乳鐵蛋白雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

豐東升，馬穎清，陳柔含，楊曉君，韓奕奕，張維誼

上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心（上海 201708）

乳鐵蛋白主要存在于人和動物的乳汁中，提取物多呈凍干粉狀態(tài)，蛋白含量大于97%。乳鐵蛋白對鐵離子的親和性非常高[1]，對熱比較敏感，但在一定pH條件下，又具有一定穩(wěn)定性[2]。它屬于一種堿性蛋白，具有多種生物學(xué)功能，主要作用為促進(jìn)鐵的吸收、抗菌殺菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等[3-6]。由于功能豐富且安全性高，近年來，乳鐵蛋白在許多國家和地區(qū)的食品領(lǐng)域開始得到廣泛應(yīng)用[7-8]。牛奶是獲取乳鐵蛋白最直接便捷的途徑，為提高乳鐵蛋白提取量，減少牛奶加工過程造成的損失，需要建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的方法對生鮮乳及乳制品中乳鐵蛋白進(jìn)行定量測定。

乳鐵蛋白常見的檢測方法包括高效液相色譜法（HPLC）、電泳法、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）等。HPLC法是檢測機(jī)構(gòu)采用最多的檢測方法，檢測結(jié)果精準(zhǔn)且重復(fù)性高，但檢測時間較長，對樣品的純度要求高[9-10]。電泳法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，但操作繁瑣，用時長[11]。ELISA法是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用相結(jié)合的一種新型的免疫學(xué)分析方法[12-14]。ELISA法主要包括直接競爭ELISA法、間接競爭ELISA法與雙抗夾心ELISA法[13,15]。該方法能夠快速對乳鐵蛋白進(jìn)行定量檢測，檢測靈敏度高，操作便捷，可用于高通量樣本地篩選檢測[16-17]。

試驗利用細(xì)胞融合技術(shù)獲取18株抗乳鐵蛋白的單克隆抗體，并對其效價、亞型、抗原定位等各項指標(biāo)進(jìn)行測定，并以大分子為抗原蛋白，經(jīng)3次免疫和加強(qiáng)免疫后，獲得效價較高的抗乳鐵蛋白多克隆抗體；利用試驗獲得的單克隆抗體和多克隆抗體，旨在建立一種以抗牛乳鐵蛋白包被酶標(biāo)板，抗牛乳鐵蛋白單抗FL8作為檢測抗體的雙抗體夾心的ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和設(shè)備

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、DMEM培養(yǎng)基、弗氏不完全佐劑、胎牛血清、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等（均購自Sigma公司）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京西美杰）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；Protein G小柱（GE Healthcare）。

滅菌鍋（蘇州博訊，YXQ-LS-50A）；酶標(biāo)儀（Thermo，MultiskanFc）；分析天平（上海天美，F(xiàn)A1603C）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo，311）；洗板機(jī)（南京德鐵 ，HBS-4011）；電熱恒溫水浴鍋和干燥箱（天津諾宏儀器，101-2BS）。

1.2 試驗動物

4只雌性BALB/c小鼠（6周齡，編號1～4）、1只雌性新西蘭大白兔（2月齡），購自常州卡文斯。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗原的制備

在分析天平上，精確稱取10 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL超純水中，150 μL分裝后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動物免疫

1.3.2.1 小鼠免疫

取6周齡雌性BALB/c小鼠4只進(jìn)行免疫，共進(jìn)行3次免疫。每次每只小鼠抗原免疫用量為25 μg，具體免疫程序見表1。第2次免疫后10 d尾靜脈采血，通過ELISA間接法測抗體效價，確定是否有針對抗原的抗體生成。效價不達(dá)標(biāo)，則第3次繼續(xù)弗氏不完全佐劑皮下進(jìn)行免疫。

表1 小鼠免疫程序

1.3.2.2 兔免疫

取2月齡雌性新西蘭大白兔1只進(jìn)行免疫，共進(jìn)行3次免疫，每次每只新西蘭大白兔抗原免疫用量為500 μg，具體免疫程序見表2。第2次免疫后14 d靜脈采血，通過ELISA間接法測抗血清效價，以此確定是否有針對目標(biāo)的抗體生成。加強(qiáng)免疫14 d后取血。

表2 兔免疫程序

1.3.3 血清效價的測定

血清效價的測定采樣常規(guī)間接ELISA法，具體如下：（1）乳鐵蛋白抗原經(jīng)包被緩沖液稀釋成1 μg/mL后，取100 μL加入每個酶標(biāo)板孔中，置于4 ℃，過夜。（2）取出所需要的酶標(biāo)板條，洗滌甩干后，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃恒溫避光孵育2 h。（3）洗板后加入待測血清，待測血清用洗液梯度稀釋成1∶100，1∶1 000，1∶3 000，1∶9 000，1∶27 000，1∶81 000和1∶243 000共7個梯度，空白對照為洗液，每孔中加入100 μL樣品，恒溫孵育45 min。（4）洗板后，每孔加入100 μL封閉液稀釋過的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，恒溫孵育30 min。（5）洗板后，每孔加入100 μL底物顯色液，恒溫孵育10～15 min。（6）每孔加入50 μL H2SO4（2 mol/L），終止反應(yīng)。（7）檢測波長450 nm下的OD值，檢測孔吸光度記作P，對照孔吸光度記作N，以P/N≥2.1為待測血清的效價。

1.3.4 細(xì)胞融合

選取生長狀態(tài)良好和效價較高的6周齡健康雌性小鼠，融合前3 d，用抗原直接加強(qiáng)免疫1次，劑量同前。腹腔注射0.5 mL液體石蠟致敏，1～2周后，每只小鼠腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，制備腹水待用。

1.3.5 抗體純化

單抗腹水和多抗血清均采用飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，具體操作為：常溫條件下4 000 r/min離心15 min后取上清液，4 ℃下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，攪拌30 min后高速離心（13 000 r/min，4 ℃）后棄上清；沉淀重懸于PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）；繼續(xù)逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33%，重復(fù)上述步驟，沉淀溶于適量的PBS緩沖液，置于4 ℃透析過夜。選用Protein G小柱純化，純化后的抗體通過BCA法測定蛋白濃度。

1.3.6 抗體特性的測定

單克隆抗體特性的測定主要包括抗體亞型和定位的鑒定及抗體效價的測定。其中，小鼠抗體亞型的測定是通過抗體亞型鑒定試劑盒?？贵w效價的測定采用間接ELISA方法。多克隆抗體特性的測定主要是抗體效價的測定。

1.3.7 雙抗體夾心ELISA檢測體系的篩選

通過雙抗體夾心的ELISA方法對制備得到的抗體進(jìn)行篩選，篩選出可以配對的抗體對。具體操作如下：

（1）用碳酸鹽緩沖液（CB）將包被抗體稀釋至5 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h。

（2）洗板3～5次，拍干后加入陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照，每孔100 μL，25 ℃反應(yīng)45 min。

（3）洗板3～5次，拍干，多抗稀釋一定倍數(shù)，每孔100 μL，25 ℃反應(yīng)45 min。

（4）洗板3～5次，拍干，加入羊抗兔酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，25 ℃反應(yīng)30 min。

（5）洗板3～5次，拍干，加入顯色劑，25 ℃避光反應(yīng)15 min。

（6）加入100 μL終止液，讀取450 nm和630 nm處的吸光度。

1.3.8 特異性測定

按最優(yōu)化的試驗條件，將乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成0，1，10，100和1 000 ng/mL，按照雙抗體夾心試驗的步驟進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫小鼠血清效價測定

間接ELISA方法測定的小鼠血清效價結(jié)果見表3。4只小鼠血清效價均達(dá)1∶2.43×105。最終選擇生長狀態(tài)最好和效價較高的1號小鼠用于細(xì)胞融合。

表3 血清效價測定

2.2 抗LF單克隆雜交瘤細(xì)胞株的建立

細(xì)胞融合7 d后，培養(yǎng)板孔底長出肉眼可見的單克隆，通過ELISA間接法對所有細(xì)胞孔進(jìn)行初篩，挑選出強(qiáng)陽性的細(xì)胞立即在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)和克隆化。最終得到18株能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后保存于液氮。

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法，對18株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體的制備，最終獲得18種腹水抗體，編號1～18號。

2.3 單克隆抗體特性測定

2.3.1 單克隆抗體亞型的測定

對18株抗LF抗體進(jìn)行亞型測定的結(jié)果如表4，測定數(shù)據(jù)顯示，18株抗體與IgG1反應(yīng)較大，而與IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA基本上無反應(yīng)，因此這18株抗體亞型均為IgG1型。其中，2、3、6、11、15、18號抗體在λ鏈，10號抗體既不在λ鏈也不在κ鏈，其余抗體均在κ鏈。

表4 單克隆抗體亞型測定

2.3.2 單克隆抗體效價測定

收集18株雜交瘤細(xì)胞，制備并收集小鼠腹水，以LF標(biāo)準(zhǔn)品包被酶標(biāo)板，包被質(zhì)量濃度為1 μg/mL，采用ELISA間接法測定抗體效價，效價檢測數(shù)據(jù)見表5。其中，6號抗體效價為1∶1 000，10號抗體效價為1∶1.6×104，7、17、18號抗體效價為1∶6.4×104，其他抗體效價均達(dá)1∶2.56×105。

表5 抗體效價特性測定

接表5

2.4 多克隆抗體特性測定

經(jīng)過4次免疫，采血，離心獲得多抗血清，間接ELISA法測定兔多抗血清的效價結(jié)果見表3，LF抗原對新西蘭大白兔的免疫效果很好，免疫效價達(dá)1∶2.43×105。多抗血清經(jīng)飽和硫酸銨法純化后凍干，備用。

2.5 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

2.5.1 單抗對多抗配對篩選

通過雙抗體夾心的ELISA方法對制備得到的抗體進(jìn)行篩選，篩選出6對配對效果較好、背景較低的腹水，結(jié)果如表6所示。4號和8號腹水與多抗配對，靈敏度較高，且背景較低；對這2組配對進(jìn)行條件優(yōu)化及曲線標(biāo)定。

表6 單抗與多抗配對結(jié)果

2.5.2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

試驗按照雙抗體夾心ELISA的操作步驟對一系列稀釋的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測定，以O(shè)D450nm的值為縱坐標(biāo)，以乳鐵蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，4號和8號腹水得到線性方程見表7。4號腹水試驗結(jié)果顯示，不同比例稀釋多抗條件下，0.05～3.2 ng/mL之間均可以呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，而且檢測抗體使用的稀釋倍數(shù)越高，試驗背景值越低，檢測限為0.05 ng/mL。8號腹水結(jié)果與5號結(jié)果相同，最適檢測范圍為0.05～3.2 ng/mL，在該范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。最終選用8號單克隆抗體作為包被抗體，命名為FL8，建立牛乳鐵蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測方法。

表7 ELISA試劑盒條件優(yōu)化

2.5.3 特異性測定結(jié)果

試驗按照雙抗體夾心ELISA方法對乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行測定，結(jié)果如表8所示。酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的吸光度值結(jié)果顯示，試驗建立的ELISA試劑盒特異性較好。

表8 檢測體系特異性測定（吸光度）

3 結(jié)論

試驗利用雜交瘤技術(shù)獲得18株抗牛乳鐵蛋白雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)而制備18株細(xì)胞的腹水，并采用飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，對18株單抗的效價、亞型、抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分類鑒定。最終建立及優(yōu)化檢測LF含量的雙抗夾心ELISA檢測方法，檢測限可達(dá)0.05 ng/mL，靈敏度高。