虎杖苷抗動脈粥樣硬化機制研究進展

葉根億，姜旭，王振興

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南京 210029)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種影響大中動脈的慢性炎癥性疾病，也是老年人群最常見的致死原因，被認為是心血管疾病發(fā)生最常見的病理生理因素和關鍵環(huán)節(jié)[1-2]。高脂血癥往往會加速As的進程，從而增加心臟病、腦卒中和其他血管疾病的發(fā)生風險。流行病學資料表明，動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的患病率及病死率仍在逐年升高，嚴重影響患者生活質(zhì)量，帶來沉重的社會經(jīng)濟負擔，故As是我國心血管疾病的防治重點之一。既往研究表明，降脂類藥物在As治療中發(fā)揮重要作用，尤其是他汀類藥物可顯著降低低密度脂蛋白膽固醇水平和ASCVD的發(fā)生率。然而，隨著研究的深入，西藥的各種毒性作用被不斷證實[3-4]。因此，在As防治過程中，尋找一種更有效且安全性更高的治療手段具有重要意義。虎杖苷是從中藥虎杖中純化得到的單晶化合物?，F(xiàn)代藥理學研究證實，虎杖苷在心血管系統(tǒng)疾病的防治過程中具有積極作用，尤其在抗As過程中[5]?，F(xiàn)對虎杖苷抗As機制的研究進展予以綜述。

1 抗炎作用

1.1抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路 As的發(fā)病是一個炎癥反應過程，在疾病形成中起決定性作用[6]。炎癥驅(qū)動As并最終引發(fā)血栓斑塊形成，通常會導致心肌梗死、腦卒中和心血管死亡[7]。NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子在免疫和炎癥反應的調(diào)節(jié)中起重要作用。NF-κB通路的激活在炎癥反應中起核心作用，可由促炎細胞因子、黏附分子、趨化因子、生長因子以及與內(nèi)皮細胞結(jié)合的單核細胞誘導。NF-κB是As發(fā)病機制中調(diào)控炎癥和細胞死亡的關鍵因子，參與As發(fā)生的一些功能基因表達[8]。有研究表明，在高脂飲食誘導的As模型中，內(nèi)皮細胞NF-κB活性增強，NF-κB基因缺失減輕了高脂飲食引發(fā)的As，且使用NF-κB抑制劑能夠進一步發(fā)揮對As的保護作用[9]。因此，抑制NF-κB在巨噬細胞中的活化可使泡沫細胞形成減少，從而減輕As的炎癥反應。

Xie等[10]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可明顯抑制鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠和高糖處理大鼠腎小球系膜細胞中NF-κB的激活，且其細胞間黏附因子-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1和纖維連接蛋白的表達降低，表明虎杖苷對糖尿病腎病的抗炎、抗纖維化作用與抑制NF-κB介導的炎癥通路的激活密切相關。對缺血性腦卒中神經(jīng)保護大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可通過降低大腦中動脈閉塞后的氧化性和炎癥性損傷，改善血腦屏障的通透性，從而保護腦損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，上述作用可能通過上調(diào)膠質(zhì)瘤相關癌基因1、Ptch1(patched 1)和超氧化物歧化酶1的表達以及下調(diào)NF-κB的表達實現(xiàn)，故推測NF-κB和Gli1/Ptch1/超氧化物歧化酶1通路可能是虎杖苷治療腦缺血的有效靶點[11]?；⒄溶諏χ妆谒嵴T導的炎癥損傷有潛在的保護作用，可能減少活性氧生成，并抑制Toll樣受體2/NF-κB信號通路[12]。由此可見，虎杖苷在體內(nèi)外均可通過抑制炎癥信號通路起到明顯的抗炎作用，這為抗As治療提供了新思路，由于As炎癥反應并非單一信號通路參與，有助于促進對虎杖苷具體抗炎作用機制的研究。

1.2抑制炎癥因子 促炎細胞因子在As進展中發(fā)揮重要作用，常見炎癥因子包括白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α等。因此，抑制血管內(nèi)皮細胞中細胞因子的產(chǎn)生對As抗感染治療有重要意義。IL-1β主要由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等非免疫細胞分泌。IL-1β通過激活模式識別受體，如Toll樣受體和病原體衍生的產(chǎn)物或受損細胞釋放的炎癥因子[13]，以前體形式被迅速誘導并在細胞中積累。As病變中IL-1β的表達水平明顯升高，且涉及多種細胞類型的促炎癥反應過程，因此IL-1β被視為未來As抗感染治療的潛在靶點。

在脂多糖誘導的急性腎損傷小鼠模型中，虎杖苷可明顯減少脂多糖誘導的IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α分泌，其發(fā)揮抗炎作用的主要機制可能是通過抑制脂多糖誘導的NF-κB活化、增強核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關因子2和血紅素加氧酶1的表達實現(xiàn)[14]?；⒄溶胀ㄟ^抑制炎癥因子的表達減少炎癥因子對相關信號通路的刺激，從而減輕炎癥反應，并進一步促進相關細胞因子抑制劑在抗As中的基礎研究和開發(fā)。

2 抗氧化應激作用

在正常代謝或受到各種有害刺激時，機體發(fā)生氧化應激，產(chǎn)生活性氧、活性氮等高活性分子。當上述高活性分子產(chǎn)生的速度超過其清除速度時，人體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致組織損傷。氧化應激在As發(fā)展中起著不可忽視的作用，尤其是針對低密度脂蛋白的低氧化修飾(如產(chǎn)生氧化型低密度脂蛋白)。還原型輔酶Ⅱ氧化酶是活性氧的主要來源，廣泛表達于免疫系統(tǒng)的吞噬細胞和許多非吞噬細胞(血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞等)[15-16]。

2.1保護血管內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮功能障礙是As發(fā)展的早期關鍵步驟，是As發(fā)展的起始階段，與斑塊形成密切相關。此外，內(nèi)皮功能狀態(tài)可潛在反映主動脈As的發(fā)生傾向。氧化型低密度脂蛋白是As內(nèi)皮功能障礙的主要參與者，它的形成由血脂水平升高和氧化應激誘發(fā)，并可沉積在血管內(nèi)皮[17]。Qiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可通過提高細胞活力及其黏附和遷移能力調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化劑和抗氧化劑的平衡，并通過抑制細胞凋亡降低人臍靜脈內(nèi)皮細胞對過氧化氫誘導的氧化應激損傷的影響，其機制可能是虎杖苷通過蛋白激酶C依賴途徑對過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)揮抗氧化應激作用?？梢?，虎杖苷對血管內(nèi)皮細胞的保護作用可通過不同的方式和途徑實現(xiàn)，進一步體現(xiàn)天然藥物的獨特優(yōu)勢，并可促進更多天然藥物的基礎研發(fā)。

2.2保護血管平滑肌細胞 氧化應激可促進血管平滑肌細胞的增殖并誘導血管重構(gòu)，從而參與As的發(fā)病。因此，抑制血管平滑肌細胞的增殖可能成為未來治療As的一種新策略。既往研究表明，虎杖苷可通過降低氧化應激、抑制細胞間黏附分子-1表達、減弱白細胞-內(nèi)皮細胞黏附來保護心肌功能免受急性損傷。

基于氧化應激介導的血管平滑肌細胞增殖有助于斑塊的形成和As的進展，虎杖苷可通過抗氧化應激保護血管平滑肌。在過氧化氫誘導的血管平滑肌細胞氧化損傷過程中，虎杖苷可通過提高超氧化物歧化酶水平、降低活性氧水平、抑制細胞增殖、上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1表達，改善氧化應激引起的相關變化，證實虎杖苷通過靶向內(nèi)皮型一氧化氮合酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1通路發(fā)揮抗氧化作用[19]。但氧化應激導致血管平滑肌增殖的具體機制以及虎杖苷保護血管平滑肌的具體機制仍需深入研究。

2.3保護線粒體 線粒體在細胞的營養(yǎng)能量代謝以及生理功能中發(fā)揮重要作用，是細胞中活性氧的主要來源。正常生理情況下，活性氧是許多細胞活動(自噬、抗微生物作用、細胞分化、凋亡等)的組成部分。一些危險因素(高脂血癥、糖尿病、高血壓、炎癥等)均可導致線粒體損傷，引發(fā)活性氧過量產(chǎn)生，從而超過抗氧化劑的防御作用，導致氧化應激發(fā)生，促進As進展[20]?；⒄溶諏€粒體有保護作用，為虎杖苷抗As的研究提供了新方向。研究顯示，可通過活性氧生成、線粒體膜電位損傷、線粒體形態(tài)變化等評估線粒體功能[21]。白黎蘆醇可改善載脂蛋白(apolipoprotein，Apo)E基因敲除(ApoE-/-)小鼠的內(nèi)皮細胞線粒體功能障礙，從而減輕As[22]。進一步研究氧化應激對內(nèi)皮細胞線粒體功能損傷的具體機制，將為線粒體功能的藥物針對性干預提供有力依據(jù)，且更利于研究虎杖苷相關線粒體保護的潛在靶點。

其實趙三完全不能明白，因為他還不曾聽說什么叫做革命軍，他無由得到安慰，他的大手掌快樂地不停地捋著胡子。對于趙三，這完全和十年前組織“鐮刀會”同樣興致，也是暗室，也是靜悄悄地講話。

虎杖苷具有廣泛的抗氧化應激作用，主要表現(xiàn)為對血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及線粒體的保護，但其具體機制目前仍不清楚。越來越多研究證實，虎杖苷可延緩As進展，從而有效降低ASCVD的發(fā)生風險。

3 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝

血脂異常是As發(fā)生的首要原因之一，且高水平的總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇與冠心病的發(fā)病率和病死率呈明顯正相關，降低循環(huán)中低密度脂蛋白膽固醇水平可明顯降低ASCVD的發(fā)生率和病死率[23]。冠心病的主要危險因素包括血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平的升高以及高密度脂蛋白膽固醇水平的降低。因此，通過靶向治療調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是目前治療ASCVD最有前景的策略[24-25]?，F(xiàn)代西藥雖然有較好的降脂作用，但其嚴重不良反應較多，且一些新型降脂藥物價格昂貴，限制了其臨床應用?；⒄溶兆鳛橐环N天然藥物，與西藥相比，具有不良反應較少等特點，其在血脂調(diào)節(jié)中的作用逐漸受到心腦血管疾病基礎研究領域的關注[5]。

3.1抑制膽固醇代謝相關基因 前B細胞集落增強因子(pre-B-cell colony-enhancing factor，PBEF)優(yōu)先在人和動物的內(nèi)臟脂肪中表達。人血漿PBEF水平與內(nèi)臟脂肪含量密切相關。既往研究證實，PBEF參與了葡萄糖與血脂的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[26]，可影響脂質(zhì)沉積與炎癥反應，并參與As發(fā)病。

對ApoE-/-小鼠的研究表明，虎杖苷可顯著抑制細胞因子的分泌和膽固醇代謝相關基因的表達，并可下調(diào)PBEF基因和蛋白水平[27]。體外細胞實驗證實，虎杖苷可保護經(jīng)氧化型低密度脂蛋白處理的RAW264.7細胞，并抑制巨噬細胞攝取膽固醇；對PBEF-干擾小RNA的研究表明，虎杖苷可調(diào)節(jié)巨噬細胞攝取膽固醇，并部分下調(diào)PBEF；虎杖苷主要通過下調(diào)PBEF以及抑制PBEF誘導的巨噬細胞膽固醇沉積，減輕ApoE-/-小鼠As損傷[27]。由此可見，虎杖苷可通過抑制膽固醇代謝相關基因降低膽固醇水平，從而維持血脂水平的穩(wěn)定，延緩As發(fā)展?；⒄溶站哂幸种颇懝檀即xPBEF基因的獨特優(yōu)勢，但其對膽固醇代謝途徑中相關酶學基因的抑制作用仍需要進一步研究。

3.2促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運 膽固醇逆向轉(zhuǎn)運指外周組織細胞(包括As斑塊中的泡沫細胞)中的膽固醇進入循環(huán)，并隨糞便排出[28]。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運不僅是膽固醇的一種代謝途徑，也是As進程中潛在的重要防御機制之一，故可通過干預膽固醇逆向轉(zhuǎn)運維持穩(wěn)定的膽固醇水平。

Peng等[29]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可降低高脂ApoE-/-小鼠的血脂水平，減輕As和肝臟脂肪變性?；⒄溶胀ㄟ^刺激巨噬細胞內(nèi)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)A1、ABCG1和B類Ⅰ型清道夫受體促進膽固醇外排，提高血清高密度脂蛋白膽固醇和ApoAⅠ水平，促進B類Ⅰ型清道夫受體介導的肝臟對膽固醇的攝取，從而促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運?；⒄溶者€可以通過ABCG5/ABCG8增加膽固醇向膽汁的分泌，并能通過膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)通路改善膽固醇代謝，從而促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運。高膽固醇血癥可加速As的發(fā)生，而膽固醇逆向轉(zhuǎn)運有助于降低高膽固醇血癥的發(fā)生率。

4 抗血小板聚集和血栓形成

血液是紅細胞、白細胞、血小板和蛋白質(zhì)大分子在血漿中的濃縮懸浮體。在上述血液元素中，血小板是正常止血和病理性血栓形成的關鍵成分[31]。在生理情況下，血小板通常不會黏附或激活完整的、未激活的內(nèi)皮細胞。但在As早期階段，炎癥導致內(nèi)皮激活，進而可能刺激血小板附著[32]。血小板附著于不完整的內(nèi)皮細胞上并參與As的進展，在As斑塊侵蝕或破裂的血栓形成中起關鍵作用[33]。因此，天然藥物可能是目前避免內(nèi)皮細胞受損引發(fā)血栓形成的一種較理想的選擇，既可用于ASCVD的治療，又可避免發(fā)生藥物相關不良反應。

4.1抑制花生四烯酸誘導的血小板聚集 在血栓形成過程中，血小板可促進凝血反應，血小板中可溶性磷脂酶A2激活后可釋放花生四烯酸，其可被環(huán)加氧酶和脂合酶代謝，最終形成血栓烷A2、前列腺素D2和前列腺素E2，這些物質(zhì)可激活血小板并促進血小板聚集。血栓烷A2是一種成熟的血小板聚集刺激劑，而前列腺素D2可觸發(fā)環(huán)腺苷酸的形成，這是刺激血小板抑制的主要途徑之一[34]。因此，花生四烯酸參與了血小板聚集及血栓形成的凝血反應過程。陳鵬等[35]分別采用電刺激頸動脈、花生四烯酸靜脈注射、結(jié)扎下腔靜脈的方法促使實驗大鼠形成動靜脈血栓，經(jīng)虎杖苷藥物處理后，大鼠動靜脈血栓明顯減輕，提示虎杖苷具有較強的抗微血栓形成作用，其機制可能與抑制花生四烯酸誘導的血小板聚集有關。另有研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞與血小板之間的相互作用參與了血栓形成，虎杖苷的抗血栓形成作用可能也抑制了血小板-中性粒細胞間的相互作用[36]。可見，虎杖苷可通過抗血小板聚集延緩As的發(fā)展。

4.2抑制Ca2+釋放及其向血小板內(nèi)流 細胞內(nèi)Ca2+水平的變化是調(diào)節(jié)各種細胞功能的關鍵信號之一。細胞內(nèi)Ca2+水平升高導致血小板聚集，形成血栓。因此，可以嘗試通過降低細胞內(nèi)Ca2+水平，進一步抵抗血小板的聚集。虎杖苷是白黎蘆醇前體，而白黎蘆醇可通過保護纖維蛋白原抑制血小板聚集[37]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過減少儲存的Ca2+釋放和抑制儲存的Ca2+流入血小板來抑制凝血酶誘導血小板聚集[38]。Ca2+水平變化與血小板聚集及血栓形成有關，故加強對影響Ca2+吸收與釋放藥物的研發(fā)，可抑制血小板聚集和血栓形成，從而減少心血管事件的發(fā)生。

在細胞分子水平上，虎杖苷治療As的過程具有明顯的抗血小板聚集和抗血栓形成作用，且副作用少、可多靶點起效。中醫(yī)認為，中藥虎杖具有活血通淋功效?，F(xiàn)代西藥的抗血小板聚集和抗血栓形成的作用明顯，但可能引發(fā)特殊群體(瘦弱老年患者)的消化道出血。

5 調(diào)控靶向前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9/LDLR的表達

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一種絲氨酸蛋白，通過LDLR參與調(diào)節(jié)肝臟Apo攝取和膽固醇代謝[39-40]。血漿低密度脂蛋白膽固醇主要通過LDLR途徑清除。與LDLR結(jié)合后的低密度脂蛋白內(nèi)化到網(wǎng)格蛋白涂層的凹坑中，隨后發(fā)生溶酶體降解[41]。PCSK9通過干擾LDLR的正常循環(huán)，降低細胞表面受體密度，導致血漿低密度脂蛋白水平升高。抑制PCSK9蛋白表達是基于PCSK9的新型治療方法，可減少ASCVD的發(fā)生，同時增加肝臟LDLR數(shù)量，從而進一步消耗循環(huán)中的低密度脂蛋白[42]。PCSK9/LDLR的相互作用目前被認為是治療高膽固醇血癥的重要靶點。近年來，中草藥被廣泛應用于高膽固醇血癥的治療，一些天然產(chǎn)物通過調(diào)控PCSK9的轉(zhuǎn)錄和表達發(fā)揮降低膽固醇的作用[43]。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿、姜黃素、虎杖苷等天然藥物可通過降低低密度脂蛋白水平調(diào)節(jié)PCSK9的表達[44]。

在胰島素抵抗的HepG2細胞中，虎杖苷可明顯上調(diào)LDLR和葡萄糖激酶水平，同時抑制PCSK9的表達，還可抑制PCSK9與LDLR的結(jié)合。分子對接實驗發(fā)現(xiàn)，虎杖苷與PCSK9晶體結(jié)構(gòu)之間形成穩(wěn)定的氫鍵，表明與虎杖苷結(jié)合后的PCSK9構(gòu)象改變，PCSK9與LDLR的相互作用以及LDLR的降解被阻斷[45]?；⒄溶諏CSK9的表達及其與LDLR的結(jié)合有明顯抑制作用，可進一步降低血脂，發(fā)揮抗As作用。目前關于虎杖苷對PCSK9表達影響的研究相對較少，且虎杖苷對LDLR水平的影響缺乏大量實驗研究的驗證。因此，進一步研究虎杖苷及其類似天然藥物對PCSK9和LDLR的影響將為臨床As患者的降脂治療提供更多選擇。

6 小 結(jié)

虎杖苷在抗As過程中發(fā)揮積極作用，可通過抑制炎癥信號通路和炎癥因子以及抗血小板聚集、抗血栓形成、調(diào)控靶向PCSK-9/LDLR的表達與功能；此外，虎杖苷可通過抗氧化應激維持細胞內(nèi)氧化劑與抗氧化劑之間的動態(tài)平衡，并通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝降低血脂水平。As的發(fā)病機制比較復雜，且具體機制仍不明確。西藥治療As的機制明確，療效單一，且不良反應多；隨著研究的深入，中藥抗As的優(yōu)勢逐漸凸顯。以中醫(yī)理論指導用藥，中藥通過多靶點、多途徑發(fā)揮抗As作用。近年來，腸道菌群與心血管疾病之間的關系備受關注，尤其是腸道菌群與As的關系，而虎杖苷能否通過影響腸道菌群發(fā)揮抗As作用將是未來研究的重點。