液質(zhì)聯(lián)用法測定食品中罌粟堿的不確定度評定

陳夢，張維波，王偉影，范蕾，章小洪，何志豪

麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院（麗水 323000）

罌粟殼是罌粟科植物罌粟干燥成熟后的果實[1]，含有20多種生物堿[2]，屬于國家管制藥品，部分不良商家為牟取暴利會在食品中添加罌粟殼[3-5]，長期食用添加罌粟殼的食物容易上癮，嚴重時還會引起精神失常，窒息死亡等[6-7]。早在2016年罌粟殼就已被中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》[8-9]，但是目前食品中罌粟殼生物堿的檢測方法尚無國家標準[10]，給食品監(jiān)管工作帶來了一定的困難，現(xiàn)采用的法定檢測方法為2018年市場監(jiān)管總局發(fā)布的《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》[11]。目前尚未發(fā)現(xiàn)采用同位素內(nèi)標法測定5種生物堿的不確定度評定報道。準確測定生物堿含量，對保障食品安全具有重要意義。此次試驗依據(jù)BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》、CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[12]、JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]和JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[14]等標準，對同位素內(nèi)標-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定食品中5種生物堿的不確定度進行分析與評定，旨在提高檢驗結果的準確性，為與之相關的司法裁決、行政處罰等提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TQ Detector高效液相色譜-質(zhì)譜儀（配ESI源，美國Waters公司）；Direct Pro超純水機（德國Think-lab公司）；KQ-250DE超聲清洗器（昆山超聲儀器公司）；ST16高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；Micro17高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；MS3 basic渦旋（德國IKA公司）。

嗎啡（含量：50.0 mg/L；不確定度：2.5 mg/L）、可待因（含量：50.0 mg/L；不確定度：2.5 mg/L）、罌粟堿（含量：10.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、那可?。ê浚?0.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、蒂巴因（含量：10.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、嗎啡-D3（含量：20.0 mg/L；不確定度：1.0 mg/L）、可待因-D3（含量：20.0 mg/L；不確定度：1.0 mg/L），混合標準品溶液購于上海安譜公司；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；鹽酸（優(yōu)級純，四川西隴公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；甲酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉混合粉末（分析純，上海安譜公司）；有機相濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）于離心管中，加入60 μL同位素內(nèi)標工作液（5.0 μg/mL），加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，渦旋振蕩30 s，準確移入15 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，取出加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，渦旋振蕩2 min，按5 000 r/min離心5 min，取部分上清液過有機相濾膜，供液相-質(zhì)譜儀進行測定。

1.2.2 標準溶液的配制

準確移取1.0 mL生物堿混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，作為混合標準品溶液。準確移取1.25 mL可待因-D3、嗎啡-D3內(nèi)標溶液于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，作為混合內(nèi)標溶液。分別準確吸取20，40，100，200，400和1 000 μL混合標準品溶液于20 mL容量瓶中，再分別準確加入80 μL混合內(nèi)標溶液，用乙腈定容至刻度，搖勻，作為標準工作溶液。罌粟堿、那可丁、蒂巴因的質(zhì)量濃度為1，2，5，10和50 ng/mL，嗎啡、可待因的質(zhì)量濃度為5，10，25，50和250 ng/mL，可待因-D3、嗎啡-D3的質(zhì)量濃度為20 ng/mL。

1.2.3 儀器條件

1) 色譜條件

色譜柱：HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2) 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：負離子；載氣：高純氮氣；碰撞氣：高純氬氣；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；離子源溫度：150 ℃；檢測方式：多反應監(jiān)測；其他參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 不確定度數(shù)學模型建立

食品中5種生物堿含量按式（1）計算。

式中：X為供試品中待測組分的含量，μg/kg；A為罌粟堿、那可丁、蒂巴因為待測組分的峰面積，嗎啡、可待因為待測組分與內(nèi)標物組分峰面積的比值；Cs為對照品溶液中待測組分的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，mL；m為樣品質(zhì)量，g；R為待測組分的回收率；As為罌粟堿、蒂巴因、那可丁為待測組分的峰面積，嗎啡、可待因為待測組分與內(nèi)標物組分峰面積的比值。

2 不確定度來源分析及評定

2.1 不確定度來源分析

依據(jù)標準方法及數(shù)學模型，5種生物堿含量不確定度分量主要來源為：Urel(1)樣品稱量引入；Urel(2)樣品定容引入；Urel(3)標準物質(zhì)引入；Urel(4)內(nèi)標物質(zhì)引入；Urel(5)回收率引入；Urel(6)測量重復性引入，合成為

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

2.2.2 樣品定容引入的不確定度

樣品定容過程不確定度主要來源于玻璃量器體積校準和環(huán)境溫度變化，單標線15 mL移液管允許誤差為±0.025 mL，按矩形分布，不確定度為：溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3，不確定度為：U(2.2)=15×2×樣品定容引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 標準物質(zhì)、內(nèi)標物質(zhì)引入的不確定度

1) 標準物質(zhì)純度引入的不確定度：嗎啡、可待因擴展不確定度2.5 mg/L（k=2），罌粟堿、那可丁、蒂巴因擴展不確定度0.5 mg/L（k=2），標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度為：U(3.1)=u/(p×2)，見表3。

表3 標準物質(zhì)純度的相對標準不確定度

2) 內(nèi)標物質(zhì)純度引入的不確定度：嗎啡-D3、可待因-D3擴展不確定度1.0 mg/L（k=2），標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度為：U(3.2)=1/(20×2)=0.025 0。

3) 標準物質(zhì)稀釋過程引入的不確定度：A級10 mL容量瓶、單標線1 mL移液管允許誤差分別為±0.020 mL、±0.007 mL，按矩形分布，不確定度為：0.004 04 mL，溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3，不確定度為：0.015 8 mL和標準品溶液定容產(chǎn)生的相對標準不確定度為：U(3.7)=4.76×10-3。

4) 內(nèi)標物質(zhì)稀釋過程引入的不確定度：A級5 mL容量瓶、2 mL刻度液管，允許誤差分別為±0.020 mL和±0.012 mL，按矩形分布，不確定度為：mL，溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3，不確定度為：0.007 91 mL和mL，內(nèi)標定容產(chǎn)生的相對標準不確定度為：U(3.12)=6.41×10-3。

5) 標準工作曲線配制引入的不確定度：分別移取20，40，100，200，400和1 000 μL混合標準溶液于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到標準工作曲線溶液。根據(jù)移液器檢定規(guī)程要求，假設均勻分布，引入的不確定度見表4，合成相對標準不確定度為：

表4 標準工作曲線配制引入的不確定度

6) 標準曲線擬合引入的不確定度：

罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標法計算，嗎啡和可待因采用內(nèi)標法計算，標準曲線工作溶液的分別測定1次，外標法以待測組分色譜峰的峰面積為縱坐標，內(nèi)標法以待測組分與內(nèi)標物組分峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，最小二乘法進行擬合，計算標準曲線的殘差標準差s=校準曲線測定次數(shù)；a：校準曲線斜率；b：校準曲線截距；xi：標準曲線濃度；yi：外標法為不同濃度對應的待測組分峰面積，內(nèi)標法為待測組分與內(nèi)標物組分峰面積比值），具體見表6。

表5 標準工作曲線相關信息

對上述標準物質(zhì)不確定度進行合成，得到相對合成標準不確定度Urel(3)，詳見表6。

表6 標準物質(zhì)的相對標準不確定度

2.2.4 添加內(nèi)標物質(zhì)引入的不確定度

1) 樣品添加內(nèi)標物引入的不確定度：樣品前處理過程中5 μg/mL內(nèi)標工作液加入體積為60 μL，根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[15]可知，100 μL移液槍允許誤差為3.0%（參考50 μL檢定點），按均勻分布處理，體積引入的不確定度為U(4.1)=0.1×0.03/=1.73×10-3mL。溫度范圍20±2 ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3，假設按矩形分布，k=溫度引入的不確定度為U(4.2)=0.06×2×1.37×相對不確定度為U(4.3)=

2) 標準工作曲線溶液添加內(nèi)標物引入的不確定度：內(nèi)標工作液加入量為80 μL，100 μL移液槍允許誤差為2.0%（參考100 μL檢定點），按均勻分布處理，體積引入的不確定度為U(4.4)=0.1×0.02/=1.15×10-3mL。溫度范圍20±2 ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3，假設按矩形分布，溫度引入的不確定度為U(4.5)=0.08×2×1.37×相對不確定度為U(4.6)=內(nèi) 標 物引入的相對不確定度為：0.032 3。

2.2.5 回收率引入的不確定度

空白加標樣品經(jīng)1.2.1小節(jié)處理后得到上清液，嗎啡、可待因的加標水平為93.75 μg/kg，罌粟堿、那可丁和蒂巴因的加標水平為18.75 μg/kg，共平行加標6份，測定回收率，并計算相對標準不確定度：結果見表7。對回收率進行顯著性檢驗分析，當自由度f=4時，查t臨界值分布表，t（0.05, 4）=2.776，t＞t（0.05, 4），回收率具有顯著性，因此，考慮其引入的不確定度。

表7 樣品回收率

2.2.6 測量重復性引入的不確定度

試驗將過程中的隨機影響合并為測量重復性，重復測定6次空白加標樣品，計算重復性引入的相對不確定度：見表8。

表8 樣品數(shù)據(jù)

2.3 合成標準不確定度評定

Urel=相對不確定度合成見表9。假定置信概率P為95%，取包含因子k=2，含量測定結果表示為罌粟堿16.84±1.94 μg/kg，那可丁15.74±1.50 μg/kg，蒂巴因15.33±1.67 μg/kg，嗎啡78.37±10.6 μg/kg，可待因75.27±10.0 μg/kg。

表9 相對標準不確定度

3 結論

試驗依據(jù)BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》測定食品中5種生物堿的含量，通過對各分量不確定度的分析，其擴展不確定度為罌粟堿X=16.84±1.94 μg/kg，那可丁X=15.74±1.50 μg/kg，蒂巴因X=15.33±1.67 μg/kg，嗎啡X=78.37±10.6 μg/kg，可待因X=75.27±10.0 μg/kg，k=2。該方法的不確定度主要來源于標準品的純度、標準溶液的配制以及標準工作曲線的擬合，在日常檢驗工作中可以通過選擇高純度標準品、優(yōu)化標準溶液的配制、增加標準溶液的測定次數(shù)等方法來提高檢測數(shù)據(jù)的準確性。