QuEChERS-UPLC-MS/MS測定宣威火腿中氯霉素殘留量

賈巧莉，陳雪霞，解粉蓮，張舒婷，趙叢叢

1.曲靖市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心（曲靖 655000）；2.云南省肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（曲靖 655000）；3.曲靖師范學(xué)院（曲靖 655011）

氯霉素具有良好的抗菌作用，被廣泛用于畜禽等養(yǎng)殖行業(yè)，治療各種動物性疾病，對人體造血系統(tǒng)的毒性極大，并容易引起再生障礙性貧血癥，可損害視力，引起急性中毒性表皮松懈癥。此外，氯霉素對老年人、新生兒、早產(chǎn)兒以及肝腎功能不全人群的影響更大[1-2]。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定氯霉素不得檢出[3]，但由于其生產(chǎn)工藝簡單、價格低廉、抑菌效果好，在養(yǎng)殖過程中的使用仍屢禁不止。宣威火腿以生長于云南滇東高原，長得膘肥肉厚的宣威生豬前腿或后腿為原料，以食鹽為主要腌制劑，傳統(tǒng)干腌火腿工藝制成，以其獨(dú)特的色、香、味、形而聞名于世[4]，從而對宣威火腿質(zhì)量安全提出更高的要求，建立可靠、快速靈敏的檢測方法監(jiān)測宣威火腿的氯霉素殘留量十分必要。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)研究蜂蜜、雞肉、蛋類、牛肉、水產(chǎn)品、乳制品中氯霉素殘留量較多[5-13]，相關(guān)文獻(xiàn)中，前處理方法主要采用免疫層析法[14]、液液萃取法[15]、固相萃取法[16-19]和分散固相萃取[20-21]，主要運(yùn)用液相色譜儀[22-24]、液質(zhì)聯(lián)用儀[25-27]，少部分運(yùn)用到氣質(zhì)聯(lián)用儀[28]進(jìn)行檢測。鮮有針對于宣威火腿中氯霉素殘留量的檢測文獻(xiàn)，文章以宣威火腿作為研究基質(zhì)，結(jié)合增強(qiáng)型脂質(zhì)去凈化管（Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid）和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，以期為快速檢測和監(jiān)管云南宣威火腿中氯霉素殘留提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣威火腿（20批，曲靖西苑小區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、曲靖河北商貿(mào)市場）。

甲醇中的氯霉素（chloramphenicol，CAP）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，1.2 mL，壇墨質(zhì)檢）；氘代氯霉素（CAP-D5）內(nèi)標(biāo)溶液（100 μg/mL，1.2 mL，壇墨質(zhì)檢）；增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（5982-1010，Agilent Bond Elut-Lipid，美國安捷倫科技公司）；反萃管（5982-0101，Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish，美國安捷倫科技公司）；Silibase? PSA固相萃取柱（500 mg/6 mL，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；NH2小柱（500 mg/6 mL，美國安捷倫科技公司）；HLB小柱（500 mg/6 mL，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；甲酸、乙腈、乙酸銨（色譜純，美國Fisher公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent ultra LC 1290-G6460B QQQ高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（德國安捷倫公司），配電噴霧離子源（ESI）；Milli-Q Advantage A10超級純水機(jī)（美國Millipore公司）；CT15RT臺式高速大容量冷凍離心機(jī)（湖南盧湘儀儀器有限公司）；MS3 basic漩渦混勻器（德國IKA公司）；CPA225D分析天平（德國賽多利斯）；HG211-BJBLAA-1000微孔溶劑過濾器（北京百萬電子科技有限公司）；直徑50 mm，孔徑0.2 μm有機(jī)系微孔過濾膜（天津津騰科技有限公司）；XTNS1氮吹儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：將0.1 mL 100 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇溶解并稀釋至10.0 mL，搖勻，質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，再用初始流動相配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別為0.5，5.0，10.0，20.0，25.0和50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1 mL 100 μg/mL氯霉素-D5，用甲醇溶解并稀釋至10.0 mL，搖勻，作為儲備液，質(zhì)量濃度為10 μg/mL，精密量取0.1 mL儲備液，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為中間液，然后精密量取2 mL儲備液，加甲醇溶解并稀釋至4 mL，搖勻，質(zhì)量濃度50 ng/mL作為內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)樣品至50 mL尖底具塞塑料離心管中，加入0.2 mL 50 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液，加入5 mL超純水，渦旋30 s，準(zhǔn)確加入10 mL 5%甲酸乙腈，渦旋分散2 min，按5 000 r/min，于4 ℃冷凍離心5 min，室溫靜置。將5 mL 5 mmol/L的乙酸銨緩沖液加入EMR-Lipid凈化管中，再移取5 mL上清液至凈化管中，立即渦旋混合1 min，使樣品充分分散，按5 000 r/min 4 ℃離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至15 mL反萃管，渦旋混勻1 min，按6 000 r/min 4 ℃離心10 min，再移取上清液至10 mL試管中，于40 ℃水浴氮吹濃縮至近干，加入1.00 mL初始流動相復(fù)溶，過0.2 μm微孔濾膜后上機(jī)測試。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

將儀器采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent MassHunter Quantitative Analysis（for QQQ）定性和定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以待測物的保留時間作為篩查基礎(chǔ)，以離子對響應(yīng)強(qiáng)度作為定性確證依據(jù)；通過內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將樣品中各待測物峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到定量結(jié)果。試驗(yàn)中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均重復(fù)測定6次。

1.3.4 超高效液相色譜及質(zhì)譜條件

（1）超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse-plus C18柱，1.8 μm，50 mm×2.1 mm；進(jìn)樣量5 μL；流動相：A為超純水，B為甲醇，比例為55∶45（V/V）；流速0.3 mL/min，柱溫：40 ℃。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣：氮?dú)?.0 mL/min；干燥氣：氮?dú)?0 mL/min；碰撞氣：氮?dú)?；噴霧電壓3 000 V，離子源溫度：320 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；駐留時間：11 ms；延遲時間3 ms；分辨率：unit。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為50 ng/mL的氯霉素及氯霉素-D5打進(jìn)質(zhì)譜，經(jīng)過調(diào)節(jié)雙重四極桿的各項(xiàng)參數(shù)，找到特征母離子和子離子，保留時間和質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 特征母離子和子離子，保留時間和質(zhì)譜條件參數(shù)

找到目標(biāo)化合物的分子離子峰。再進(jìn)行母離子掃描和子離子掃描找到碎片離子信息，最后確定目標(biāo)化合物，以達(dá)到質(zhì)譜條件最佳，見圖1。

圖1 氯霉素及氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖和離子選擇圖

2.2 樣品前處理優(yōu)化

獸藥殘留檢測采用的提取劑一般有乙酸乙酯、1%水-乙腈、1%乙酸-乙腈溶液、純乙腈、5%甲酸-乙腈提取，如GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》[29]。試驗(yàn)分別采用乙酸乙酯、1%水-乙腈、1%乙酸-乙腈溶液、純乙腈、5%甲酸-乙腈5種提取劑對宣威火腿氯霉素加標(biāo)樣品進(jìn)行提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乙酸乙酯作為提取劑時，干擾物質(zhì)比較多，經(jīng)過萃取管和反萃管均不能達(dá)到凈化的目的，用純乙腈和乙腈水溶液提取時提取液顏色較深，油脂比較多。1%乙酸乙腈溶液提取液的回收率低于5%甲酸乙腈的回收率。對于云南火腿來說，在加入乙腈提取劑前加入5.0 mL的水可以提高提取率，乙腈可以與樣品充分混合，最終5%甲酸乙腈的回收率較高為92.6%，其它均低于92.6%，見圖2，故試驗(yàn)采用5%甲酸乙腈為提取液。

圖2 5種提取劑對云南火腿中氯霉素回收率的影響

2.3 凈化條件的優(yōu)化

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，宣威火腿基質(zhì)相當(dāng)復(fù)雜，一方面是來自生產(chǎn)時添加的大量鹽等調(diào)味料，另一方面是腌制發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、核酸、胺類和氨類化合物、醇類化合物、糖類化合物，生物活性多肽，脂肪酶[30]，若不去除，會給氯霉素的檢測造成一定的基質(zhì)干擾，采用高效的樣品前處理方法至關(guān)重要。測定前需經(jīng)過凈化后才能進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較HLB小柱、NH2小柱、PSA、QuEChERS EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管4種凈化方式。以5.0 g空白的宣威火腿樣品加入0.5 mL的50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理方法處理，提取完后用4種方式分別凈化，以氯霉素回收率評價4種凈化效果。結(jié)果顯示，HLB和NH2操作過程相對繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，材料成本也相對較高，且在上樣及淋洗過程中容易產(chǎn)生吸附不完全而導(dǎo)致待測物損失，同時由于HLB小柱自身特點(diǎn)，對堿性多肽具有高的選擇性，對酸性多肽去除效果較弱，回收率約為65.4%；NH2小柱對磺酸根離子等強(qiáng)陰離子和糖類等高極性有機(jī)化合物效果，有較強(qiáng)的基質(zhì)干擾，回收率僅為55.7%。PSA固相萃取柱去除雜質(zhì)的能力有限，僅對非極性化合物和脂肪酸結(jié)構(gòu)的化合物有效，并且可能在復(fù)溶的過程中產(chǎn)生沉淀，造成氯霉素?fù)p失，回收率約為72.5%；增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管作為QuEChERS的改良方法，不僅具有快速、易操作的特點(diǎn)，對于宣威火腿樣品具有高效的凈化能力，能有效去除基質(zhì)效應(yīng)，回收率能達(dá)到92.1%，所以試驗(yàn)選擇增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管作為凈化方法。

2.4 液相色譜條件的確定

一般來說，在流動相中增加堿性物質(zhì)可以增強(qiáng)ESI-模式的離子化效果，另外，乙酸銨能調(diào)節(jié)pH，起緩沖鹽作用，也有助于離子化。試驗(yàn)比較了水、0.1%氨水、乙酸銨搭配甲醇或乙腈為流動相的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)超純水-甲醇的洗脫效果較好，能保證氯霉素及氯霉素-D5信號穩(wěn)定，目標(biāo)峰峰型對稱且收窄，而且也能節(jié)約試劑成本，故試驗(yàn)的流動相采用超純水-甲醇流動相組合。

2.5 方法線性范圍及檢出限

配制0.5，5.0，10.0，20.0，25.0和50.0 ng/mL 6個質(zhì)量濃度點(diǎn)，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度5 ng/mL，經(jīng)儀器分析后，以進(jìn)樣相對濃度X為橫坐標(biāo)，相對峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程，見圖3。以信噪比為3（rSN=3）計算檢出限，結(jié)果顯示氯霉素相關(guān)系數(shù)R2大于0.999，試驗(yàn)的樣品稱樣以5.0 g計，定容體積按1.0 mL計，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，氯霉素的檢出限質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，試驗(yàn)檢出限為0.06 μg/kg，定量限為0.18 μg/kg。

圖3 氯霉素校正曲線圖

2.6 回收率及精密度試驗(yàn)

稱取5.0 g宣威火腿空白試樣后，按照1.3.2小節(jié)方法操作，做添加回收試驗(yàn)，分別加入0.1，0.5和1.0 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液50 ng/mL，實(shí)際加入標(biāo)準(zhǔn)品的量為1.0，5.0和10.0 μg/kg，每份加標(biāo)樣平行測試6次，試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，方法的回收率為79.4%～108.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD為1.97%～5.85%，從表可看出試驗(yàn)所做的分析方法的準(zhǔn)確度、精密度均滿足要求。

表2 氯霉素回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.7 實(shí)際樣品測定

采用建立的方法對來自市場20份云南宣威火腿進(jìn)行氯霉素殘留量檢測，均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)用5%甲酸乙腈進(jìn)行提取，Bond Elut QuECh-ERS EMR-Lipid方式凈化，達(dá)到了很好的除雜效果，采用優(yōu)化后的方法對宣威火腿中的氯霉素殘留量進(jìn)行檢測，前處理簡單，提高了檢測效率，具有靈敏度高、檢出限低、基質(zhì)干擾少，精密度、準(zhǔn)確度和線性關(guān)系均能達(dá)到要求，建立宣威火腿氯霉素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，滿足對宣威火腿氯霉素殘留量監(jiān)督檢測要求。

研究優(yōu)化的方法對準(zhǔn)確檢測其它類火腿或肉制品中氯霉素殘留量有重要的參考意義，但與現(xiàn)階段多物質(zhì)獸藥殘留檢測相比，研究覆蓋面還不夠，為進(jìn)一步提高檢測效率，增加方法的實(shí)用性和適用性，下一步需在該方法的基礎(chǔ)上，繼續(xù)加強(qiáng)同時檢測不同基質(zhì)中氯霉素殘留和其他獸藥殘留的方法研究。