市售乳酸菌制品中乳酸菌耐藥基因分析

梁媛媛，黃甜甜，夏琪琪，楊云斌，劉鵬鵬*

1.浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司（杭州 310018）；2.浙江省市場(chǎng)監(jiān)管生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州 310018）；3.長興縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（湖州 313100）

乳酸菌是一類發(fā)酵糖類產(chǎn)物為乳酸的革蘭陽性菌，與維護(hù)腸道微生物平衡、提高機(jī)體免疫力、維持宿主健康密切相關(guān)[1]。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）將其評(píng)價(jià)為“普遍安全（generally regarded as safe，GRAS）”的一類。乳酸菌長期以來作為安全的無致病性的益生菌種被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品，如發(fā)酵酸奶、固體飲料、腸道微生態(tài)制劑等[2-3]。

近年來，隨著抗生素新品種的大量問世及抗菌藥物的大量使用，細(xì)菌耐藥性問題越發(fā)嚴(yán)重。早期的耐藥性研究主要集中在病原微生物領(lǐng)域[4-5]，近期關(guān)于乳酸菌的耐藥性所帶來的安全性問題引起廣泛關(guān)注[6-7]。FAO/WHO指出，隨著消費(fèi)者大量食用乳酸菌制品，存在的一種可能的危害是造成菌種攜帶的耐藥基因的轉(zhuǎn)移，即乳酸菌的耐藥性會(huì)通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體腸道[8]。在體內(nèi)形成耐藥基因庫，耐藥基因在致病菌和正常菌株之間無屏障傳遞，容易形成天然的耐藥基因池，導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，給疾病治療和生命安全帶來潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，也可能成為制約發(fā)酵乳制品行業(yè)發(fā)展的重大安全隱患[9-12]。因此，是否攜帶耐藥基因可成為乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)的依據(jù)之一。

β-內(nèi)酰胺類抗生素系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，其通過共價(jià)鍵與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，是臨床使用最為廣泛的一類抗生素，也是目前研究報(bào)道中耐受性較普遍存在的一類抗生素。有報(bào)道表明，在生產(chǎn)乳制品用的乳桿菌、嗜熱鏈球菌等菌株中檢測(cè)到對(duì)相關(guān)抗生素的耐藥性[13-16]，β-內(nèi)酰胺酶基因作為耐藥性基因則鮮有檢出。鑒于此，試驗(yàn)對(duì)市售乳酸菌制品中添加的活菌數(shù)量和菌種進(jìn)行分析鑒定，同時(shí)考察β-內(nèi)酰胺酶基因blaZ在這些菌株中的分布和多重耐藥基因的情況，從而為市售乳酸菌制品的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

隨機(jī)選取國內(nèi)市售發(fā)酵乳、乳酸菌飲品等77批乳酸菌制品，用瓊脂平板稀釋法對(duì)樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

嗜熱鏈球菌、乳桿菌、雙歧桿菌（均采用MRS瓊脂，北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；莫匹羅星、半胱氨酸鹽酸鹽（均為青島海博生物技術(shù)有限公司）；DL500 DNA Marker、10×TBE緩沖溶液（Tris-EDTA）、1 000×D-HelixRed核酸染料和雙蒸餾水（ddH2O）[均為寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×PCR Taq Mix預(yù)混液（北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司）；瓊脂糖（Agarose Regular）、PCR引物、DNA測(cè)序、2×高保真PCR Mix預(yù)混液和陽性質(zhì)粒[均為生工生物工程（上海）有限公司]。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Anoxomat MARK Ⅱ智能厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)（美國Gene Science公司）；Beckman Microfuge 16臺(tái)式微量離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Nano-300超微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）；D1200板式加熱器（美國Labnet’s公司）；ABI Veriti梯度PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Powerpac HC 1645052伯樂高流核酸電泳儀、Gel-Doc-XR+凝膠成像系統(tǒng)（均為美國Bio-Rad公司）；VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離和培養(yǎng)

乳酸菌制品中的乳酸菌菌株培養(yǎng)按照GB 4789.34—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)》和GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

乳酸菌的快速鑒定采用激光解析電離飛行質(zhì)譜VITEK MS進(jìn)行。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，點(diǎn)在樣品靶板孔中，涂抹均勻并在室溫自然晾干。吸取1 μL基質(zhì)CHCA溶液與樣品混合，自然晾干，形成結(jié)晶，上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

參考NCBI數(shù)據(jù)庫blaZ基因（基因庫序列號(hào)MT906815.1），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物blaZ-F和下游引物blaZ-R；實(shí)驗(yàn)室自行合成鏈霉素耐藥基因strA、strB，四環(huán)素耐藥基因tetM、tetK，卡那霉素耐藥基因aph3-Ⅲa和萬古霉素耐藥基因vanX，引物序列如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增耐藥基因所用引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.2.4 樣品DNA提取

將培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用接種環(huán)5 μL接種環(huán)收集一環(huán)菌落，DNA提取方法參考天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2.5 PCR反應(yīng)體系和程序

反應(yīng)體系：2×PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，挑取單菌落作為DNA模板或者取DNA（10～50 ng/μL）1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，反應(yīng)結(jié)束4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌樣品活菌計(jì)數(shù)

共采集包括發(fā)酵乳、固體飲料等在內(nèi)的市售乳制品樣品77批。每批樣品按照國標(biāo)方法進(jìn)行乳酸菌的培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示。77批樣品中76批樣品添加活菌數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求或者超過標(biāo)識(shí)菌數(shù)。據(jù)Morovic等[21]報(bào)道，67.3%的市售益生菌制品（n=50）在保質(zhì)期內(nèi)經(jīng)活菌計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加的益生菌活菌數(shù)均符合或超過商品標(biāo)識(shí)菌種數(shù)，其余樣品的活菌計(jì)數(shù)值均低于標(biāo)識(shí)。在國內(nèi)，王綺等[22]利用傅里葉變換近紅外分析儀與紫外-可見分光光度計(jì)結(jié)合快速測(cè)定市售145個(gè)乳酸菌樣品，活菌數(shù)均超過國家標(biāo)準(zhǔn)（106CFU/mL），與試驗(yàn)數(shù)據(jù)較為接近。

圖1 乳酸菌制品活菌數(shù)與標(biāo)識(shí)菌數(shù)的比較

2.2 耐藥基因分析

通過隨機(jī)挑選涵蓋77個(gè)樣品的640個(gè)菌落進(jìn)行PCR初步鑒定，得到一批攜帶耐藥基因blaZ的可疑陽性菌。擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取可疑陽性菌菌株的基因組gDNA，利用高保真Taq酶再次進(jìn)行耐藥基因的PCR鑒定，篩選出攜帶blaZ的菌株47株。結(jié)果如表2所示，47株乳酸菌均攜帶耐藥基因blaZ，檢出率為7.34%。其中，24株菌（51.06%）經(jīng)鑒定只攜帶blaZ，18株菌（38.29%）含有雙重耐藥基因blaZ和tetM，2株菌含有雙重耐藥基因blaZ和aph3-Ⅲa，3株（6.38%）攜帶含有三重耐藥基因blaZ、tetM和aph3-Ⅲa。另外，試驗(yàn)用同樣方法進(jìn)行表1中其他耐藥基因的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈霉素抗性基因（strA和strB）、四環(huán)素抗性基因（tetK）及萬古霉素抗性基因（vanX）在試驗(yàn)中均未檢出。

表2 乳酸菌菌種及其攜帶的耐藥基因

接表2

2.3 菌株鑒定

對(duì)攜帶blaZ耐藥基因的47個(gè)菌株采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果表明blaZ陽性菌株均為樣品中標(biāo)識(shí)添加的乳酸菌（圖2）。攜帶耐藥基因blaZ的陽性菌主要集中在嗜熱鏈球菌（63.83%），其次是副干酪乳桿菌（17.02%）和動(dòng)物雙歧桿菌（14.89%），鼠李糖乳桿菌則攜帶blaZ基因的情況較少（4.26%）。對(duì)blaZ陽性菌株是否攜帶其他抗生素耐藥基因也進(jìn)行鑒定和分析。通過各耐藥基因相對(duì)豐度的比較結(jié)果（表2、圖3）可以看出，所有類型的乳酸菌中，數(shù)量?jī)H次于blaZ基因的是氨基糖苷類耐藥基因aph3-Ⅲa，攜帶最少的是四環(huán)素類耐藥基因tetM。含有三重耐藥基因的3株菌分別是嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌（表2）。

圖2 飛行質(zhì)譜鑒定菌種組成

圖3 耐藥基因組成的相對(duì)豐度分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)隨機(jī)選取的市售乳酸菌制品樣品（n=77）進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示共計(jì)76份樣品添加活菌數(shù)超過標(biāo)準(zhǔn)要求或者商品標(biāo)識(shí)菌種數(shù)，合格率為98.70%。這表明我國對(duì)乳酸菌市場(chǎng)加強(qiáng)行業(yè)監(jiān)管已初見成效，但仍存在個(gè)別乳酸菌制品的活菌數(shù)添加不符合要求的現(xiàn)象。試驗(yàn)以市售乳酸菌制品為研究對(duì)象，調(diào)查發(fā)現(xiàn)耐藥基因blaZ在樣品中的檢出率為28.57%。氨基糖苷類耐藥基因aph3-Ⅲa在研究中也有檢出，47株blaZ陽性乳酸菌菌株中檢出率為44.68%。四環(huán)素耐藥基因tetM和tetK的鑒定中，前者在此次調(diào)查中有檢出（10.64%），即5株blaZ陽性乳酸菌菌株中有檢出tetM，而后者在試驗(yàn)中未檢出。

通過對(duì)市售乳酸菌制品中的乳酸菌活菌添加情況的調(diào)查及耐藥基因的鑒定和分析顯示，市售乳酸菌制品添加活菌數(shù)基本符合標(biāo)準(zhǔn)或者標(biāo)識(shí)要求。同時(shí)，乳酸菌菌種具有攜帶一種甚至多種耐藥基因的情況，可能成為耐藥基因的貯存庫，今后需要持續(xù)加強(qiáng)食用菌株安全性評(píng)價(jià)。試驗(yàn)受傳統(tǒng)PCR方法的局限，檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度均有待提高。另外據(jù)以往報(bào)道，耐藥基因和耐藥表型的關(guān)聯(lián)度較低。因此，對(duì)乳酸菌制品中的菌株耐藥表型及其耐藥機(jī)理展開調(diào)查將成為今后工作的主要方向。