固相萃取凈化-超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定尿液中百草枯和敵草快殘留

潘勝東, 王 立, 邱巧麗, 何 仟

(1. 寧波市疾病預(yù)防控制中心, 浙江省微量有毒化學(xué)物健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315010; 2. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心, 職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所, 北京 100050)

百草枯(paraquat, PQ)和敵草快(diquat, DQ)同屬快速滅生性除草劑,對(duì)人體毒性極大,臨床致死率高,毒性可累及全身多個(gè)臟器,可導(dǎo)致多器官功能障礙,至今尚無(wú)特效解毒藥[1]。PQ的主要作用靶點(diǎn)為肺部,可使中毒患者肺纖維化,致使患者因缺氧而窒息死亡。目前,我國(guó)雖已禁止PQ的生產(chǎn)與使用,但由于管理難度太大,仍有不法商販在經(jīng)營(yíng)銷(xiāo)售。另一方面,隨著PQ的全面禁用,DQ的市場(chǎng)份額逐年增長(zhǎng),盡管DQ的毒性和致死率不及PQ,但高劑量DQ中毒死亡率仍居高不下。近年來(lái),因自殺、誤服和投毒而引起的PQ和DQ急性中毒事件量呈逐年上升趨勢(shì),已成為我國(guó)最為主要的中毒致死農(nóng)藥之一[2]。因此,開(kāi)展中毒生物樣本中PQ和DQ的快速確證與定量分析具有重要的臨床價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

盡管血漿中PQ和DQ的濃度水平在預(yù)后方面具有更高的預(yù)測(cè)價(jià)值,但血漿樣本中濃度往往較低,檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)會(huì)更加顯著,不利于臨床中毒確證分析。與此同時(shí),PQ和DQ在腎小管中不被重吸收,主要以原形從腎臟排出[3,4],因此中毒病人尿液中PQ和DQ的濃度比較高,開(kāi)展尿液樣品中毒物的檢測(cè)有利于快速準(zhǔn)確評(píng)判毒物種類(lèi)與毒物在體內(nèi)的排泄情況[5]。迄今,中毒生物樣本中PQ和DQ的檢測(cè)方法主要包括毛細(xì)管電泳法(CE)[6]、液相色譜-紫外檢測(cè)法(LC-UV)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[9-11]。其中,CE儀器在實(shí)驗(yàn)室的普及率不高,且該方法存在靈敏度低的缺點(diǎn);LC-UV由于儀器自身的局限性,常常會(huì)提供假陽(yáng)性結(jié)果;GC-MS需要衍生化后方能準(zhǔn)確測(cè)定,操作過(guò)程復(fù)雜、影響因素較多。張秀堯等[12]開(kāi)發(fā)了離子色譜-質(zhì)譜測(cè)定血漿和尿液中PQ和DQ的分析方法,得到了令人滿意的效果,但限于離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的低普及率,難以在普通理化實(shí)驗(yàn)室得到有效開(kāi)展。因此,開(kāi)發(fā)普適性高和操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法顯得尤為重要。因LC-MS具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn),基于LC-MS檢測(cè)中毒生物樣本中有毒有害物質(zhì)的方法越來(lái)越受到關(guān)注。尤其近年來(lái)隨著液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)(LC-HRMS)的高速發(fā)展和儀器的普及,利用精確質(zhì)量數(shù)定性與定量所體現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)為中毒生物樣品中有毒有害物質(zhì)的快速測(cè)定提供了有效的解決方案[9]。尤其對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低和極性較強(qiáng)的PQ和DQ的檢測(cè),LC-HRMS能彌補(bǔ)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定性能力差的不足。此外,由于PQ和DQ強(qiáng)極性的特點(diǎn),傳統(tǒng)的反相色譜柱難以有效保留,需使用七氟丁酸等離子對(duì)試劑提高PQ和DQ在反相色譜柱上的保留能力[13],但離子對(duì)試劑易對(duì)質(zhì)譜儀產(chǎn)生污染,且會(huì)抑制目標(biāo)分析物的質(zhì)譜響應(yīng)。近年來(lái),許多研究者采用親水相互作用色譜柱(HILIC)實(shí)現(xiàn)了PQ和DQ的有效保留[14,15],但大多研究都在流動(dòng)相中加入高濃度的甲酸銨緩沖鹽(可高至250 mmol/L),同樣給質(zhì)譜儀增加了額外的負(fù)擔(dān)。與此同時(shí),在LC-MS檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)干擾效應(yīng)是不可忽視的影響因素,處理不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[16],需要選擇合適的樣品前處理技術(shù)對(duì)中毒生物樣品進(jìn)行有效凈化,進(jìn)而達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定的目的。目前,對(duì)于生物樣品中PQ和DQ的前處理技術(shù)主要包括液液萃取法(LLE)[17]、固相微萃取法(SPME)[18]和固相萃取法(SPE)[11,19]。其中,LLE雖然操作簡(jiǎn)便快速,但該法難以有效消除基質(zhì)效應(yīng);SPME需要額外增加頂空進(jìn)樣系統(tǒng),且該方法吸附容量有限;商品化的SPE小柱種類(lèi)多樣,如C18、HLB、MCX、MAX等,根據(jù)待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),選擇合適的SPE小柱,可滿足大多數(shù)化合物的凈化需求[19]。

本研究選擇臨床致死率高、分子極性大、檢測(cè)難度高的PQ和DQ為研究對(duì)象,通過(guò)不斷優(yōu)化色譜條件,在HILIC模式下,有效降低了流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度(10 mmol/L),并改善了PQ和DQ的色譜峰形,克服了PQ和DQ傳統(tǒng)LC-MS分析方法使用高濃度緩沖鹽的不足,為PQ和DQ提供了全新的檢測(cè)方案。此外,本研究通過(guò)精細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),系統(tǒng)考察了PQ和DQ樣品預(yù)處理過(guò)程中影響檢測(cè)準(zhǔn)確度的主要因素,如濾膜的選擇、進(jìn)樣瓶材質(zhì)的影響、定容液組成和上樣液pH值的影響等,為檢測(cè)人員提供了系統(tǒng)詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與科學(xué)合理的理論闡釋。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters UPLC I Class型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司); Q-Exactive Orbitrap型高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)和Trace Finder 3.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); 12位固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司);超低溫冰箱(浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司)。

乙腈(HPLC級(jí))和甲酸(LC-MS級(jí))均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;甲酸銨(HPLC級(jí))購(gòu)自上海安譜有限公司;百草枯二氯化物和敵草快二溴化物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(pH=4.00)、混合磷酸鹽緩沖液(pH=6.86)和硼酸緩沖液(pH=9.18)均購(gòu)自上海愛(ài)建試劑廠有限公司,臨用前采用250 mL蒸餾水溶解并定容即可;實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Milli-Q超純水儀(法國(guó)Millipore公司)制備; 混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換(MCX)固相萃取柱(60 mg/3 mL)和弱陽(yáng)離子交換(WCX)固相萃取柱(60 mg/3 mL)均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

中毒尿樣和血樣由寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院提供,該中毒病例為23歲男性,于2019年9月5日12時(shí)30分口服敵草快水劑約20 mL,當(dāng)天下午18∶00入院,治療前采集約10 mL尿液樣本于塑料尿杯中,分別于2019年9月5日下午20∶22～9月8日10∶30進(jìn)行5次血液灌流治療,其中第1、2、5次血液灌流治療后以及第5次血液灌流治療后24 h分別采集尿樣?？瞻啄驑佑芍驹刚咛峁?。本研究進(jìn)行的所有程序都符合倫理標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)寧波市疾病預(yù)防控制中心倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)通知書(shū)編號(hào)為201804和202006。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

將采集的尿液樣本采用8 000 r/min離心5 min除去雜質(zhì),收集上清液于10 mL塑料離心管中,置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

準(zhǔn)確移取解凍的尿樣1.0 mL于15 mL聚丙烯離心管中,加入9 mL pH=6.86混合磷酸鹽緩沖液,渦旋混勻30 s。然后將稀釋后的樣品溶液加入經(jīng)3 mL甲醇和3 mL純水活化與平衡過(guò)的WCX固相萃取小柱凈化,依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗,棄去所有淋洗液,之后用5 mL甲酸-乙腈(2∶98, v/v)洗脫,收集洗脫液,于40 ℃氮吹至干,加入1.0 mL乙腈-水(1∶1, v/v)溶解殘?jiān)?經(jīng)0.22 μm疏水性聚四氟乙烯(PTFE)濾膜過(guò)濾后,UPLC-HRMS測(cè)定。

1.2.2色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Syncronis HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:A相,0.25%(v/v)甲酸水溶液(10 mmol/L甲酸銨); B相,乙腈。梯度洗脫:0～2.00 min, 80%B; 2.00～2.50 min, 80%B～20%B; 2.50～5.00 min, 20%B; 5.00～5.01 min, 20%B～80%B; 5.01～8.00 min, 80%B。流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;柱溫40 ℃。

離子源:電噴霧正離子模式(ESI+);離子傳輸管溫度:320 ℃;定量檢測(cè)方式:一級(jí)全掃描-數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)質(zhì)譜掃描模式(Full mass-ddMS2);一級(jí)質(zhì)譜全掃描范圍:m/z100～300;分辨率:全掃描(Full Mass)70 000,二級(jí)質(zhì)譜掃描(MS/MS)17 500;隔離窗口(Isolation window):m/z2.0;電噴霧電壓:3 800 V;鞘氣壓力:275.8 kPa;輔助氣速率:180 L/h;反吹氣壓力:13.8 kPa;輔助氣加熱溫度:200 ℃;射頻棱鏡設(shè)置值(S-lens RF level): 50%。其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 PQ和DQ的分子式、電離形式和定量離子

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg PQ和DQ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成1.0 mg/mL單標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取適量PQ和DQ單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取適量10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用經(jīng)處理的空白尿樣凈化液配制PQ和DQ質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 一級(jí)質(zhì)譜圖解析

圖1 PQ和DQ的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 1 Primary mass spectra of PQ (M1) and DQ (M2)

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

PQ和DQ均為聯(lián)吡啶季銨陽(yáng)離子,特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)給色譜分析與檢測(cè)工作帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn),如普遍存在色譜峰拖尾、峰形寬和色譜保留差等不足。本課題組前期的研究工作采用SIELC Obelisc R色譜柱在等度洗脫條件下分離分析尿液中PQ與DQ[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比Waters ACQUITY UPLC HILIC色譜柱和Dikma Polyamino HILIC色譜柱,采用SIELC Obelisc R色譜柱時(shí)PQ和DQ的色譜峰形更佳。但使用SIELC Obelisc R色譜柱時(shí),水相流動(dòng)相中緩沖鹽甲酸銨的濃度需控制在50 mmol/L以上,對(duì)質(zhì)譜儀不夠友好,易造成噴霧針堵塞;且需要嚴(yán)格調(diào)節(jié)流動(dòng)相溶液pH值至3.7,配制過(guò)程較為繁瑣。此外,采用SIELC Obelisc R色譜柱分析PQ和DQ時(shí),兩種化合物的峰寬仍在1 min以上。鑒于此,本研究工作進(jìn)一步對(duì)色譜柱和流動(dòng)相組分進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用Syncronis HILIC色譜柱分析時(shí),PQ與DQ的色譜峰形對(duì)稱(chēng),峰寬窄(約為0.3 min)(見(jiàn)圖2);且相比前期研究工作需采用高濃度緩沖鹽,本研究將水相中甲酸銨濃度降低至10 mmol/L,并控制甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.25%。因此,經(jīng)優(yōu)化后的流動(dòng)相組分對(duì)UPLC-HRMS儀器更加友好,且流動(dòng)相配制過(guò)程更加簡(jiǎn)單。

圖2 PQ和DQ標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of PQ and DQ standard solutions

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1濾膜的選擇

圖3 不同類(lèi)型濾膜對(duì)PQ和DQ峰面積的影響(n=3)Fig. 3 Effect of different types of filter membrane on the peak areas of PQ and DQ (n=3)PTFE: polytetrafluoroethylene.

濾膜在樣品前處理過(guò)程中起著重要的作用,盡管高速離心能去除大部分固體顆粒,但有時(shí)候膠體狀的雜質(zhì)難以用離心過(guò)程除去,而濾膜能有效消除這些雜質(zhì)的影響。然而,在濾膜使用過(guò)程中必須要考慮對(duì)目標(biāo)化合物有無(wú)吸附作用,即經(jīng)濾膜處理后樣品溶液中目標(biāo)化合物是否會(huì)有損失?；诖?本研究分別考察了標(biāo)準(zhǔn)溶液不過(guò)濾膜以及該標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過(guò)疏水性PTFE濾膜、親水性PTFE濾膜和尼龍濾膜4種方式對(duì)PQ和DQ峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,樣品處理過(guò)程中濾膜的種類(lèi)對(duì)PQ和DQ峰面積有顯著影響,其中經(jīng)親水性PTFE濾膜過(guò)濾后PQ和DQ幾乎已全部被吸附,可能的原因是親水性PTFE濾膜的原材料中含有聚乙二醇等組分[22],即濾膜表面含有的羥基等活性基團(tuán)能吸附樣品溶液中帶正電的PQ和DQ,從而導(dǎo)致PQ和DQ在過(guò)濾過(guò)程中的損失;標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)尼龍濾膜過(guò)濾后,PQ和DQ的峰面積相比未過(guò)膜溶液有了顯著的增加,可能的原因是尼龍濾膜中存在某種能導(dǎo)致PQ和DQ在LC-MS檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)增強(qiáng)的成分;相比而言,疏水性PTFE濾膜對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中PQ和DQ的峰面積沒(méi)有顯著的影響,其峰面積分別為未過(guò)濾膜時(shí)的96.2%和98.2%。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用疏水性PTFE濾膜過(guò)濾樣品溶液。

2.3.2定容液的選擇

在HILIC色譜柱分析待測(cè)化合物時(shí),溶劑效應(yīng)通常會(huì)比較明顯。溶劑效應(yīng)常常體現(xiàn)在色譜保留時(shí)間、色譜峰形和峰面積等方面。在本研究中,分別考察了不同比例乙腈-水溶液對(duì)PQ和DQ分析過(guò)程的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)定容液為純水時(shí),PQ的色譜峰有明顯的前伸現(xiàn)象,由此可知采用純水作為定容液分析PQ不合適。當(dāng)乙腈-水(1∶5, v/v)作為定容液時(shí),前伸現(xiàn)象有了顯著改善,但相比乙腈-水(1∶1, v/v)以及更高比例乙腈-水作為定容液時(shí),PQ的色譜峰對(duì)稱(chēng)性有所欠缺。這一現(xiàn)象在DQ的檢測(cè)過(guò)程中也極其相似?？赡艿脑蚴?HILIC模式下目標(biāo)分析物先被分散至色譜柱固定相周?chē)奈剿畬?然后通過(guò)極性相互作用或靜電相互作用進(jìn)行吸附,但樣品溶液中水的比例過(guò)高會(huì)影響目標(biāo)分析物至吸附水層的分散過(guò)程及后續(xù)的吸附過(guò)程,從而影響色譜峰形。

更為重要的是,定容液組成對(duì)PQ和DQ的峰面積影響更為明顯。當(dāng)純水作為定容液時(shí),PQ和DQ的峰面積較小;當(dāng)乙腈-水(1∶5, v/v)作為定容液時(shí),PQ和DQ的峰面積有了明顯增加;當(dāng)乙腈-水(1∶1, v/v)作為定容液時(shí),PQ和DQ的峰面積達(dá)到最大,進(jìn)一步增加定容液中乙腈的比例,PQ和DQ的峰面積基本保持不變?？紤]到PQ和DQ的水溶性好,定容液中加入適量的水有利于氮吹過(guò)后PQ和DQ的溶解,因此,最終選擇乙腈-水(1∶1, v/v)作為定容液。

圖4 進(jìn)樣瓶材質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of vial material on the stability of target compounds

2.3.3進(jìn)樣瓶材質(zhì)的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),進(jìn)樣瓶可能對(duì)溶液中PQ和DQ有吸附作用,從而影響檢測(cè)結(jié)果。本研究分別選擇了普通玻璃進(jìn)樣瓶和聚丙烯進(jìn)樣瓶,將PQ和DQ的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液裝于兩種材質(zhì)進(jìn)樣瓶中,考察峰面積隨時(shí)間的變化,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,對(duì)于玻璃材質(zhì)進(jìn)樣瓶,經(jīng)6 ℃條件下放置16 h, PQ和DQ分別損失了85.4%和91.0%;放置38 h,兩者分別損失了93.2%和94.7%;繼續(xù)放置60 h, PQ和DQ未見(jiàn)進(jìn)一步損失。對(duì)于聚丙烯材質(zhì)進(jìn)樣瓶,放置60 h時(shí)間內(nèi)PQ和DQ均未見(jiàn)顯著變化。可能的原因是,玻璃材質(zhì)進(jìn)樣瓶表面存在大量Si-OH,很容易與溶液中帶正電荷的PQ和DQ發(fā)生靜電引力作用,從而導(dǎo)致樣品溶液中PQ和DQ被玻璃進(jìn)樣瓶壁吸附而損失。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用聚丙烯材質(zhì)進(jìn)樣瓶。

2.3.4溶液pH值的影響

圖5 樣品溶液pH值對(duì)PQ和DQ凈化性能的影響(n=3)Fig. 5 Effect of solution pH on the purification performance of PQ and DQ (n=3)

由于PQ和DQ表面帶正電荷,按照異種電荷相互吸引的原理,可選擇MCX或WCX固相萃取柱作為凈化柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MCX固相萃取柱在凈化尿液中PQ和DQ時(shí),其加標(biāo)回收率<30%,大部分PQ和DQ難以從MCX小柱上洗脫下來(lái)?？赡艿脑蚴荕CX小柱的填料表面由苯磺酸根修飾,其對(duì)帶正電的PQ和DQ的吸附能力很強(qiáng)。而WCX小柱的吸附填料為羧基功能化高分子材料,其對(duì)PQ和DQ的吸附能力相對(duì)較弱,相比MCX小柱更容易被洗脫下來(lái)。然而,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)尿液樣品的pH值對(duì)凈化性能有顯著影響。本研究對(duì)比了3個(gè)pH緩沖體系下(分別是pH=4.00鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液、pH=6.86混合磷酸鹽緩沖液和pH=9.18硼酸緩沖液)WCX小柱對(duì)尿液加標(biāo)樣品中PQ和DQ凈化性能的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,當(dāng)溶液pH=4.00時(shí),PQ和DQ的峰面積較小;而隨著溶液pH增加,兩者的峰面積增大,且溶液pH=6.86和9.18時(shí)峰面積達(dá)到平臺(tái)值。

可能的原因是,樣品溶液的pH值能改變WCX小柱吸附材料表面羧基官能團(tuán)和待測(cè)化合物官能團(tuán)的解離情況,從而改變其對(duì)溶液中PQ和DQ的吸附行為。然而,PQ和DQ在不同pH條件下均為季銨陽(yáng)離子,因此只需研究不同pH值下WCX吸附材料表面羧基(-COOH)的形態(tài)變化。WCX材料表面羧基的pKa約為4.20。根據(jù)Henderson-Hasselbach方程式[23],對(duì)于弱酸R-COOH,當(dāng)溶液pH

同理,在進(jìn)行PQ和DQ洗脫時(shí),需要調(diào)節(jié)溶液pH≤2.20(即小于pKa值2個(gè)單位以上),此時(shí)WCX材料表面99%羧基呈電中性狀態(tài),靜電引力作用消失,PQ和DQ能順利地從材料表面洗脫下來(lái)。因此,本研究選擇甲酸-乙腈(2∶98, v/v)作為洗脫劑。

2.4 方法驗(yàn)證與確認(rèn)

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別采用空白尿液的前處理液和乙腈-水(1∶1, v/v)配制PQ和DQ質(zhì)量濃度為1.0～200.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定PQ和DQ的峰面積,得到基質(zhì)匹配工作曲線和溶劑工作曲線。根據(jù)公式基質(zhì)效應(yīng)(η值)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率ka-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率kb)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率kb×100%[24-26]計(jì)算,得到PQ和DQ的η值分別為100%和50%。由此可知,PQ和DQ分別為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)和中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng),需要采用基質(zhì)匹配工作曲線進(jìn)行定量分析才能得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

2.4.2線性方程、檢出限和定量限

采用空白尿液的前處理液配制PQ和DQ質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定PQ和DQ峰面積。以峰面積(Y)對(duì)化合物的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,PQ和DQ在1.0～200.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程分別為Y=2.0×106X-2.0×105和Y=3.0×106X+3.0×105,相關(guān)系數(shù)均大于0.998。

在空白尿液樣品中分別加入系列低濃度的PQ和DQ,采用1.2.1節(jié)步驟進(jìn)行樣品前處理,UPLC-HRMS測(cè)定得到信噪比(S/N)≥3和S/N≥10時(shí)的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果表明PQ和DQ的LOD均為0.2 μg/L, LOQ均為0.6 μg/L。

表2 尿液中PQ和DQ的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.4.3加標(biāo)回收率和精密度

分別移取1.0 mL空白尿液樣品,加入適量PQ和DQ的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使樣品中兩者的加標(biāo)濃度分別為1.0、20.0、100.0和200 μg/L,如1.2.1節(jié)步驟進(jìn)行樣品前處理,然后采用UPLC-HRMS檢測(cè),每個(gè)水平平行測(cè)定6次。由表2可知,PQ和DQ的平均加標(biāo)回收率分別為85.8%～101%和80.3%～86.9%,精密度(RSD)分別為0.8%～5.1%和0.9%～4.2%,能滿足實(shí)驗(yàn)室日常中毒檢測(cè)的要求。

2.5 中毒樣品分析

應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)臨床中毒尿液樣品進(jìn)行檢測(cè),其中有1例中毒病例的尿液樣品經(jīng)UPLC-HRMS確證為DQ中毒。本研究跟蹤監(jiān)測(cè)了該病例治療過(guò)程中尿液樣品中DQ的濃度變化。結(jié)果顯示,血液灌流前尿液中DQ含量非常高,為100 mg/L;經(jīng)1次血液灌流后,尿液中DQ含量顯著降低至4.79 mg/L;經(jīng)5次血液灌流治療后,尿液中DQ含量降低至0.17 mg/L,但停止血液灌流24 h后,尿液中DQ含量有所回升,為1.30 mg/L。因此,本研究建立的基于WCX固相萃取-UPLC-HRMS的分析方法可用于臨床中毒病例的確證和治療過(guò)程中濃度的跟蹤監(jiān)測(cè),為臨床精準(zhǔn)治療提供技術(shù)支撐。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)考察了尿液中PQ和DQ檢測(cè)過(guò)程中的各種影響因素,如濾膜的選擇、進(jìn)樣瓶材質(zhì)、定容液組成、上樣液pH值和基質(zhì)效應(yīng)等,建立了基于弱陽(yáng)離子交換固相萃取凈化-超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定尿液樣品中PQ和DQ殘留的分析方法,并將本文建立的方法應(yīng)用于中毒樣品的確證與臨床治療過(guò)程中的濃度監(jiān)測(cè)。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏,適用于臨床中毒樣品的確證分析與濃度檢測(cè)。