人參黑斑病防治及抗病育種研究進(jìn)展

張寧，張晶晶，侯微，李亞麗，曲正義，鄭培和

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省中藥材種植（養(yǎng)殖）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112）

人參（Panax ginseng）為五加科人參屬多年生草本植物，是我國的名貴中藥材，主要分布在吉林、遼寧和黑龍江3省。人參在生長期間易受多種病害侵襲，黑斑病是人參嚴(yán)重的病害之一。黑斑病是由鏈格孢真菌引起的典型流行病和循環(huán)性病害，主要侵害人參葉片，其次是莖、花和果實(shí)，致使人參質(zhì)量和產(chǎn)量降低，因此對于黑斑病應(yīng)積極防治。本文綜合闡述了近年來研究人員在人參黑斑病的危害、發(fā)病情況和防治措施方面的研究，結(jié)合大田植物抗病育種研究進(jìn)行分析，對今后通過分子育種等手段更有效地防治黑斑病進(jìn)行了展望，期望為科學(xué)防治人參黑斑病及抗黑斑病育種提供參考。

1 人參黑斑病的發(fā)病特征及危害

1.1 人參黑斑病的發(fā)病特征

黑斑病是藥用植物的常見病害。人參黑斑病是由半知菌亞門絲孢綱鏈格孢屬（Alternaria Nees）真菌引起[1]，主要致病菌為人參鏈格孢（Alternaria panax Whetz）[2]和鏈格孢（Alternaria alternata）[3,4]。人參黑斑病發(fā)病于人參地上部分，主要表現(xiàn)為受侵害處產(chǎn)生不規(guī)則水漬狀的褐色或灰褐色病斑，導(dǎo)致植株受害部位折垂至枯萎死亡[5]。人參黑斑病最先發(fā)于葉片，產(chǎn)生不規(guī)則水浸狀黃褐色病斑，后逐漸變成褐色，遇陰雨潮濕天氣迅速擴(kuò)展，使得病斑外緣處呈輪紋狀，干燥后極易破裂，病斑逐步擴(kuò)大匯合使整個(gè)葉片枯死[6]。葉柄及花梗被害時(shí)，病斑橢圓形，上下擴(kuò)展呈長條形，褐色，多凹陷，環(huán)切使莖稈折倒，葉柄下垂，花序枯死。隨著病害的加重逐步蔓延至花和果實(shí)，被害果實(shí)表面初期呈水浸狀不規(guī)則形的褐色斑點(diǎn)，外果皮逐漸干癟，內(nèi)部種子呈灰黑色皺縮，表面密生黑色霉層，形成“吊干籽”。根、根莖及芽苞受害，產(chǎn)生圓形棕褐色腐爛斑，逐漸擴(kuò)展及全根，并變黑腐爛。

研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)人參黑斑病菌以菌絲體和孢子在植株病殘?bào)w和土壤中越冬，并隨著雨水飛濺和空氣流動(dòng)進(jìn)行傳播附著到植株上，當(dāng)達(dá)到一定的溫度和濕度時(shí)孢子萌發(fā)菌絲蔓延，通過氣孔或傷口侵入人參葉片，長出侵染菌絲伸入附近細(xì)胞內(nèi)，從葉片組織中吸取養(yǎng)料和水分快速繁殖。人參黑斑病多于5月中下旬開始發(fā)病，6月份病情發(fā)展趨于平緩，7月份溫度升高，降雨量增大，當(dāng)空氣相對濕度達(dá)90%以上時(shí)病情急劇發(fā)展，8月份出現(xiàn)發(fā)病高峰，9月上旬達(dá)到頂點(diǎn)。

1.2 人參黑斑病的危害

黑斑病作為人參病害之一，嚴(yán)重影響我國人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。從1904年VanHook發(fā)現(xiàn)該病害后，黑斑病一直持續(xù)地對人參的生長生產(chǎn)造成影響。人參黑斑病在葉片上發(fā)病，直接導(dǎo)致葉片光合作用速率下降，影響植株能量積累，嚴(yán)重時(shí)影響藥用植物產(chǎn)種及參根芽孢的產(chǎn)生，易造成人參早期落葉、植株提前枯萎、不能結(jié)實(shí)及參根減產(chǎn)30%~80%[7,8]，導(dǎo)致人參質(zhì)量和產(chǎn)量降低。發(fā)病率調(diào)查顯示，人參黑斑病常年發(fā)病率為20%~30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)70%[9]。

2 人參黑斑病防治措施

2.1 科學(xué)管理對人參黑斑病的防治

黑斑病菌的孢子和菌絲體存在越冬的特點(diǎn)，在管理參田時(shí)要及時(shí)清除病原。在秋季清理床面，春季種植時(shí)對種子或參苗做好消毒處理工作；采用日光消毒或干柴草燒烤消毒的方式處理參床，殺死土壤表層的病菌芽孢、菌絲及其他害蟲[10]。加強(qiáng)田間管理，在植株生長期間及時(shí)拔除田間病株，防止病原孢子大面積傳播。直射光下生長的人參黑斑病發(fā)生較重，而全陰棚下生長的人參黑斑病發(fā)生較少，因此要及時(shí)做好遮陰工作并使參棚透光均勻一致，防止漏雨，參床做好排水，防止積水引發(fā)各種疾病。

2.2 化學(xué)制劑對人參黑斑病的防治

為保障人參的產(chǎn)量，降低黑斑病的發(fā)生率，目前已開發(fā)了一系列防治方法，化學(xué)防治以使用化學(xué)制劑為主。先正達(dá)集團(tuán)研制的11.7%丙環(huán)唑+7%偶氮菌酯混懸劑對人參鏈格孢霉黑斑病有較好的防治效果[11]。關(guān)昕等[12]對各藥劑田間藥效試驗(yàn)表明，化學(xué)藥劑異菌脲對人參黑斑病的防效最好且毒性低，可抑制真菌孢子的萌發(fā)及產(chǎn)生，也可抑制菌絲生長。鄭芝強(qiáng)等[13]實(shí)驗(yàn)表明，50%美派安可濕性粉劑防治人參黑斑病有較好的效果，800倍液的50%美派安可濕性粉劑防效可達(dá)到84.38%。李勇等[14]實(shí)驗(yàn)表明，低毒化學(xué)殺菌劑新益甲托、金萬霉靈和多菌靈對人參黑斑菌的抑制力較好，可考慮對人參黑斑病進(jìn)行田間防治。葛堯倫等[15]合成了一種有效成分為四霉素與中生菌素的殺菌組合物，可用來防治人參和三七的黑斑病。Tang和王雪等[16,17]研究認(rèn)為，10%苯醚甲環(huán)唑WG、72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP、50%克菌丹WG、25%丙環(huán)唑EC和50%嘧菌環(huán)胺WG等化學(xué)制劑對人參黑斑病都具有較為良好的室內(nèi)抑菌作用。

2.3 生物制劑對人參黑斑病的防治

人參黑斑病生物防治以微生物菌劑為主。盧麗珍等[18]研究表示，人參黑斑病以基施地養(yǎng)力微生物菌劑3.6 kg/10 m2，5月、7月、8月各噴施1次高?？?號微生物菌劑2.3 L/10m2處理參地，發(fā)病率最低，防治效果最好。近年來為了更安全更有效地防治黑斑病，諸多學(xué)者從病原菌生長著手，通過植物提取液和微生物發(fā)酵液抑制人參黑斑菌的生長。丁香、藿香和苦參3種中藥提取物在質(zhì)量濃度為1.0 kg/L時(shí)，對人參黑斑病菌菌絲生長的抑菌率達(dá)100%、92.2%和89.2%，抑菌效果均高于常用化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅[19]。趙玉婷等[20]表示從藜蘆中分離提取的白藜蘆醇對人參黑斑菌有很好的抑制作用。Ji等[21]從種植人參的土壤中分離出對人參黑斑病有良好抑制作用的菌株CNU114001。研究還發(fā)現(xiàn)諸多人參黑斑病病原菌的生防菌株資源，如吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）[22]、球毛殼菌（Chaetomium globosum）[23]、土壤短波單胞菌（Brevundimonas terrae）[24]和芽孢桿菌（Bacillus）[25,26]等對人參黑斑病菌都具有較好的拮抗作用。管成林[27]采用平板對峙法篩選到一株鐵皮石斛同源內(nèi)生拮抗菌（Burkholderia sp.），對黑斑病病原菌（C.oxysporum和A.alternata）有較強(qiáng)的拮抗效果。

化學(xué)防治具有快速高效、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但在防治過程中化學(xué)農(nóng)藥的不科學(xué)使用，容易引發(fā)中藥材農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染和土壤微生物失衡等系列問題。而且過度使用化學(xué)藥劑還可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[28]。研究發(fā)現(xiàn)三七黑斑病菌已出現(xiàn)對烯唑醇產(chǎn)生抗藥性的趨勢[29]。微生物制劑具有安全、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，但也存在菌株退化、防效不穩(wěn)定和防治力度弱等缺點(diǎn)。因此，亟需尋求新的方法，更安全有效地治理黑斑病。

3 抗病育種對黑斑病的防治

育種（Breeding）是通過創(chuàng)造遺傳變異、改良遺傳特性以培育優(yōu)良動(dòng)植物新品種的技術(shù)。植物育種方式主要包括雜交育種、誘變育種、單（多）倍體育種、分子育種和離體培養(yǎng)技術(shù)，抗病選育出的品種具有綠色環(huán)保、遺傳穩(wěn)定及效果優(yōu)異的特點(diǎn)。優(yōu)良品種培育是進(jìn)一步發(fā)展藥用植物栽培的重要前提。培育新型抗病品種是解決黑斑病的根本辦法。

3.1 常規(guī)育種對黑斑病的防治

常規(guī)育種（traditional breeding）是育種工作中常用的傳統(tǒng)育種技術(shù)方法。主要包括選擇育種、雜交育種、誘變育種、離體組織培養(yǎng)育種和多倍體育種等。

藥用植物生長周期普遍較長，育種基礎(chǔ)薄弱，馴化程度低、栽培條件苛刻[30]，其穩(wěn)定的品系種質(zhì)資源少，野生資源雜合度高，開展抗病育種工作尤為困難。楊濤等[31]對三七抗病植株篩選方法進(jìn)行了優(yōu)化，表示離體葉片接種法有望在藥用植物中用于篩選抗病植株，可用于開展今后的育種工作。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、集安市人參研究所和康美新開河（吉林）藥業(yè)有限公司等單位從1981年開始?xì)v經(jīng)32年選育出中抗黑斑病且高產(chǎn)的‘新開河1號’[32]。益盛藥業(yè)與吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)于2013年聯(lián)合選育的‘益盛漢參1號’，抗病能力強(qiáng)，適于在吉林省白山、通化地區(qū)推廣種植。Kim等[33]采用純種選育方法鑒定了一個(gè)抗逆性增強(qiáng)的人參品種‘Kowon’，并通過8年的培育和5年的試驗(yàn)確定該品種具有較強(qiáng)的抗黑斑病能力和高產(chǎn)能力。韓國于2013年選育出品種‘Cheonryang’[34]，抗逆性強(qiáng)，對鏈格孢引起的人參黑斑病具有一定的抵抗能力。

相對于藥用植物，大田作物生長周期短，常規(guī)育種工作開展較為順利。石慶娜等[35]以2個(gè)自交不親和系DS96-7和DS99-13為親本配置成秋大白菜雜交種‘秦白80’，抗黑斑病且產(chǎn)量高?？蒲腥藛T經(jīng)對番木瓜[36]研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)良品種SS72/12自交和雜交均可獲得對黑斑病抗性較強(qiáng)的品種。歐承剛等[37]采用加性顯性遺傳模型，研究發(fā)病時(shí)期黑斑病抗性的動(dòng)態(tài)遺傳規(guī)律，獲得了可以顯著增加后代黑斑病抗性的親本材料。大田植物抗病植株篩選及抗病育種研究工作的進(jìn)行，為藥用植物抗黑斑病育種工作提供了參考與借鑒作用，為藥用植物抗病育種工作的開展打下了良好的基礎(chǔ)。

3.2 現(xiàn)代分子育種對黑斑病的防治

常規(guī)育種在育種工作中占有重要地位，培育出了許多性狀穩(wěn)定且純度高的優(yōu)良品種，但常規(guī)育種的育種周期長，在抗病性狀方面過度依賴于自然環(huán)境選擇，僅利用常規(guī)育種手段很難在抗病育種上取得突破。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代分子育種技術(shù)在動(dòng)植物育種領(lǐng)域得到大量應(yīng)用，人們逐漸將目光滲透到植物體內(nèi)，研究其抗病的本質(zhì)，篩選植物抗黑斑病的基因。

在人參抗病育種的研究中，尹銳[38]開展人參黑斑菌誘導(dǎo)人參抗病的機(jī)制及其分子檢測方面的研究，通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)θ藚⒑诎呔秩救藚⑷~片Pg NBS基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，獲得了系列差異基因，發(fā)現(xiàn)一些對人參黑斑菌脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的Pg NBS基因，這些基因可作為抗黑斑病的候選基因，為人參抗黑斑病育種和人參黑斑病的防治提供科學(xué)依據(jù)。Wang等[39]利用病程相關(guān)蛋白（PR）的5個(gè)編碼基因?qū)θ藚⑵贩NK-1擴(kuò)增，進(jìn)行多態(tài)性挖掘，結(jié)果在品種K-1的PR5基因中發(fā)現(xiàn)了一種能將天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺的編碼SNP，氨基酸殘基的修飾改變了PR5蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。該SNP標(biāo)記能有效的特異性鑒別K-1和其他品種。生物信息學(xué)分析表明，該突變位點(diǎn)對PR5蛋白結(jié)構(gòu)的改變，可能會(huì)影響其抗病性。張蕾等[40]克隆了一個(gè)在林下參中高表達(dá)的基因g38，可用于提高人參的抗病性能。

三七作為人參屬五加科另一藥用植物，與人參具有較近的親緣關(guān)系，其黑斑病相關(guān)研究對人參黑斑病抗病育種具有重要意義。許振寧[41]對感染黑斑病不同時(shí)間點(diǎn)的三七葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PnCHI1基因參與三七對黑斑病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。陳瑞等[42]分析三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（Pn PGIP）基因表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)該基因在接種人參鏈格孢后顯著上調(diào)表達(dá)，并受幾種逆境脅迫相關(guān)信號分子的誘導(dǎo)，推測該基因可能參與了人參鏈格孢的防衛(wèi)反應(yīng)。Li等[43]將重組PnTLP2蛋白在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行黑斑病菌抑菌檢測發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑菌活性，將PnTLP2在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)增強(qiáng)了對人參鏈格孢的抗性，表明PnTLP基因是三七對三七黑斑病菌感染的防御相關(guān)基因。

相對于藥用植物，大田作物在分子育種方面的研究更加透徹，各種分子方法的運(yùn)用為人參抗黑斑病基因的挖掘提供借鑒。Liu等[44]通過對菊花及其黑斑病病原菌進(jìn)行雙物種動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組測序揭示了菊花與黑斑病菌的相互作用機(jī)制。Shingo等[45]對207個(gè)梨品種進(jìn)行了全面地接種測試和基因分型，確定了一個(gè)適用于黑斑抗性選擇的標(biāo)記集，并通過使用連鎖分析確定了中國梨黑斑病易感基因的位置。方婷[46]運(yùn)用qRT-PCR對苜蓿葉片中的基因進(jìn)行檢測，推測MnSOD、Cu-ZnSOD、NPR1及NPR1L等基因參與了紫花苜蓿對鏈格孢菌的早期抗性反應(yīng)。張真建[47]表示在不同的組織部位中木香花RbRdr1的表達(dá)量差異顯著，且在受黑斑病菌侵染后的不同時(shí)期，該基因的相對表達(dá)量均積極上調(diào)，表明該候選基因可能參與了黑斑病菌的互作過程。許高娟[48]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將hrfA基因轉(zhuǎn)入到菊花中，檢測發(fā)現(xiàn)基因hrfA能夠穩(wěn)定地遺傳并在轉(zhuǎn)錄水平上成功表達(dá)，獲得的17株具Km抗性的hrfA基因轉(zhuǎn)化株對黑斑病的抗性明顯提高。Yang等[49]通過自然感染和人工接種兩種方法評估了不同梨葉枯病菌基因型對黑斑病的抗性，結(jié)合SSR分子標(biāo)記篩選出6167B和15091C兩個(gè)抗病品種。王惠哲等[50]以黃瓜感染黑斑病分離群體為試材，將與黑斑病抗性相關(guān)基因連鎖的一個(gè)共顯性AFLP標(biāo)記E-CC/M-CAT進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以作為黃瓜抗黑斑病輔助選擇的標(biāo)記。

4 結(jié)語與展望

黑斑病作為藥用植物的一大病害，嚴(yán)重制約著人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。人參黑斑病目前已明確致病菌和田間發(fā)病情況，總結(jié)出系列降低黑斑病發(fā)病率的科學(xué)管理方法，發(fā)掘出諸多化學(xué)試劑、各類提取物及微生物菌劑用于黑斑病防治；人參黑斑病分子方面的研究也在轉(zhuǎn)基因和生物信息學(xué)手段的輔助下推測出了一些抗病相關(guān)的基因。但是人參黑斑病致病機(jī)制和人參抗黑斑病機(jī)制等問題尚未研究透徹，發(fā)掘出的候選基因的抗病性及抗病機(jī)理尚未明確，完全抗黑斑病的人參品種也還未被選育出來，人參黑斑病抗病育種工作任重而道遠(yuǎn)。為了更好地解決人參黑斑病問題，本研究認(rèn)為首先要探明人參黑斑病的致病原因和機(jī)理，從細(xì)胞層面研究黑斑菌毒素的作用；挖掘人參抗黑斑病的種質(zhì)資源，對人參抗感黑斑病的株系加以開發(fā)和利用，挖掘植株自身抗病基因并對抗病候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)明確基因功能，確定基因抗病機(jī)理；加強(qiáng)抗病基因連鎖性分析，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種，培育抗黑斑病品種，更好的防止人參黑斑病的發(fā)生，推進(jìn)人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展。