長速度和產(chǎn)油效率的優(yōu)勢。TAP培養(yǎng)基常用于衣藻屬(Chlamydomonas)藻株的培養(yǎng),較少用于單針藻屬的培養(yǎng)[20]。本研究供試藻株分離自大慶地區(qū)鹽堿湖泊的特殊生境,它所適用培養(yǎng)基的特殊性也說明它在生理代謝上的特殊性。

    碳源是微藻生長繁殖需要的重要物質(zhì),篩選適合且成本較低的碳源對(duì)于進(jìn)一步降低微藻培養(yǎng)成本具有重要意義,對(duì)于新分離的藻株尤其如此。微藻常用碳源包括糖類、有機(jī)酸、醇類等。YEE[21]發(fā)現(xiàn),Monoraphidium griffithii NS16可利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、乙酸鈉和甘露醇生長,其中0.05%的甘露醇和0.1%的果糖可使藻細(xì)胞生物量增加0.1~1倍。葡萄糖是微藻培養(yǎng)常用的碳源,但HDMA-11不能利用葡萄糖生長,向微藻培養(yǎng)體系中加入葡萄糖后,大部分藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,不能正常生長繁殖。推測該藻株在進(jìn)化過程中主要以自養(yǎng)方式生長,不能以葡萄糖代謝作為中心代謝途徑,且葡萄糖的存在對(duì)藻細(xì)胞生長有一定的毒性作用。蔗糖在酸性條件下可水解為葡萄糖和果糖,麥芽糖在酸性條件下可水解為葡萄糖,考慮到本研究所用培養(yǎng)基的初始pH值為7.0,且微藻在培養(yǎng)過程中pH逐漸增加,未能達(dá)到蔗糖和麥芽糖的水解條件,這可能是HDMA-11在蔗糖或麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長狀況優(yōu)于葡萄糖為碳源培養(yǎng)基的原因之一。在碳源利用特征上,HDMA-11能夠高效利用乙酸(圖3),在一定濃度范圍內(nèi)增加乙酸添加量可促進(jìn)藻株的生長,但當(dāng)乙酸添加量高于4 mL/L,藻株的生長受到較大抑制(圖6),且這種生長抑制與乙酸降低培養(yǎng)體系pH值并無關(guān)系。

    本研究還篩選了HDMA-11可利用的氮源,發(fā)現(xiàn)該藻株可利用6種氮源,這其中包含了硝酸鹽和銨鹽(圖4)。基于現(xiàn)有大部分研究,硝酸鹽是單針藻屬常用的氮源。Wu等曾檢測Monoraphidium sp.SB2可利用的氮源種類,發(fā)現(xiàn)SB2利用硝酸鉀的效率最高,可獲得較高生物量[22]。而銨鹽若濃度過高,可能導(dǎo)致植物光合作用的破壞[23-26],這可能是本研究中增加氯化銨濃度抑制HDMA-11生長的原因(圖7)。本研究僅對(duì)HDMA-11的碳源種類、氮源種類做了初步探索,對(duì)HDMA-11的乙酸添加量和氯化銨濃度做了初步優(yōu)化,后續(xù)工作將進(jìn)一步檢測環(huán)境條件如初始pH、培養(yǎng)溫度對(duì)藻株產(chǎn)油指標(biāo)的影響。另外,培養(yǎng)基中其他成分對(duì)藻株的影響也值得進(jìn)一步探究,以進(jìn)一步提升該藻株的產(chǎn)油能力。

    4 結(jié)論

    本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離的單針藻(Monoraphidium sp.)HDMA-11作為出發(fā)藻株,篩選其最適培養(yǎng)基并優(yōu)化了培養(yǎng)基成分。當(dāng)使用TAP培養(yǎng)基,乙酸添加量為2 mL/L,氯化銨濃度為750 mg/L時(shí),藻株的產(chǎn)油性能最佳,生物量生產(chǎn)率和油脂生產(chǎn)率分別為70 mg/(L·d)和315 RFU/(L·d)。說明培養(yǎng)基類型及成分的優(yōu)化可提升藻株產(chǎn)油指標(biāo),是改善藻株產(chǎn)油潛能的重要方法。

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