促進超聲波場中木瓜蛋白酶活力的工藝優(yōu)化

徐軻鵬 ，趙靜，唐月梅，王立博，鄒強，文永平*

1.成都大學食品與生物工程學院（成都 610016）；2.四川省輕工業(yè)研究設計院有限公司（成都 610000）

木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，對蛋白質(zhì)底物具有較強的水解能力[1]，因為其安全性高、易獲取、熱穩(wěn)定性強，在外源蛋白水解酶類市場中占據(jù)十分重要的地位[2]。木瓜蛋白酶用途廣泛，可作肉類嫩化劑、啤酒品質(zhì)改良劑、營養(yǎng)保健食品等[3]，根據(jù)2017年酶類市場的研究報道，其在食品加工方面的應用顯著領先其他植物來源的外源蛋白水解酶，并且其應用范圍有進一步擴展的趨勢[4]。李志遠等[5]通過對解凍過程中凍肉顯微結構的觀察發(fā)現(xiàn)，解凍溫度15 ℃左右時凍肉解組織恢復較好，食用品質(zhì)高，但木瓜蛋白酶適宜反應溫度較高，常溫（20 ℃）條件下催化活力不足最適溫度的10%，在一定程度上限制了木瓜蛋白酶在食品工業(yè)中的應用[6]。Fruton等[7]利用合成肽為底物，證明游離半胱氨酸可以顯著提高木瓜蛋白酶活力。Homaei等[8]通過酶動力學研究再次驗證，由一定量的半胱氨酸與木瓜蛋白酶形成的共固定化酶，相比單獨固定化木瓜蛋白酶，在低溫下具有較高的活性和穩(wěn)定性。超聲波作為一種新興物理手段，在食品工業(yè)應用廣泛[9]。黃六容等[10]通過試驗發(fā)現(xiàn)，用超聲波處理木瓜蛋白酶，其活力比對照組高9%，但隨超聲波處理時間的增加，其活力反而降低14.5%。

超聲波技術和游離半胱氨酸單獨對木瓜蛋白酶活力的影響被廣泛研究，兩者在較低溫度下對木瓜蛋白酶的活力都有一定增強效果。但超聲波協(xié)同半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響鮮有報道。鑒于此，試驗固定初始處理溫度20 ℃，以木瓜蛋白酶活力為評價指標，探討半胱氨酸及超聲波對其影響，在單因素試驗結果基礎上，應用響應面法分析超聲波時間、超聲波功率與游離半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響，探究最佳工藝參數(shù)，為木瓜蛋白酶在肉制品中的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

DHP-9162D恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；SB-5200DTDN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；UV1810S分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；Centrifuge 5804冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；HMS-901D磁力攪拌器（博大精科儀器廠）；HH-6恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗前處理

將0.1%的木瓜蛋白酶溶液置于超聲波清洗機內(nèi)，一起放置于恒溫培養(yǎng)箱中，確保試驗在（20±0.1）℃的條件下進行。

1.3.2 測定木瓜蛋白酶活力

根據(jù)張新燦等[11]的方法，略作修改。準確移取0.2 mL木瓜蛋白酶液及2.2 mL 1 g/100 mL酪蛋白，在0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液（pH 8.5）中均勻混合，40 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min，立即加入3.6 mL 10%的三氯乙酸溶液。以在木瓜蛋白酶液與酪蛋白底物混合之前加入三氯乙酸作為空白。反應結束后，將混合液于6 570×g離心力下離心20 min，取上清液，測定其280 nm處的吸光度。根據(jù)酪氨酸標準曲線和測定的吸光度，計算反應液中酪氨酸含量。木瓜蛋白酶活力可用1 mL木瓜蛋白酶液在1 min內(nèi)分解酪蛋白后的酪氨酸含量表示，單位為U/mL。

1.3.3 單因素試驗

固定條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、反應初始溫度20 ℃。設定超聲波功率、超聲波時間、游離半光氨酸添加量3個因素，單因素試驗條件：（1）超聲波時間30 min，游離半胱氨酸添加量10 mmol/L，超聲波功率為50，100，150，200和250 W；（2）超聲波功率100 W，游離半胱氨酸添加量10 mmol/L，超聲波時間為10，20，30，40和50 min；（3）超聲波功率100 W，超聲波時間30 min，游離半胱氨酸添加量為5，10，15，20和25 mmol/L。

隨后，徐渭又指出，雖然南戲無宮調(diào)系統(tǒng)，但其曲牌在宋元時期已經(jīng)形成了固定套路的銜接順序：“南曲固無宮調(diào)，然曲之次第，須用聲相鄰以為一套，其間亦自有類輩，不可亂也。如【黃鶯兒】則繼之以【簇御林】，【畫眉序】則繼之以【滴溜子】之類，自有一定之序，作者觀于舊曲而遵之可也。”[14](P241)可見，徐渭倡導從古戲文本中找尋直接線索，以宋元南戲舊篇中的實例來排列、歸納“曲之次第，須用聲相鄰以為一套”[14](P241)的具體順序，完全是重視實證的理性研究路線。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗基礎上，以Box-Behnken中心試驗設計原理，對影響木瓜蛋白酶活力的超聲波功率（A）、超聲波時間（B）和游離半胱氨酸添加量（C）3個因素，使用Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗方案進行優(yōu)化，對擬合方程進行方差分析和顯著性檢驗，各試驗組編碼如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 19.00軟件分別對以上試驗結果進行方差和顯著性分析，Turkey法進行多重比較，Design-Expert 8.0.6進行三因素三水平響應面設計及數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0作圖，在無特殊說明的情況下，所有測試結果一式三份。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲波功率對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波時間和游離半胱氨酸添加量分別為30 min和10 mmol/L時，超聲波功率在50～250 W范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖1所示。隨著超聲波功率的增加，木瓜蛋白酶活力逐漸增強，在100 W時達到最大值。木瓜蛋白酶活力的提高可能是因為超聲波功率的增大加速反應溶液的振蕩，使木瓜蛋白酶與底物的接觸更徹底，其相互作用加強[12]。超聲波功率大于100 W之后，酶活力慢慢降低，但總體趨勢較為平緩，沒有表現(xiàn)出顯著性差異。

圖1 超聲波功率對木瓜蛋白酶活力的影響

2.1.2 超聲波時間對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波功率和游離半胱氨酸添加量分別為100 W和10 mmol/L時，超聲波時間在10～50 min范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖2所示。隨著超聲波時間的延長，木瓜蛋白酶活力變化趨勢總體上呈先增大后減小，超聲波時間對木瓜蛋白酶活力有極顯著影響（P＜0.01）。木瓜蛋白酶活力在30 min時達到最大值，引起該結果的原因可能在于超聲波空化效應產(chǎn)生各種綜合作用，如瞬間高壓、微觀射流和剪切應力等使木瓜蛋白的酶催化活性中心暴露，與作用底物充分結合，導致酶催化活力顯著增強[13]。隨著超聲波時間繼續(xù)延長，水分子裂解，反應溶液中出現(xiàn)大量·OH和·OOH等自由基，酶分子與這些自由基相互作用，導致木瓜蛋白酶空間結構發(fā)生改變，酶活力大幅下降甚至可能失活[14]。

圖2 超聲波時間對木瓜蛋白酶活力的影響

2.1.3 游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波功率和超聲波時間分別為100 W和30 min時，游離半胱氨酸添加量在5～25 mmol/L范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖3所示。隨著游離半胱氨酸添加量的增加，木瓜蛋白酶活力變化趨勢總體上呈先增大后減小，游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力有極顯著影響（P＜0.01）。游離半胱氨酸添加量10 mmol/L時，木瓜蛋白酶活力達到峰值。半胱氨酸是木瓜蛋白酶的激活劑，在多項研究中被證明[15]。游離半胱氨酸激活木瓜蛋白酶的能力與其濃度有直接關系，此現(xiàn)象在早期研究中已表明[16]。10～25 mmol/L時木瓜蛋白酶活力明顯下降的原因可能是過高濃度的游離半胱氨酸會阻礙酶與底物的結合，導致酶活力降低，催化反應速率減慢。

圖3 游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗分析，根據(jù)單因素試驗結果，選擇合適的超聲波功率（A）、超聲波時間（B）和游離半胱氨酸添加量（C）條件進行響應面優(yōu)化試驗，試驗方案和結果如表2所示。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中各項數(shù)據(jù)進行多元擬合，得到方程：Y=34.20+0.090A+0.21B+0.75C+0.027AB-0.083AC-0.16BC-1.23A2-1.38B2-0.73C2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

對該模型進行顯著性檢驗，由表3可知：回歸模型P＜0.01，擬合檢驗顯著；失擬項P=0.576 9＞0.05，失擬檢驗不顯著，因此，該模型可以很好描述各因素對木瓜蛋白酶活力的相互影響，可以使用該模型對試驗進行模擬。決定系數(shù)R2=0.995 7，說明此模型極顯著；校正決定系數(shù)Radj2=0.990 2，表示試驗純誤差不顯著，可以用該模型進行試驗。分析模型中的各項系數(shù)可知：因素B、因素C表現(xiàn)極顯著（P＜0.01）；交互項BC表現(xiàn)顯著（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2表現(xiàn)均極顯著（P＜0.01）。試驗中，因素A、B、C的F值分別為4.51，23.42和313.53，表明對木瓜蛋白酶活力的影響順序為游離半胱氨酸添加量（C）＞超聲波時間（B）＞超聲波功率（A）。

表3 回歸模型及方差分析

2.2.3 響應面分析

圖4是響應值對各因素兩兩交互作用構成的三維曲面圖，對響應面曲面圖和等高線進行對比分析可知，超聲波時間與游離半胱氨酸添加量交互作用的響應面凸起程度大于其他因素的交互作用，表示超聲波時間與游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的交互影響最大。這與表3中的方差分析結果一致（P＜0.05）。

圖4 各因素的響應面及等高線圖

2.2.4 最佳參數(shù)值的確定及驗證

經(jīng)回歸模型分析，得到超聲波協(xié)同半胱氨酸提高木瓜蛋白酶活力的最佳條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、初始處理溫度20 ℃、超聲波功率100.97 W、超聲波時間30.45 min、游離半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此條件下木瓜蛋白酶活力為34.40 U/mL。從試驗的操作性考慮，將各參數(shù)值進行適當?shù)恼{(diào)整，最終確定條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、起始處理溫度20 ℃、超聲波功率100 W、超聲波時間30 min、游離半胱氨酸添加量12 mmol/L，用此條件進行3次平行試驗，最終結果為34.32 U/mL，此結果與模型預估值接近，表明運用響應面法優(yōu)化所得結果合理可靠。

3 結論

試驗探討超聲波及半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響，通過響應面法得到提高木瓜蛋白酶活力的最佳工藝條件并進行驗證。在3個因素中，影響木瓜蛋白酶活力的強弱順序為游離半胱氨酸添加量＞超聲波時間＞超聲波功率。提高木瓜蛋白酶活力的最優(yōu)條件為木瓜蛋白酶用量0.1%，初始處理溫度20 ℃，超聲波功率100.97 W，超聲波時間30.45 min，游離半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此時，木瓜蛋白酶活力為34.40 U/mL。

綜上所述，利用超聲波輔助半胱氨酸可以有效提高木瓜蛋白酶活力，改善木瓜蛋白酶在常溫下酶活力不高的問題。試驗結果為木瓜蛋白酶在肉制品加工中的高效利用提供數(shù)據(jù)支撐。